Methodenartikel

"Lever-on-a-Chip" culturen van primaire hepatocyten en Kupffer cellen voor Hepatitis B-virusinfectie

13.5K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/58333

⸱

19 februari 2019

 ,  ,  ,  ,  , 
1Section of Virology, Department of Medicine, Imperial College

In dit artikel

Samenvatting

Het doel van dit protocol is bedoeld als een stapsgewijze handleiding om uit te voeren van de experimenten van de 3-D "lever-on-a-chip" infectie met het hepatitis B-virus.

Samenvatting

Ondanks de uitzonderlijke infectiviteit van het hepatitis B-virus (HBV) in vivo, waar slechts drie virale genoom in een chroniciteit van experimenteel geïnfecteerde chimpansees resulteren kunnen, vereisen meest in vitro modellen verschillende honderden tot duizenden virale genoom per cel in om te beginnen een voorbijgaande infectie. Bovendien kunnen statische 2D culturen van primaire menselijke hepatocyten (PHH) alleen op korte termijn studies als gevolg van hun snelle dedifferentiation. Hier beschrijven we 3D lever-on-a-chip culturen van PHH, monoculturen of in cocultures met andere cellen van de lever-ingezetene nonparenchymal. Deze bieden een significante verbetering aan het bestuderen van langdurige HBV infecties met fysiologische host cel reacties. Naast het vergemakkelijken van de drug werkzaamheid studies, toxicologische analyse en onderzoek naar pathogenese, inschakelen deze microfluidic cultuur systemen de evaluatie van genezende therapieën voor HBV-infectie ter opheffing van covalent gesloten, circulaire (ccc) DNA. Dit gepresenteerd methode beschrijft de set-up van PHH monoculturen en co celculturen PHH/Kupffer, hun infectie met gezuiverde HBV en de analyse van de antwoorden van de gastheer. Deze methode geldt met name voor de evaluatie van de effecten op lange termijn van HBV-infectie behandeling combinaties en pathogenese.

Inleiding

De studie van HBV is door de slechte gevoeligheid van cultuur systemen, waarvoor honderden tot duizenden HBV genoom kopieën per cel tot de infectie1is ingewikkeld. Bovendien, primaire menselijke hepatocyten zijn over het algemeen bijzonder kwetsbaar en snel dedifferentiate tijdens conventionele culturen2. Dit is voornamelijk te wijten aan het feit dat de vlakke en harde kunststof oppervlakken niet na te de natuurlijke extracellulaire omgevingen binnen de lever en het algemene gebrek aan oxygenatie van de culturen in de afwezigheid van microfluidic circulatie gevonden bootsen doen. Conventionele statische hepatocyte culturen op collageen beklede platen snel dedifferentiate en verliezen hun gevoeligheid voor HBV-infectie3. Hier beschrijven we de set-up en besmetting van PHH gegroeid in 3D lever-on-a-chip culturen, die enorm voordelig voorbij conventionele 2D statische PHH culturen op collageen beklede platen als gevolg van hun uitgebreide metabole en functionele bevoegdheid zijn, te vergemakkelijken op lange termijn culturen van ten minste 40 dagen4. In dit systeem worden PHH overgeënt op collageen beklede steigers, die voortdurend zijn geperfundeerd met groeimedium voor de levering van zuurstof en voedingsstoffen naar de cellen. Hoewel alternatieve cultuur systemen voor PHH gebaseerd op complexe cocultures van lymfkliertest fibroblasten of 3D groei in spheroïden zijn gevalideerd en vatbaar zijn voor HBV-infectie met behulp van multipliciteit van infectie van 500 genoom equivalenten (GE) van HBV per cel, 3D lever-on-a-chip culturen blijven de enige in vitro modelsysteem die vatbaar zijn voor 0.05 GE van HBV per cel4. Dit wordt bovendien ondersteund door de noodzaak van het gebruik van hoge concentraties van dimethylsulfoxide (DMSO) en polyethyleenglycol (PEG) om vast te stellen van de HBV-infectie in deze culturen, die is overbodig voor de infectie van 3D lever-on-a-chip cultuur systemen 4. onder de belangrijke kenmerken van HBV-infectie is het zwembad van cccDNA, die als de transcriptionele sjabloon voor alle de novo-geproduceerd virionen5,6 fungeert. Hoewel cccDNA kan worden opgespoord in conventionele hepatocyte culturen7,8, het blijft onduidelijk of de regulering van cccDNA en eventuele therapeutische benaderingen, gericht op de afschaffing zijn gerecapituleerd gedeeltelijk of volledig dedifferentiated hepatocyten. We hebben aangetoond dat cccDNA functioneel wordt gevormd in 3D lever-on-a-chip culturen, reageert op fysiologische stimuli, en kan worden gericht door te interfereren met de toegankelijkheid van de transcriptionele machine de cccDNA genoom4.

Host-Reacties op HBV-infectie in 3D lever-on-a-chip mimic die bij HBV-geïnfecteerde patiënten waargenomen, zodat de identificatie van biomarkers voor infectie, evenals therapeutisch succes. Onder de unieke kenmerken van de culturen van de lever-on-a-chip is de mogelijkheid om op lange termijn host reacties tussen PHH en andere cellen van de nonparenchymal binnen de lever, met inbegrip van Kupffer cellen4Notti cellen9en lever sinusvormige evalueren endotheliale cellen10,11. Dit biedt de unieke kans om te evalueren van de cel/interacties in een complexe 3D communicatie.

De periode van de uitgebreide cultuur van dit platform vergemakkelijkt bovendien de beoordeling van de sequentiële drug behandelingen en hun impact op HBV persistentie, die niet mogelijk met behulp van conventionele hepatocyte cultuur systemen.

Dit protocol beschrijft hoe 3D-lever-on-a-chip culturen worden gegenereerd, monocultuur van PHH of voor cocultures van PHH met Kupffer cellen. Daarnaast beschrijven we de productie van gezuiverde HBV voor lage-multipliciteit-van-infectie studies, evenals de daaropvolgende analyse van host en virale reacties.

Protocol

1. assemblage- en evenwichtsinstelling van platen

  1. Zorg ervoor dat zowel de compressor en de leegte pomp die is gekoppeld aan het LiverChip platform zijn ingeschakeld. De vergadering en de evenwichtsinstelling van de platen in een klasse II kabinet uitvoeren.
  2. Aseptisch de microfluidic platen te monteren door het plaatsen van een steriele membraan tussen de plaat-base en de goed met bovenplaat (Figuur 1a) toe te voegen.
  3. Zorg ervoor dat het steriele membraan soepel op de twee pinnen van de grondplaat, sinds ongelijke membraan plaatsing compromissen de circulatie van microfluidic berust.
  4. Voeg een steriele plaat deksel en draai de schroeven aan de voet van de plaat met behulp van een geautomatiseerde precisie koppel aan 33 lb met behulp van een spiraal aanscherping van de reeks. Zorg ervoor dat alle schroeven aan 35 lb met behulp van een handmatige koppel zijn aangescherpt. Tijdens deze stap, waarborgen de schroeven zijn symmetrisch aangescherpt (Figuur 1a).
  5. Prewarm hepatocyte seeding middellange met Williams E medium, primaire hepatocyte ontdooien en supplementen, 5% foetale runderserum (FBS) en 1 µM dexamethason tot 37 ° C vóór priming plating.
  6. Prime de volledig geassembleerde plaat door binnen het wassen dock plaatsen en het toevoegen van 400 µL van hepatocyte zaaien middellange tot het reservoir kant van elk putje. Zorg ervoor dat de plaat springt het wassen dock volledig.
  7. Initiëren stroming in de opwaartse richting van 3,5 min 1 µL/s. De succesvolle functie van het microfluidic verkeer kan worden nagegaan door de rode lampjes aan de zijkant van de plaat (Figuur 1a).
  8. Zodra het medium wordt gepompt naar de cel groei kant van de plaat, zorgen voor de juiste montage van de stroom kanaal, voeg een extra 1.2 mL hepatocyte zaaien medium.
  9. Zorgvuldig Breng de plaat in het docking station binnen een bevochtigde incubator bij 37 ° C en 5% CO2 en initiëren van stroming in de opwaartse richting op een debiet van 1 µL/s voor 16 h (Figuur 1 c).
  10. Overdracht van de plaat aan het wassen-dock en elimineren van bubbels in de put door pipetteren zachtjes op en neer.
  11. Voeg een steriele, ronde filtreerpapier, gevolgd door een cel bijlage steiger en een Borgring, aan elk putje met steriel pincet. Elk putje met een steriele zuiger ingedrukt te vergrendelen van de behoudende ringen en steigers vastklikt (Figuur 1b).
  12. Gecombineerd alle middellange en Voeg 400 µL voorverwarmde hepatocyte seeding medium zachtjes over de steiger en initiëren van stroom in de neerwaartse richting voor 3,5 min 1 µL/s.
  13. Aspirate alle medium uit het reservoir kant van de plaat gepompt. Deze stap is noodzakelijk ter vervanging van het medium opgenomen in het kanaal van de stroom.
  14. Voeg 1,4 mL hepatocyte zaaien medium aan elk putje voordat hij terugkeerde van de plaat naar het dock te voltooien van het totale volume per putje. Het volume per putje is nu 1.6 mL (1,4 mL in de put en 0,2 mL in het stroom-kanaal).

2. ontdooien en zaaien van hepatocyten voor monoculturen

  1. Prewarm hepatocyte ontdooien medium en hepatocyte seeding middellange tot 37 ° C vóór het ontdooien van een flacon van PHH volgens de instructies van de leverancier. Gebruik een centrifuge bij kamertemperatuur tijdens deze stap te voorkomen abrupte temperatuurveranderingen. Het uitvoeren van het ontdooien en verzorgt de seeding van de hepatocyten in een klasse II kabinet.
  2. Resuspendeer de cellen in 1 mL hepatocyte seeding voedingsbodem en met behulp van trypan blauwe cellen tellen. Ervoor zorgen dat de levensvatbaarheid van de cellen boven de 90%.
  3. Houd de cellen op ijs totdat ze worden toegevoegd aan de putten.
  4. Breng de geëquilibreerd en volledig geassembleerd plaat aan het wassen-dock en gecombineerd alle medium uit de putten.
  5. 600.000 hepatocyten toevoegen aan elk putje in een 500 µL volume hepatocyte seeding medium.
  6. Initiëren van stroming in de neerwaartse richting op een debiet van 1 µL/s en zodat het totale volume in de put tot 1,6 mL door 900 µL van hepatocyte zaaien medium toe te voegen.
  7. Breng de plaat naar het docking station binnen een bevochtigde incubator bij 37 ° C en met 5% CO2.
  8. Stroom in de neerwaartse richting op een debiet van 1 µL/s voor 8u, gevolgd door een omkering van de stroom naar de opwaartse richting op een debiet van 1 µL/s voor 8u initiëren.
  9. Breng de plaat aan het wassen-dock en gecombineerd alle medium uit de putten.
  10. Voeg 400 µL van hepatocyte onderhoud medium (Williams E medium aangevuld met hepatocyte onderhoud supplementen en 100 nM dexamethason) voor elke stroomsnelheid van het goed en starten in de neerwaartse richting op een debiet van 1 µL/s voor 3,5 min.
  11. Gecombineerd alle medium uit het reservoir en voeg 1,4 mL van hepatocyte onderhoud medium (Figuur 1 d).
  12. Vervang het medium met hepatocyte onderhoud medium elke 48 uur. Uitvoeren om ervoor te zorgen dat alle medium in de put wordt vervangen, een wassen stap vóór de toevoeging van verse hepatocyte onderhoud medium.
  13. Voor het wassen stap, overdracht van de plaat aan het wassen dock gecombineerd alle medium uit de putten en Voeg 400 µL van onderhoud medium.
  14. Initiëren stroming in de neerwaartse richting bij 1 µL/s voor 3,5 min. Aspirate alle medium verschijnen aan de kant van het reservoir van de putten.
  15. Voeg 1,4 mL van hepatocyte onderhoud medium en, binnen een bevochtigde incubator bij 37 ° C en met 5% CO2, breng de plaat in het dockingstation en initiëren van stroming in de opwaartse richting op een debiet van 1 µL/s voor 48 h (Figuur 1f).
    Opmerking: Voor hepatocyte monoculturen gebruikt als besturingselementen voor cocultures, met het oog op een gecontroleerde omstandigheden, wordt een tweede soort onderhoud medium gebruikt, die is specifiek voor gebruik in de cocultures met primaire menselijke cellen van de Kupffer. 48 uur na het vervangen van de hepatocyte zaaien medium met hepatocyte onderhoud medium (dag 3 na zaaien), het regelmatige hepatocyte onderhoud medium zal worden vervangen met coculture onderhoud medium II, met name in monoculturen van PHH wanneer het vergelijken bij cocultures van zowel PHH en Kupffer cellen, als de middellange onderdelen enigszins verschillen.

3. ontdooien en zaaien van Kupffer cellen en hepatocyten voor co culturen

  1. Met het oog op een nauwkeurige vergelijking van resultaten, vergelijken altijd PHH/Kupffer cel cocultures aan PHH monoculturen
  2. Cocultures PHH en Kupffer cellen, ontdooien één flacon van Kupffer cellen in geavanceerde Dulbecco van Eagle's medium (AdDMEM) zonder dexamethason gewijzigd maar aangevuld met primaire hepatocyte ontdooien en beplating supplementen (coculture zaaien medium) volgens de leveranciersverklaring instructies. Het ontdooien en het zaaien van de cellen van de Kupffer en de hepatocyten in een klasse II kabinet uitvoeren.
  3. Resuspendeer de cellen in 1 mL coculture zaaien medium en met behulp van trypan blauwe cellen tellen. Ervoor zorgen dat de levensvatbaarheid van de cellen boven de 90%.
  4. Houden van de cellen op het ijs voorafgaand aan deze toe te voegen aan de putjes om te voorkomen dat cel adhesie.
  5. Volg de instructies in stappen 2.1-2.3 voor het ontdooien van primaire menselijke hepatocyten.
  6. Breng de geëquilibreerd en volledig geassembleerd plaat aan het wassen-dock en gecombineerd alle medium uit de putten.
  7. 60.000 Kupffer cellen en/of 600.000 hepatocyten toevoegen aan elk putje in een totaal volume van 250 µL van coculture zaaien medium.
  8. Initiëren van stroming in de neerwaartse richting op een debiet van 1 µL/s en voeg 900 µL van coculture zaaien medium aan elk putje.
  9. Breng de plaat in het docking station binnen een bevochtigde incubator bij 37 ° C en met 5% CO2.
  10. Stroom in de neerwaartse richting op een debiet van 1 µL/s voor 8u, gevolgd door de omkering van de stroom naar de opwaartse richting op een debiet van 1 µL/s voor 8u initiëren.
  11. Breng de plaat aan het wassen-dock en gecombineerd alle medium uit de putten.
  12. Voeg 400 µL van coculture onderhoud medium I (AdDMEM zonder dexamethason maar aangevuld met hepatocyte onderhoud supplementen) bij elke stroomsnelheid van het goed en starten in de neerwaartse richting op een debiet van 1 µL/s voor 3,5 min.
  13. Alle medium uit het reservoir kant gecombineerd en voeg 1,4 mL van coculture onderhoud medium ik aan elk putje.
  14. Breng de plaat in het docking station binnen een bevochtigde incubator bij 37 ° C en met 5% CO2 en initiëren van stroming in de opwaartse richting op een debiet van 1 µL/s voor 48 uur.
  15. Breng de plaat aan het wassen-dock en gecombineerd alle medium uit de putten. Voeg 400 µL van coculture onderhoud medium II (Williams E medium zonder dexamethason maar aangevuld met 100 nM hydrocortison en hepatocyte onderhoud supplementen) en initiëren van stroming in de neerwaartse richting bij 1 µL/s voor 3,5 min.
  16. Gecombineerd alle medium verschijnen aan de kant van het reservoir van de putten.
  17. Voeg 1,4 mL van coculture onderhoud medium II en breng de plaat in het docking station binnen een bevochtigde incubator bij 37 ° C en met 5% CO2.
  18. Stroom in de opwaartse richting op een debiet van 1 µL/s voor 48 h (Figuur 1e) starten.
  19. Vervang het medium elke 48 h met coculture onderhoud medium II. Uitvoeren om ervoor te zorgen dat alle medium in de put wordt vervangen, een wassen stap vóór de toevoeging van verse medium.
  20. Om te wassen, overdracht van de plaat aan het wassen dock gecombineerd alle medium uit de putten en Voeg 400 µL van coculture onderhoud medium II.
  21. Initiëren stroming in de neerwaartse richting bij 1 µL/s voor 3,5 min. Aspirate alle medium verschijnen aan de kant van het reservoir van de putten.
  22. Voeg 1,4 mL van coculture onderhoud medium II en breng de plaat in het docking station binnen een bevochtigde incubator bij 37 ° C en met 5% CO2en stroom in de opwaartse richting op een debiet van 1 µL/s voor 48 h (Figuur 1f) starten.

4. productie van een infectueus Hepatitis B-Virus voor infectie Studies

  1. Dit gedeelte van het protocol in een beheersingsniveau III lab uitvoeren. Doen de zaaien, middellange wijzigingen middellange collectie en virus concentratie in een klasse II kabinet.
  2. Cultuur van HBV-producerende cellen (bijv. HepDE19, HepAD38) in collageen beklede T1000 5-laags kolven in 120 mL volledige DMEM/F12 (10% FBS, penicilline/steptomycin, niet-essentiële aminozuren, 500 μg/mL G418 en 1 μg/mL tetracycline) totdat ze 90% confluentie bereiken.
  3. Te wijzigen in het medium inductie normaal (volledige DMEM zonder tetracycline) om de productie van HBV.
  4. De volledige Mediuminhoud elke 48 uur voor 12 dagen na intrekking van tetracycline verzamelen en op te slaan bij 4 ° C.
  5. Het verzamelde medium wordt gefiltreerd door een 0,45 µm fles top filter.
  6. Incubeer bij 4 ° C voor 16 h. Centrifuge bij 10.000 x g gedurende 1 uur bij 4 ° C voor het verzamelen van het virus van PEG-neergeslagen en resuspendeer, steriele PEG 8000 in-fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) toevoegen aan de verzamelde middellange tot een eindconcentratie van 4% w/w en meng door het omkeren van de 8 x-10 x de pellet in PBS met 10% FBS.
  7. Combineer het virus PEG-neergeslagen uit alle oogsten tijdstippen en laag het bovenop een 20% sacharose kussen. Centrifugeer bij 140.000 x g gedurende 16 uur bij 4 ° C met een SW28 rotor.
  8. Gecombineerd het supernatant en resuspendeer de pellet in PBS aangevuld met 10% FBS, en aliquot en opslaan bij-80 ° C.
  9. Bepaal de HBV DNA exemplaaraantal aanwezig in het supernatant door HBV DNA qPCR (stap 6).

5. infectie van 3D culturen met HBV

  1. Infecties in een klasse II kabinet binnen een beheersingsniveau III lab uitvoeren.
  2. 3 dagen na het zaaien de monoculturen of cocultures, het vereiste aantal HBV-bevattende aliquots bij kamertemperatuur ontdooien en Verdun de dosis vereist virus in 1.8 mL hepatocyte onderhoud medium of coculture onderhoud medium II per putje, respectievelijk.
  3. Deze 1.8-mL verdunde virus is voldoende voor het wassen stap (400 µL) en de vervanging van medium in de put (1,4 mL). De vereiste veelheid van infectie moet echter worden aangepast aan de definitieve cultuur hoeveelheid 1.6 mL voor hun rekening.
  4. Breng de plaat aan het wassen-dock en gecombineerd alle medium uit de putten. Voeg 400 µL van HBV-bevattende medium en initiëren van stroming in de neerwaartse richting bij 1 µL/s voor 3,5 min. Aspirate alle middelgrote verschijnen aan de kant van het reservoir van de putten.
  5. Voeg 1,4 mL van HBV-bevattende onderhoud medium/coculture "onderhoud" middellange II per goed af en breng de plaat in het docking station binnen een bevochtigde incubator bij 37 ° C en met 5% CO2. Stroom in de neerwaartse richting op een debiet van 1 µL/s voor 8u, gevolgd door een omkering van de opwaartse richting op een debiet van 1 µL/s te initiëren.
  6. 24u na de toevoeging van HBV, breng de plaat aan het wassen-dock en gecombineerd alle medium uit de putten.
  7. Wassen elk goed in de plaat 3 x met de overeenkomstige medium, afhankelijk van het type van de cultuur zoals beschreven in stappen 2.12-2.14, te elimineren overgebleven virus uit de put. In tegenstelling tot stappen 2.12-2.14, toevoegen 1.6 mL medium in elk goed aan account voor het extra volume te bemonsteren om uit te sluiten van entmateriaal overdracht (Figuur 1 g).
  8. Na deze stappen wassen 200 µL van medium van elk putje te bevestigen de volledige verwijdering van de HBV entmateriaal door kwantificering van extracellulaire HBV DNA te verzamelen.
  9. De plaat overbrengen naar het docking station binnen een bevochtigde incubator bij 37 ° C en met 5% CO2, en initiëren van stroming in de opwaartse richting op een debiet van 1 µL/s voor 48 uur.
  10. 48 uur later verzamelen het volledige goed volume voor downstream-analyse, gevolgd door drie wast met hepatocyte onderhoud medium zoals beschreven in stappen 2.12-2.14. Vervang het medium en wassen van elke goed 3 x elke 48 h tot experimentele beëindiging.

6. kwantificering van extracellulaire HBV-DNA

  1. Totale DNA van het supernatant van cultuur volgens de instructies van de fabrikant met de toevoeging van 1 microgram van vervoerder RNA in een beheersingsniveau III lab om ervoor te zorgen de inactivering van het virus in de monsters voorafgaande aan ze te verplaatsen naar een ander gebied te isoleren.
  2. Voorbereiding van een master mix met kwantitatieve PCR master mix, 600 nM voorwaartse primer, 600 nM omgekeerde primer, en 300 nM van sonde.
  3. Voeg 7 µL van de master mix in elk putje van de plaat van een 384-well.
  4. Voeg 5 µL van DNA-monsters in tweevoud, een neen-template besturingselement en duplicaten van serieel verdunde HBV genoom-bevattende plasmide gebaseerde standaard (bijvoorbeeld pCMV-HBV) variërend van 109 exemplaren per reactie op 102 exemplaren per reactie aan elk putje van de qPCR plaat.
  5. Plaatst u een zelfklevende dekking boven de plaat en ervoor te zorgen dat elk goed is afgedicht correct.
  6. De plaat voor 1 min bij 300 x gcentrifugeren.
  7. Start de qPCR uitvoeren volgens de instructies van de fabrikant. De voorwaarden van de cyclus voor PCR in real time zijn 95 ° C gedurende 10 min, gevolgd door 40 cycli van 95 ° C voor 15 s en 60 ° C gedurende 1 minuut.
  8. Het aantal HBV-DNA-kopieën binnen de onbekende monsters volgens de standaard curve te kwantificeren.

7. kwantificering van intracellulaire HBV Pregenomic (pg) RNA

  1. Isoleren totaal RNA van de steigers volgens de instructies van de fabrikant. Met het oog op een volledige cellysis, vortex, elke steigerwerk 3 x voor 30 s gevolgd door centrifugatie bij 300 x g gedurende 1 min tussen elke vortexing. Voer de lysis van de cel in het beheersingsniveau III lab om ervoor te zorgen de inactivering van het virus in de monsters voorafgaande aan ze te verplaatsen naar een ander gebied.
  2. Transcribe cDNA van de geïsoleerde RNA volgens de instructies van de fabrikant.
  3. De voorwaarden van de cyclus voor de retrotranscription zijn 25 ° C gedurende 10 minuten, 37 ° C gedurende 120 minuten, en 85 ° C gedurende 5 minuten.
  4. Houd de cDNA monsters bij 4 ° C gedurende korte of bij-20 ° C voor langdurige opslag.
  5. Master mixen voorbereiden op pgRNA en RPS11 met kwantitatieve PCR master mix en voorwaartse en omgekeerde inleidingen voor pgRNA en RPS11 (gebruikt als schoonmaak gene) op een eindconcentratie van 0,2 µM.
  6. Voeg 7,5 µL van de master mix en 2.5 µL van cDNA per putje op een 384-well-plaat. Meten van RPS11 en pgRNA van elk monster in tweevoud en een neen-template besturingselement goed voor beide genen bevatten.
  7. Plaatst u een zelfklevende dekking boven de plaat en ervoor te zorgen dat elk goed is verzegeld geheel.
  8. De plaat voor 1 min bij 300 x gcentrifugeren.
  9. Plaats de plaat in de qPCR-cycler en start van de qPCR uitgevoerd met behulp van het standaard kwantitatieve PCR protocol volgens de instructies van de fabrikant. De voorwaarden van de cyclus voor PCR in real time zijn 50 ° C voor 2 min, 95 ° C gedurende 2 min, gevolgd door 40 cycli van 95 ° C voor 15 s en 60 ° C gedurende 1 minuut.
  10. Bereken de uitdrukking van pgRNA ten opzichte van RPS11.

8. immunofluorescentie kleuring van virusantigeen

  1. Verwijder de borgring uit de put en het schavot met pincet in een klasse II kabinet in de insluiting niveau III lab.
  2. Het herstellen van de cel-bevattende steigers met 4% paraformaldehyde in 1 mL PBS gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur in het beheersingsniveau III lab. De volgende stappen kunnen worden uitgevoerd in een ander gebied.
  3. Wassen van de steigers 3 x met 1 mL PBS.
  4. Permeabilize van de cellen met behulp van 0,1% Triton-X 100 in 1 mL PBS gedurende 1 uur bij kamertemperatuur.
  5. Wassen van de steigers 3 x met 1 mL PBS.
  6. Blok niet-specifieke binding door incubatie van de steigers met 1% BSA in 1 mL PBS gedurende 16 uur bij 4 ° C.
  7. Wassen van de steigers 3 x met 1 mL PBS.
  8. Uitvoeren primair antilichaam kleuring met behulp van konijn anti-hepatitis B virus core antigeen bij een verdunning 1:200 in 1% BSA in 1 mL PBS gedurende 16 uur bij 4 ° C.
  9. Wassen van de steigers 1 x met 0,1% Tween in 1 mL PBS (PBS-Tween) en 3 x met 1 mL PBS.
  10. Uitvoeren van secundair antilichaam kleuring met geit anti-konijn IgG (H + L) kruis-geadsorbeerde Alexa Fluor 594-geconjugeerde secundair antilichaam bij een verdunning 1:2,000 in 1% BSA in 1 mL PBS gedurende 16 uur bij 4 ° C.
  11. Wassen van de steigers 1 x met 1 mL 0,1% PBS-Tween en 3 x met 1 mL PBS.
  12. Counterstain de steigers DAPI met 1 mL PBS met een concentratie van 2 µg/mL gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur.
  13. Wassen van de steigers 1 x met 1 mL 0,1% PBS-Tween en 3 x met 1 mL PBS.
  14. De steigers overbrengen in een microscoopglaasje en dit koppelen voor imaging.
  15. Het imago van de steigers met behulp van een fluorescentie Microscoop.

9. menselijke albumine ELISA

  1. Dit gedeelte van het protocol in een klasse II kabinet toegewezen in het beheersingsniveau III lab als werken met besmettelijke materiaal uit te voeren.
  2. Evalueren om te beoordelen van de levensvatbaarheid en metabole functionaliteit van PHH, menselijke albumine productie door ELISA.
  3. Jas 96-wells-platen met 50 µL per putje van geit anti-menselijke antilichamen verdund 1:800 in de coating buffer (100 mM bicarbonaat/carbonaat, pH 9,6). Dekking van de platen en incubeer gedurende 2 uur bij 37 ° C of 's nachts bij 4 ° C.
  4. Het antilichaam van de coating van de plaat gecombineerd en wassen het 4 x met 200 µL van 0,05% PBS-Tween.
  5. Voeg 200 µL van blokkeerbuffer (1% BSA in PBS), betrekking hebben op de platen, en hen Incubeer gedurende 1 uur bij 37 ° C of bewaar ze bij 4 ° C voor 3 maanden. Voor langdurige opslag, aan de buffer met blokkerend met toevoegen van 0,05% natriumazide.
  6. De buffer met blokkerend gecombineerd en 1 x met 200 µL van 0,05% wassen PBS-Tween.
  7. Voeg 50 µL van eerder verdunde monsters per putje (1:100). De monster verdunningsmiddel bevat 1% BSA in 0.05% PBS-Tween. Incubeer gedurende 1 uur bij 37 ° C of 's nachts bij 4 ° C.
    Opmerking: Incubeer de normen op hetzelfde moment als de monsters. Een concentratiebereik van 500-0.488 ng/mL (1:2 seriële verdunningen) wordt aanbevolen. Voer alle seriële verdunningen van menselijke albumine in monster verdunningsmiddel.
  8. De monsters van de plaat gecombineerd en wassen het 4 x met 200 µL van 0,05% PBS-Tween.
  9. Voeg toe 50 µL van HRP-geconjugeerde geit anti-menselijke albumine antilichaam verdund eerder 1:10,000 in monster verdunningsmiddel. Incubeer gedurende 2 uur bij 37 ° C of 's nachts bij 4 ° C.
  10. Het antilichaam van de plaat gecombineerd en wassen het 6 x met 200 µL van 0,05% PBS-Tween.
  11. Voeg 100 µL van TMB reagens en, zodra de hoogste normen zijn volledig ontwikkeld, voeg 100 µL 1 M H2dus4 om te stoppen met de colorimetrische reactie.
  12. Lees de absorptie bij 450 nm op een 96-Wells-afleesapparaat voor analyse.

10. Interleukine (IL) 6 en Tumor necrose factoren (TNF) α productie in 3D co culturen

  1. Dit gedeelte van het protocol in een klasse II kabinet toegewezen in het beheersingsniveau III lab als werken met besmettelijke materiaal uit te voeren.
  2. Kwantificeren van de productie van het IL6 en TNFα om de functionaliteit en levensvatbaarheid van de primaire Kupffer cellen te evalueren. Om de productie van deze cytokines door Kupffer cellen, cocultures met 1 µg/mL lipopolysaccharide (LPS) 9 d na zaaien in het coculture onderhoud medium II voor 48 uur te behandelen.
  3. Op dag 11 na zaaien, oogsten van het medium van elk putje en opslaan bij-80 ° C.
  4. Meet de IL6 en TNFα concentratie in het kweekmedium door een passende bepaling en volgens de instructies van de fabrikant.

Resultaten

Beschrijven we een eenvoudig en veelzijdig platform voor de langetermijnkweek van primaire menselijke cellen van de Kupffer en/of hepatocyten en hun infectie met HBV. Primaire menselijke cellen worden overgeënt op collageen beklede polystyreen steigers binnen een microfluidic plaat vergadering, die voortdurend het perfuses van de cellen met groeimedium (Figuur 1a).

PHH, die meestal alleen stabiel voor een beperkte hoeveelheid tijd in conventionele cultuur systemen, kan functioneel worden gehandhaafd voor langere tijd. Menselijke albumine, die is afgescheiden door functionele hepatocyten en wordt beschouwd als de beste teller voor de evaluatie van hepatische metabolisme, is stabiel en sterk uitgedrukt door 3D culturen tot dag 40 na zaaien (Figuur 2). Voor cocultures, kunnen Kupffer cel functionaliteit en levensvatbaarheid worden geëvalueerd door de afscheiding van bepaalde cytokinen (bijvoorbeeld IL6 en TNFα). Voor het meten van cytokine productie, verdient het gebruik van vangst gebaseerde detectie technieken op LPS-stimulatie van de cocultures (Figuur 3).

Cellen vormen hepatische microtissues, meestal binnen 3 dagen na het zaaien van PHH, demonstreren van functionele gal canaliculi en volledige cel polarisatie (Figuur 2). Naast het behoud van hun fysiologische cellulaire metabolisme, worden deze culturen uitzonderlijk vatbaar voor HBV-infectie. HBV-DNA en andere virale markers, in tegenstelling tot andere systemen van cultuur, worden gemakkelijk opspoorbaar vanaf dag 2 na infectie (Figuur 4). Naast secreted markers van virale infectie, hepatocyte-bevattende steigers kunnen worden opgehaald van de culturen en gebruikt voor de immunofluorescentie opsporing van virale antigenen (bijvoorbeeld, HBsAg, HBcAg) (Figuur 4). Waar conventionele hepatocyte culturen vereisen inoculatie met ten minste 500 HBV GE per cel en de toevoeging van 2% DMSO en 4% PEG, zo weinig als 0,05 HBV GE zijn kunnen initiëren infectie in 3D-culturen zonder de eis van DMSO of PEG (Figuur 4).

figure-results-1
Figuur 1: opzet van 3D-lever-on-a-chip culturen. (een) Dit is een schematische lay-out voor de montage van de cultuur-plaat met het oog op de oprichting van microfluidic verkeer. (b) dit paneel toont een vergrote weergave van de putten van de cultuur, met inbegrip van het filtreerpapier, steiger en borgring. (c) dit paneel toont het proces van plaat evenwichtsinstelling vóór het zaaien van de culturen. De volgende twee panelen tonen het proces van zaaien voor (d) hepatocyte monoculturen en (e) hepatocyte/Kupffer-cel cocultures. (f) dit paneel toont de stappen wassen die betrokken zijn bij de middellange wijzigingen. (g) dit paneel toont de HBV-infectie set-up, met inbegrip van de verwijdering van entmateriaal. S.M. = seeding medium, M.M. = onderhoud medium. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

figure-results-2
Figuur 2: vorming en hepatocyte levensvatbaarheid van hepatische microtissue. (een) dit paneel toont longitudinale helderveld beelden van 3D hepatocyte monoculturen demonstreren microtissue formatie na zaaien. (b) dit paneel toont immunofluorescentie beeldvorming van culturen voor kernen (blauw) en menselijke albumine (groen). (c) dit paneel toont longitudinale totale albumine, evenals per cel aangepast albumine productie, gedurende 40 dagen van hepatocyte monoculturen, zoals bepaald door ELISA. De gegevens zijn gemiddelde ± SD. Dit percentage is aangepast van Ortega-Prieto et al.4. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

figure-results-3
Figuur 3: Kupffer cel functionaliteit in de 3D-cocultures. Deze panelen tonen de secretie van (een) IL6 en (b) TNFα in hepatocyte monoculturen en hepatocyte/Kupffer cel 11 dagen na zaaien in reactie op exogenously toegevoegde LPS op dag 9 post zaaien, zoals bepaald met behulp van menselijke magnetische cocultures Luminex assay. Dit percentage is aangepast van Ortega-Prieto et al.4. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

figure-results-4
Figuur 4: HBV-infectie in de lever-on-a-chip culturen. (een) dit paneel toont de immunofluorescentie microscopie detectie van HBcAg (rood), HBsAg (groen) en kernen (blauw) 10 dagen na de infectie van de culturen met HBV. (b) dit paneel toont de gevoeligheid van de culturen voor HBV-infectie met behulp van verschillende multipliciteit van infectie, zoals bepaald door een kwantificering van HBV-DNA in het supernatant van cultuur. (c) dit paneel toont de kwantificering van de longitudinale accumulatie van HBV pgRNA ten opzichte van het huishouden gen RPS11. De gegevens zijn gemiddelde ± SD. Dit percentage is aangepast van Ortega-Prieto et al.4. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Discussie

De uitdagingen bij het handhaven van langdurige culturen van PHH verdreven de ontwikkeling van verschillende cultuur modellen met verbeterde functionaliteit en levensduur, elk exposeren differentiële voor- en nadelen. Het wordt nu algemeen erkend dat statische 2D culturen van PHH zijn het nabootsen van bepaalde aspecten van de hepatocyte biologie voor zeer beperkte hoeveelheid tijd. Zo micropatterned12,13, sferoïde culturen14,15, cocultures en 3D lever-on-a-chip culturen16,17 zijn snel ter vervanging van deze meer basissystemen. Vooral bij de studie van besmettelijke ziekten, die coevolved hebben met hun gastheer voor het gebruiken van specifieke microenvironments, wordt de eis voor het verstrekken van fysiologische omgevingen geschraagd door de vaak uitdagend aard van het kweken van de mens-tropic besmettelijke ziekten, zoals hepatitis C-virus, HBV en malaria.

De meest kritische stap in het uitvoeren van 3D lever-on-a-chip culturen is de kwaliteit van het aanvankelijk afkomstige primaire celtypes. Deze cellen dienen te worden getest op hun naleving van capaciteit en alleen vezinkbaar PHH veel moeten worden gebruikt met het oog op succesvolle weefsel vorming en cultuur generatie. Hoewel vers geïsoleerde PHH kan worden gebruikt, hun cryopreservatie is meestal complex en vereist speciale tarief-gecontroleerde diepvriezers.

In tegenstelling tot conventionele statische 2D culturen, de genetische achtergrond van gastheer is te verwaarlozen met betrekking tot de gevoeligheid voor HBV-infectie, en alle hij-tot nu toe geteste hepatocyte donoren kunnen vast te stellen van de HBV-infectie4.

Hoewel de patiënt afkomstige HBV vaststelt infecties van 3D culturen, het is noodzakelijk om gebruik maken van PEG-neergeslagen en sacharose kussen-gezuiverd HBV wanneer met behulp van afleidbare HBV producent cel voor de generatie van virale entmateriaal lijnen. Cel cultuur supernatant direct toegepast op de 3D lever-on-a-chip culturen, of door de aanwezigheid van remmende factoren of als gevolg van een incompatibiliteit van huidige groeifactoren met hepatocyten, niet gemakkelijk leiden tot infectie. Bovendien, bij het selecteren van virale entmateriaal patiënt afkomstige, moet alleen serum worden gebruikt, aangezien plasma onvermijdelijk stolt en verstopping van de microfluidic verspreiding van de cultuur-platform.

Ongeacht de virale entmateriaal gebruikt, is cellulaire levensvatbaarheid en differentiatie, evenals het zorgen voor volledige verwijdering van de eerste HBV entmateriaal, sleutel tot succesvolle langetermijnstudies infectie. De handigste manier om dit te doen is bemonstering culturen volgend op het verwijderen van de virale entmateriaal, evenals het meten van menselijk serum albumine niveaus gedurende de cultuur. Van de nota, ook voor alle andere beschreven platformen, HBV-infectie, als tot stand gebracht, is niet gemakkelijk verspreid naar niet-geïnfecteerde cellen. Het onderliggende mechanisme hiervoor blijft ongrijpbaar aangezien HBV-infectie in vivo gemakkelijk de meerderheid van de hepatocyten binnen de lever infecteert.

Met betrekking tot cocultures PHH en Kupffer cellen is het raadzaam voor het uitvoeren van veel tests van Kupffer cellen te evalueren IL6 en TNFα secretie in reactie op de stimulatie van de LP's, aangezien niet alle verkrijgbare Kupffer cel donoren een gelijke responsiviteit hebben.

Nog belangrijker is, voor alle drugs behandelingen of eerste infectie van culturen met HBV, moet het totale volume van de put (1,4 mL), evenals vanaf het microfluidic kanaal (0,2 mL), men in aanmerking voor de berekening van de drug of entmateriaal concentraties. Om te verzekeren nauwkeurige dosering, wordt een wassen stap met medium dat HBV of drugs uitgevoerd om het kanaal microfluidic prime.

Het gebruikte platform maakt gebruik van 600.000 PHH per putje, waarbij meerdere lagen hepatocyten binnen de steigers. Hoewel het nummer van de cel kan worden gevarieerd, de concentratie van de gekozen cel zorgt voor optimale resultaten. De indeling van de plaat behaalde een totaal van 12 steigers, die kan worden opgewaardeerd tot 36 steigers. Als gevolg van de eisen van de microfluidic is opschalen naar hoge goed cijfers echter niet mogelijk is tot nu toe.

Met behulp van deze benaderingen, kunnen culturen worden gehandhaafd met optimale mobiele prestaties voor ten minste 40 dagen, die tot dusver ongekende mogelijkheden biedt te evalueren van de roman drugkandidaten, evenals het bestuderen van de complexe wisselwerking tussen verschillende hepatische cel populaties tijdens HBV-infectie.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

Dit werk werd gefinancierd door een subsidie van de Starter van de European Research Council (637304), een Wellcome Trust Investigator Award (104771/Z/14/Z), en door CN Bio innovaties.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Reagents
William's E Medium, no phenol redGIBCOA12176-01
Hepatocyte Thaw MediumGIBCOCM7500
Primary Hepatocyte Thawing and Plating SupplementsGIBCOCM3000
Primary Hepatocyte Maintenance SupplementsGIBCOCM4000
DMEM/F-12GIBCO11320-033
Advanced DMEMGIBCO12491023
DPBS, no calcium, no magnesiumGIBCO14190-144
MEM Non-Essential Amino Acids (NEAA) 100xGIBCO11140050
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)GIBCO15140-122
Fetal Bovine Serum, USA origin, Heat Inactivated, sterile-filtered, suitable for cell cultureSIGMA12106C
HydrocortisoneSIGMAH0888
Trypan blueMerckT8154
Collagen from calf skinMerckC9791
G418SIGMAG418-RO
TetracyclineSIGMAT3258
Polyethylene glycol 8000SIGMAP2139
SucroseSIGMASO389
Sodium carbonate anhydrousSIGMA451614-25G
Sodium bicarbonateSIGMAS5761
Sodium azideSIGMAS2002-5G
Sulfuric acid, 99.999%SIGMA339741
4% ParaformaldehydeSIGMA252549
Triton-X 100SIGMAX100
Tween 20SIGMAP1379
DAPISIGMAD9564
Albumin (human)SIGMAA9731
Fisher BioReagent Bovine Serum Albumin, Fraction V, Heat Shock TreatedFisher ScientificBP9701-100
ProLong Gold Antifade MountantInvitrogenP36930
TaqMan Universal Master Mix II, no UNGApplied Biosystems4440040
SYBR Select Master MixApplied Biosystems4472903
Lipopolysaccharide from Escherichia coli K12InvivoGentlrl-eklps
NameCompanyCatalog NumberComments
Kits/Consumables
Sterile membraneCN Bio innovationsLC-SC
LiverChip Perfusion cell culture plateCN Bio innovationsLC12
LiverChip culture plate lidCN Bio innovationsLC-SC
Sterile round filter paperCN Bio innovationsLC-SC
Cell attachment scaffoldCN Bio innovationsLC-SC
Retaining ringCN Bio innovationsLC-SC
Sterile plungerCN Bio innovationsLC-ST
Dneasy blood & tissue kitQiagen69506
Rneasy mini kitQiagen74106
Human Magnetic Luminex assayR&D Systems
1-Step Ultra TMB-ELISA Substrate SolutionThermoFisher Scientific34028
High Capacity cDNA Reverse Transcription KitThermoFisher Scientific4368814
QIAamp Viral RNA Mini Accessory SetQiagen1048147Bevat RNA-drager
Millicell HY 5-layer cell culture flask, T-1000, sterileMillipore (Merck)PFHYS1008
MicroAmp Optical 384-Well Reaction Plate with BarcodeLife technologies4309849
MicroAmp Optical Adhesive FilmLife technologies4311971
Clear Flat-Bottom Immuno Nonsterile 96-Well PlatesThermoFisher Scientific442404
Sealing Tape for 96-Well PlatesThermoFisher Scientific15036
Nalgene Rapid-Flow Sterile Disposable Bottle Top Filters with PES MembraneThermoFisher Scientific295-3345
Fisherbrand Microscopic Slides with Ground Edges, Twin FrostFisher ScientificFB58628
Tube, Thinwall, Ultra-Clear, 38.5 mL, 25 x 89 mmBeckman Coulter344058
NameCompanyCatalog NumberComments
Primary cells / Cell lines
Human Plateable Hepatocytes, Transporter QualifiedThermo Fisher ScientificHMCPTS
Cryopreserved Human Kupffer CellsThermo Fisher ScientificHUKCCS
HepDE19 cell lineHaitao Guo (Indiana University, IN, USA)
NameCompanyCatalog NumberComments
Primers/Probes/Standards
HBV DNA forward primerInvitrogen5'-GTGTCTGCGGCGTTTTATCA-3'
HBV DNA reverse primerInvitrogen5'-GACAAACGGGCAACATACCTT-3'
HBV DNA probeInvitrogen5'FAM-CCTCTKCATCCTGCTGCTATGCCTCATC-3'TAMRA
pgRNA forward primerInvitrogen5'-GAGTGTGGATTCGCACTCC-3'
pgRNA reverse primerInvitrogen5'-GAGGCGAGGGAGTTCTTCT-3'
RPS11 forward primerInvitrogen5'-GCCGAGACTATCTGCACTAC-3'
RPS11 reverse primerInvitrogen5'-ATGTCCAGCCTCAGAACTTC-3'
pCMV-HBVProfessor Christoph Seeger (Fox Chase Cancer Centre, PA, USA)

Referenties

  1. Verrier, E. R., Colpitts, C. C., Schuster, C., Zeisel, M. B., Baumert, T. F. Cell Culture Models for the Investigation of Hepatitis B and D Virus Infection. Viruses. 8 (9), (2016).
  2. Elaut, G., et al. Molecular mechanisms underlying the dedifferentiation process of isolated hepatocytes and their cultures. Current Drug Metabolism. 7 (6), 629-660 (2006).
  3. Konig, A., et al. Kinetics of the bile acid transporter and hepatitis B virus receptor Na+/taurocholate cotransporting polypeptide (NTCP) in hepatocytes. Journal of Hepatology. 61 (4), 867-875 (2014).
  4. Ortega-Prieto, A. M., et al. 3D microfluidic liver cultures as a physiological preclinical tool for hepatitis B virus infection. Nature Communications. 9 (1), 682(2018).
  5. Allweiss, L., Dandri, M. The Role of cccDNA in HBV Maintenance. Viruses. 9 (6), (2017).
  6. Guo, J. T., Guo, H. Metabolism and function of hepatitis B virus cccDNA: Implications for the development of cccDNA-targeting antiviral therapeutics. Antiviral Research. 122, 91-100 (2015).
  7. Lucifora, J., et al. Direct antiviral properties of TLR ligands against HBV replication in immune-competent hepatocytes. Scientific Reports. 8 (1), 5390(2018).
  8. Hosel, M., et al. Hepatitis B Virus Activates Signal Transducer and Activator of Transcription 3 Supporting Hepatocyte Survival and Virus Replication. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 4 (3), 339-363 (2017).
  9. Mazza, G., et al. Rapid production of human liver scaffolds for functional tissue engineering by high shear stress oscillation-decellularization. Scientific Reports. 7 (1), 5534(2017).
  10. Hang, T. C., Lauffenburger, D. A., Griffith, L. G., Stolz, D. B. Lipids promote survival, proliferation, and maintenance of differentiation of rat liver sinusoidal endothelial cells in vitro. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 302 (3), G375-G388 (2012).
  11. Hwa, A. J., et al. Rat liver sinusoidal endothelial cells survive without exogenous VEGF in 3D perfused co-cultures with hepatocytes. The FASEB Journal. 21 (10), 2564-2579 (2007).
  12. Khetani, S. R., Bhatia, S. N. Microscale culture of human liver cells for drug development. Nature Biotechnology. 26 (1), 120-126 (2008).
  13. March, S., et al. Micropatterned coculture of primary human hepatocytes and supportive cells for the study of hepatotropic pathogens. Nature Protocols. 10 (12), 2027-2053 (2015).
  14. Bell, C. C., et al. Characterization of primary human hepatocyte spheroids as a model system for drug-induced liver injury, liver function and disease. Scientific Reports. 6, 25187(2016).
  15. Tong, W. H., et al. Constrained spheroids for prolonged hepatocyte culture. Biomaterials. 80, 106-120 (2016).
  16. Griffith, L. G., Wells, A., Stolz, D. B. Engineering liver. Hepatology. 60 (4), 1426-1434 (2014).
  17. Domansky, K., et al. Perfused multiwell plate for 3D liver tissue engineering. Lab Chip. 10 (1), 51-58 (2010).

Herprints en machtigingen

Tags

Microfluïdische kweekHBV-infectieanalyse van de gastheerresponscccDNA-evaluatiestudies naar drugseffectiviteitfysiologisch modelsysteem
"Lever-on-a-Chip" culturen van primaire hepatocyten en Kupffer cellen voor Hepatitis B-virusinfectie
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.