Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Kweken en manipulatie van O9-1 neurale kamcellen

11.1K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/58346

⸱

9 oktober 2018

 ,  ,  , 
1Molecular Physiology and Biophysics, Baylor College of Medicine, 2Department of Biochemistry and Molecular Biology, University of Southern California

In dit artikel

Erratum-melding

Important: There has been an erratum issued for this article. View Erratum Notice

Samenvatting

O9-1 is een cellijn van multipotente muis crest van de neurale. Hier beschrijven we gedetailleerde stapsgewijze protocollen voor kweken O9-1 cellen, O9-1 cellen in specifieke celtypes te differentiëren en genetisch manipuleren O9-1 cellen met behulp van siRNA-gemedieerde knockdown of bewerken van CRISPR-Cas9-genoom.

Samenvatting

Neurale kamcellen (NCCs) zijn de migratie van multipotente stamcellen die kunnen onderscheiden in verschillende soorten cellen en aanleiding geven tot meerdere organen en weefsels. De regel van de cel O9-1 is afgeleid van de endogene muis embryonale NCCs en onderhoudt haar multipotent. Echter specifieke cultuur, O9-1 cellen kunnen onderscheid in verschillende soorten cellen en voorwaarden worden gebruikt in een breed scala van toepassingen van het onderzoek. Onlangs, met de combinatie van muis studies en O9-1 cel studies, wij hebben aangetoond dat de Hippo signalering traject effectoren Yap en Taz spelen een belangrijke rol in de neurale crest afkomstige craniofaciale ontwikkeling. Hoewel het kweken proces voor O9-1 cellen ingewikkelder dan die is gebruikt voor andere cellijnen is, is de regel van de cel O9-1 een krachtig model voor het onderzoeken van de NCCs in vitro. Hier presenteren we een protocol voor het kweken van de cellijn O9-1 om te handhaven zijn stemness, evenals de protocollen voor het differentiëren van O9-1 cellen in verschillende celtypen, zoals zachte spiercellen en botcellen. Daarnaast worden protocollen beschreven voor het uitvoeren van gene verlies-van-functie studies in O9-1 cellen met behulp van CRISPR-Cas9 verwijderen en Klein Mengend RNA-gemedieerde knockdown.

Inleiding

Neurale kamcellen (NCCs) zijn multipotente stamcellen-achtige cellen met een opmerkelijke trekkende vermogen en voorbijgaande bestaan tijdens de embryonale ontwikkeling. NCCs ontstaan tussen de oppervlakte ectoderm en de neurale buis en migreren naar andere delen van het embryo tijdens de embryonale ontwikkeling1. Op basis van hun functionele domeinen, kunnen NCCs worden ingedeeld in verschillende soorten, met inbegrip van de craniale, romp, vagale, sacraal, en cardiale NCCs. Daarnaast kan NCCs onderscheid in meerdere lineages van de cel, zoals zachte spiercellen, bot cellen en neuronen, en aanleiding geven tot verschillende weefsels2,3. De ontwikkeling van de NCCs wordt gekenmerkt door een complexe reeks van morfogenetische gebeurtenissen die zijn verfijnd door verschillende moleculaire signalen. Gezien de complexe regulering van NCCs en hun belangrijke bijdragen aan vele structuren, kan de disregulatie van NCC ontwikkeling vaak leiden tot aangeboren afwijkingen bij de geboorte, die goed zijn voor bijna 30% van alle menselijke aangeboren geboorteafwijkingen. Afwijkingen bij de ontwikkeling van neurale crest kunnen leiden tot gespleten lip/gehemelte, gebrekkig neus vorming, syndromen, gebreken zoals een defecte cardiale uitstroom tractus of zelfs kindersterfte1,4,5, 6 , 7. begrip van de moleculaire mechanismen van NCC ontwikkeling is belangrijk voor de ontwikkeling van behandelingen voor ziekten veroorzaakt door gebreken in de NCC ontwikkeling. Met het gebruik van verschillende in vitro en in vivo benaderingen8,9,10,11,12,13,14 ,15, aanzienlijke vooruitgang is geboekt in de NCC onderzoek. In vivo, dierlijke modellen, waaronder kippen, amfibieën, zebravis en muizen, hebben gebruikt om te onderzoeken NCCs1. Bovendien zijn menselijke embryo's te bestuderen van het proces van de NCC migratie in de vroege ontwikkeling van het menselijk embryo16gebruikt. In vitro, cel modellen voor NCCs, zoals menselijke NCCs dat afkomstig van de geduldige onderhuids vet is, zijn gebruikt om te onderzoeken Parkinson's disease17. De O9-1 NCC-lijn, die is oorspronkelijk afgeleid van massale culturen van endogene NCCs van E8.5 muis embryo's18werd geïsoleerd, is een krachtige cel model voor het bestuderen van NCCs. bovenal onder de kweekomstandigheden niet-differentiëren, O9-1 cellen zijn Multipotente stamcellen-achtige NCCs. Echter onder wisselende cultuuromstandigheden, kunnen O9-1 cellen worden onderscheiden in DN celtypen, zoals zachte spiercellen, botcellen, chondrocyten en gliacellen18. Gezien deze eigenschappen, zijn O9-1 cellen over het algemeen gebruikt voor NCC-gerelateerde studies, zoals het onderzoek van het moleculaire mechanisme van Cranio-faciale gebreken19,20.

Hier, gedetailleerde protocollen worden geleverd voor het onderhouden van O9-1 cellen, O9-1 cellen in verschillende celtypes te differentiëren en O9-1 cellen manipuleren door het uitvoeren van gene verlies-van-functie studies met CRISPR-Cas9 genoom bewerken en Klein Mengend RNA (siRNA)- gemedieerde vechtpartij technologieën. Als een representatief voorbeeld, wordt het gebruik van O9-1 cellen te bestuderen van Yap en Taz verlies-van-functie beschreven. Yap en Taz zijn de stroomafwaartse effectoren van de Hippo signalering traject, die een cruciale rol in de celproliferatie, differentiatie en apoptosis speelt. Het nijlpaard-traject is ook aangetoond als belangrijk in de ontwikkeling en de homeostase van diverse verschillende weefsels en organen, alsmede in de pathogenese van verschillende ziekten20,21,22,23 ,24,25,26,27,28. De basisonderdelen van Hippo signalering omvatten de tumor suppressor steriele 20-achtige kinases Mst1/2, WW domein-bevattende Salvador steiger eiwitten en de grote tumor suppressor homolog (Lats1/2) kinases. Hippo signalering remt Yap en Taz activiteit en bevordert hun afbraak in het cytoplasma. Zonder onderdrukking van Hippo, kunnen Yap Taz translocate in de kernen en fungeren als transcriptionele co activators. We onlangs bleek dat specifiek het inactiveren van de Hippo effectoren Yap en Taz in muis NCCs met behulp van de Wnt1cre signalering en Wnt1Cre2SOR chauffeurs resulteerde in embryonale letaliteit op E10.5 met ernstige craniofaciale afwijkingen20. We hebben ook studies O9-1 cuvetten te onderzoeken van de rol van Yap en Taz in NCCs uitgevoerd. Om te studeren Yap en Taz functie in NCC proliferatie en differentiatie, Yap en Taz knockdown cellen werden gegenereerd in O9-1 cellen met behulp van siRNA en Yap knock-out cellen zijn gegenereerd met behulp van CRISPR-Cas9 genoom bewerken. De dezelfde gene verlies-van-functie strategieën kunnen worden toegepast op verschillende doelgenen in andere trajecten. Daarnaast kunnen winst-van-functie studies en tests van de transfectie ook worden toegepast op O9-1 cellen te bestuderen van genfuncties en verordening. De protocollen die hier beschreven zijn bedoeld om te worden gebruikt door onderzoekers als gids voor het kweken van O9-1 cellen te handhaven van multipotente stemness, voor het differentiëren van O9-1 cellen in andere celtypes onder verschillende kweekomstandigheden en voor het bestuderen van de genfunctie en de moleculaire mechanismen van NCCs.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

1. voorbereiding voor O9-1 celkweek

Opmerking: Basale media die worden gebruikt voor de cultuur van de cel van de O9-1 moet hebben geconditioneerd door Sandos inteelt muizen thioguanine/Ouabaïne-resistant (STO) muis fibroblast cellen; STO cellen moeten worden verkregen en bereid zoals hieronder beschreven voordat de cultuur van de cel van de O9-1.

  1. Actieve STO celkweek
    1. Media voor kweken van actieve STO cellen door volledige Dulbecco van Eagle's media (DMEM gemodificeerde) met 7% foetale runderserum (FBS) (embryonale stamcellen cultuur grade), 100 U/mL penicilline, 100 µg/mL streptomycine en 2 mM L-glutamine (eindconcentraties te bereiden zijn aangegeven).
      Opmerking: STO voedingsbodem wordt gebruikt voor de teelt van actieve STO feeder cellen. L-glutamine, penicilline en streptomycine kunnen vormen neerslag in opslag bevinden; Los volledig door pipetteren vóór gebruik.
    2. Jas een standaard 100 mm cel cultuur plaat met 0,1% gelatine gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur. Na de incubatieperiode, gecombineerd de extra gelatine. Gebruik de plaat onmiddellijk na coating.
      Opmerking: U kunt ook de afdekplaat met STO media en laat de plaat in een bevochtigde incubator om te voorkomen dat het drogen van de plaat (dit is alleen voor de korte termijn opslag en niet voor het opslaan van voorgelakt platen bedoeld).
    3. Ontdooi de STO cellen snel in een waterbad 37 ° C; Veeg de cryovial met 70% ethanol voor opening, en het hele flesje van cellen onmiddellijk overbrengen in een centrifugebuis.
    4. De STO media ontkleuring toevoegen aan de centrifugebuis; de verhouding volumepercentage van de cellen tot media is 1:10.
    5. Centrifugeer de cellen bij 180 x g gedurende 3 min op RT.
    6. Meng door zachte pipetteren en overdracht cellen aan de gelatine beklede plaat.
    7. STO cellen groeien gedurende 24 uur in een standaard incubator (37 ° C, 5% CO2) toestaan.
    8. Wijzigen van het medium (pas na de cellen houden) 24u na zaaien en gooi het oude medium.
    9. Controleer STO cellen dagelijks onder een microscoop en doorsnede(n) ter 80% confluentie.
      1. Voordat u begint STO cel passaging, jas platen met 0,1% gelatine (gelatine volume is gelijk aan de helft van de groei media volume voor dat vaartuig) gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur.
      2. Om de passage van STO cellen, gecombineerd groei media en cellen met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) twee keer wassen (PBS in een gelijk volume groei media toevoegen).
      3. PBS gecombineerd en toevoegen van 0,25% trypsine-EDTA (het volume volgens de grootte van het schip); vervolgens, Incubeer bij 37 ° C gedurende 5 minuten.
        Opmerking: Gebruik voor een 100 mm plaat, 10 mL groei media en 3 mL trypsine oplossing. Gebruik voor een 150 mm plaat, 20 mL groei media en 8 mL trypsine oplossing. De hoeveelheid was buffer gebruikt is gelijk aan het volume van de media van de groei.
      4. Inactivering van trypsine met een gelijk volume van STO media. Zaad STO cellen aan nieuwe platen met een verhouding van 1:3 tot en met 1:10.
        Opmerking: Een groeiende gemeenschappelijke regeling is om uit te breiden van een cryovial in een 100 mm plaat, dan naar een 150 mm plaat, vervolgens naar vier 150 mm platen, en ten slotte aan 16 150 mm platen.
  2. Inactivering en bevriezen van STO cellen
    1. Voor het voorbereiden van 2 x de bevriezing van de media, voeg het volgende toe STO media (eindconcentraties zijn aangegeven): 20% FBS, 20% dimethylsulfoxide (DMSO).
    2. Na het mengen, filter steriliseren van de 2 x media (porie grootte 0,22 µm) invriezen en het bewaren bij 4 ° C tot gebruik. 2 x bevriezing media dezelfde dag van gebruik en Gooi ongebruikte bevriezing media maken
    3. Bereid de oplossing mitomycine C in PBS met een concentratie van 0,5 mg/mL. Tape de fles op een vortexer en vortex op een laag instellen voor ongeveer 45 min te ontbinden de deeltjes volledig te ontbinden mitomycine C in PBS.
      Opmerking: Mitomycine C is licht gevoelig en moeilijk te ontbinden.
      Let op: Mitomycine C is acuut toxisch en kan kanker veroorzaken. Behandelen alleen goede persoonlijke beschermingsmiddelen.
    4. Inactivering van STO cellen door een eindconcentratie van 0,01 mg/mL mitomycine C toe te voegen aan de bestaande media. Incubeer gedurende 2 h binnen een standaard incubator (37 ° C, 5% CO2).
    5. Spoel de platen (150 mm) met 20 mL PBS tweemaal na inactivering met mitomycine C.
    6. De PBS-oplossing gecombineerd, distantiëren van cellen met behulp van 8 mL van 0,25% trypsine-EDTA en incubeer gedurende 5 min binnen een standaard bevochtigde incubator (37 ° C, 5% CO2).
    7. Inactivering van trypsine met 8 mL STO media.
    8. Breng de cel oplossing over in een centrifugebuis. Meer dan één plaat combineren in een centrifugebuis om tijd te besparen. Centrifugeer gedurende 5 min op 180 x g.
    9. Gecombineerd het supernatant en resuspendeer de pellet cel in 5 mL PBS.
    10. Gebruik 10 µL van de cel oplossing cellen tellen met een hemocytometer. De cellen in het centrale plein van gerasterde tellen en vermenigvuldig het aantal verkregen door 104 om te bepalen van het aantal cellen per 1 mL. Twee keer tellen en het gemiddelde van de twee getallen om te verkrijgen van de uiteindelijke schatting van het aantal cellen per milliliter.
    11. Cellen gedurende 5 min. op 180 x gcentrifugeren.
    12. PBS gecombineerd en 1:1 (volumeprocent) STO media en 2 x bevriezing media toevoegen aan de cel-pellet. Stel het volume voor een concentratie van de laatste cel van 4 x 106 cellen/mL (dit bedrag is goed voor een 100 mm plaat).
      Opmerking: bijvoorbeeld uit vier 150-mm platen levert een totaal van 60 x 106 cellen, bevriezen 4 x 106 cellen per cryovial, met elk cryovial met 1 mL van de oplossing van de cel. Vier platen opbrengst ongeveer 15 cryovials (60/4 = 15). Voeg 7,5 mL STO media en 7,5 mL 2 x bevriezing van media naar de cel pellet resuspendeer en aliquot 1 mL in elke cryovial.
    13. Resuspendeer door langzaam pipetteren bevriezing media met cel pellet. Breng 1 mL van cell oplossing elke cryovial en etiket dienovereenkomstig.
    14. Plaats cryovials in een hardplastic polystyreen doos (dit biedt een langzame afkoeling tarief, dat overleving van de cel verbetert). Het vak overbrengen in een vriezer-80 ° C gedurende ten minste 24 uur vóór de overbrenging van de cryovial aan de vloeibare stikstof.
      Opmerking: Voor de beste resultaten, minimaliseren de cel tellen van de tijd, evenals de tijd tussen 2 x bevriezing media toevoegen aan cellen en de overdracht van flesjes tot-80 ° C.

2. O9-1 celkweek

  1. De cultuur van de cel van de O9-1 basale media voorbereiden door het volgende toe te voegen in DMEM (eindconcentraties zijn aangegeven): 15% FBS, niet-essentiële aminozuren van 0.1 mM minimale essentiële media (MEM) 1 mM natrium pyruvaat, 55 mM bèta-mercaptoethanol, 100 U/mL penicilline, 100 U/mL streptomycine, 2 mM L-glutamine, 103 eenheden/mL leukemie remmende factor (LIF; toegevoegd onmiddellijk vóór gebruik, Voeg geen aan voorraad fles), en 25 ng/mL fibroblast groeifactor-basic (bFGF; toegevoegd onmiddellijk vóór gebruik, Voeg geen aan voorraad fles).
  2. Filter steriliseren van de basale media (porie grootte 0,22 µm) en wikkel in aluminiumfolie te beschermen tegen licht.
  3. Geconditioneerde basale media ophalen geïnactiveerd STO cellen.
    Opmerking: Ga alleen na het verkrijgen van geïnactiveerd STO cellen. Basale media O9-1 verzameld van STO cel platen is hierna te noemen de geconditioneerde basale media.
    1. Dooi geïnactiveerd STO cellen snel zoals hierboven beschreven (één cryovial met 4 x 106 cellen is goed voor een 100 mm plaat en levert ongeveer 100 mL geconditioneerd basale media na 10 dagen van collectie). Zaad geïnactiveerd STO cellen aan de gelatine beklede plaat met behulp van STO media. Cellen koppelen overnachting in een standaard bevochtigde incubator (37 ° C, 5% CO2) toestaan.
    2. 24 h na het ontdooien van STO cellen, negeren de bestaande STO media en vervangen met de basale media.
      Opmerking: Voeg geen LIF en bFGF aan geïnactiveerd STO cel cultuur gerechten; alleen toevoegen aan O9-1 cel cultuur gerechten.
    3. Elke 24 h, media wijzigen met behulp van de basale media O9-1 en de basale media van STO cel platen in een fles te verzamelen. Wikkel de fles met geconditioneerde basale media in folie te beschermen tegen licht. Opslaan van alle verzamelde media bij 4 ° C.
      Opmerking: Omdat de cellen werden geïnactiveerd, ze verschijnen niet zo gezond als ze na enkele dagen van collectie deden; Dit is te verwachten.
    4. Eventueel ook om te controleren of besmetting, ophalen de basale media voor elke dag van de collectie in verschillende buisjes (in plaats van een fles) verpakt in folie. Met behulp van een 24-well plaat, 1 mL medium uit elke dag plaats in elk putje en na een nacht bebroeden in een standaard incubator om bacteriële besmetting onder de Microscoop te controleren.
      Opmerking: De media blijft een rode kleur, als er is geen besmetting maar wijzigingen in geel als bacteriële besmetting aanwezig is.
    5. Na het verzamelen van geconditioneerd basale media voor 10 dagen, negeren de STO-cellen. Combineren (indien van toepassing) alle verzamelde voorwaardelijke basale media en filter steriliseren (porie grootte 0,22 µm) in een steriele fles. Wikkel de fles in folie te beschermen tegen licht. De gefilterde geconditioneerde Basaal medium bewaren bij 4 ° C voor een maximum van één maand vanaf de datum van de filter.

3. behoud van de cellen van de O9-1

Opmerking: Werken O9-1 basale media is filter gesteriliseerde geconditioneerd basale media, aan welke LIF (eindconcentratie 103 eenheden/mL) en bFGF (eindconcentratie 25 ng/mL) onmiddellijk aan de cel cultuur schotel vóór gebruik worden toegevoegd. Deze media moet worden beschermd tegen licht en opgeslagen bij 4 ° C.

  1. Herstel van cellen O9-1
    1. Langzaam ontdooien de voorraad fles van de kelder membraan matrix (bvMatrigel) 's nachts bij 4 ° C voor te bereiden aliquots.
    2. Voeg 5 mL DMEM met 10% FBS tot 5 mL van de voorraad kelder membraan matrix membraan. Meng goed door pipetteren met koude Pipetteer tips opgeslagen bij-20 ° C. Houd de originele fles en aliquot buizen op ijs. Bevriezen aliquots in verschillende volumes (0,5 mL of 1 mL aliquots) afhankelijk van de behoeften van het experiment. Vermijd bevriezen-ontdooien kelder membraan matrix meerdere keren.
      Opmerking: kelder membraan matrix polymerizes snel bij kamertemperatuur; Gebruik koud Pipetteer tips en buizen koud te houden wanneer u werkt om te voorkomen dat onbedoelde polymerisatie.
    3. Ontdooi een aliquoot gedeelte van de kelder membraan matrix bij 4 ° C of op ijs 2 h voordat het experiment. Bewaar de matrix bij 4 ° C niet voor een langere periode.
    4. Gebruik de filter-gesteriliseerde DMEM met 10% FBS om te verdunnen van de kelder membraan matrix een eindconcentratie van 0,5 mg/mL jas van de platen. De platen van de vacht met de kelder membraan matrix (0,5 mg/mL) bij kamertemperatuur voor 1 h. Zorg ervoor dat het volledig heeft betrekking op de plaat (zoals weergegeven in Figuur 1).
    5. Kantelen van de plaat als aspirating van de kelder membraan matrix om te voorkomen dat het aanraken van het gecoate oppervlak; droge platen bij 37 ° C gedurende 30 minuten. Niet te droge gecoate platen.
      Opmerking: Gaan alleen als alle media en reagentia klaar zijn voor gebruik (geconditioneerd basale media, steriele gefiltreerd 10% FBS in DMEM, LIF en bFGF).
    6. O9-1 cellen snel herstellen door het plaatsen van de cryovial in een waterbad 37 ° C; langzaam swirl de flacon tot de oplossing volledig bochten om vloeistof en ga onmiddellijk naar de volgende stap.
    7. Breng alle de cel oplossing uit de cryovial (ongeveer 1 mL) over een centrifugebuis 15 mL. Voeg 5 volumes van DMEM met 10% FBS (filter gesteriliseerd met een filter poriegrootte van 0,22 µm) en resuspendeer.
    8. Centrifugeer gedurende 3 minuten op 180 x g. De bovendrijvende vloeistof zonder verstoring van de pellet cel gecombineerd. Resuspendeer de pellet van de cel (door te onttrekken) in geconditioneerde basale media aangevuld met LIF en bFGF. Cellen tellen met behulp van een hemocytometer.
      Opmerking: Geconditioneerde basale media aangevuld met LIF en bFGF is essentieel voor het handhaven van de multipotent voor de cellijn O9-1. Wees voorzichtig om toe te voegen de juiste media om te voorkomen dat onbedoelde celdifferentiatie.
    9. De cellen van het zaad van 10.000 tot 15.000 cel/cm2 tot een 6-well-plate. Cellen te koppelen en te groeien in een standaard cel cultuur incubator (37 ° C, 5% CO2) 's nachts voordat u media toestaan.
    10. Zorg ervoor dat de cellen zijn gekoppeld voordat u wijzigen van media (gezonde gekoppelde cellen eruit die worden weergegeven in Figuur 2).
    11. Altijd wijzigen voedingsbodems de volgende dag na het herstel van O9-1 cellen (gebruiken geconditioneerde basale media aangevuld met LIF en bFGF).
  2. Passage van de cellen O9-1
    1. Wanneer O9-1 cellen 80% confluentie bereiken, de kelder membraan matrix ontdooien en bereiden een kelder membraan matrix beklede plaat zoals hierboven beschreven. Geconditioneerde basale media aangevuld met LIF en bFGF aan het vaartuig toevoegen. U kunt ook toevoegen DMEM zonder FBS te behoeden voor de kelder membraan matrix drogen en op te slaan in een standaard bevochtigde incubator voor niet meer dan 3 dagen.
    2. Spoel de O9-1-bevattende putten (6-well-plate) met 2 mL Dulbecco van fosfaat gebufferde zoutoplossing (DPBS) tweemaal en zachtjes Pipetteer Voorkom verlies van cellen.
    3. Cellen met 1 mL 0,05% trypsine-EDTA bij 37 ° C gedurende 3 min. neutraliseren trypsine met een gelijke hoeveelheid DMEM met 10% distantiëren FBS. Pipetteer herhaaldelijk de vloeistof over het hele oppervlak van de put te distantiëren van net zoveel cellen van de plaat mogelijk.
      Opmerking: Trypsine concentratie is 0.05% in plaats van 0,25%. Gebruik DPBS om te verdunnen uit de voorraad fles.
    4. Vermijd bubbels te genereren wanneer distantieert van de cellen van de plaat.
    5. Alle cell oplossing overbrengen in een centrifugebuis en Centrifugeer gedurende 3 minuten op 180 x g. De bovendrijvende vloeistof zonder verstoring van de pellet cel gecombineerd. Resuspendeer de pellet van de cel in de centrifugebuis door zachte pipetteren in geconditioneerde basale media aangevuld met LIF en bFGF.
    6. Gebruik een hemocytometer om te tellen het totale celaantal zoals hierboven beschreven. Zaad-cellen (10.000 tot 15.000 cellen/cm2) aan de beklede plaat voorbereid zoals beschreven in stappen 3.1.4 te 3.1.8. Een putje van de plaat van een 6-well zou vereisen 100.000 cellen naar zaad.
    7. Cellen te koppelen en te groeien in een standaard cel cultuur incubator (37 ° C, 5% CO2) toestaan. Altijd wijzigen voedingsbodems de volgende dag na passaging O9-1 cellen.
  3. Bevriezing van O9-1 cellen
    1. Ter voorbereiding van 2 x bevriezing van media voor O9-1 cellen, Verdun de volgende in DMEM (eindconcentraties zijn aangegeven): 40% FBS en 20% DMSO.
    2. Filter steriliseren 2 x bevriezing van media en houd het bij 4 ° C. De 2 x bevriezing media moet worden gemaakt op de dag dat het wordt gebruikt. Gooi alle ongebruikte bevriezing media.
      Opmerking: Bevriezen O9-1 cellen op 80% confluentie.
    3. Spoel putjes met DPBS tweemaal; Pipet zachtjes om te voorkomen dat verliezen van cellen.
    4. Distantiëren van cellen met 0,05% trypsine-EDTA bij 37 ° C gedurende 3 minuten, dan neutraliseren trypsine met een gelijke hoeveelheid van 10% FBS in DMEM. Pipetteer herhaaldelijk de vloeistof over het hele oppervlak van de put te distantiëren van net zoveel cellen van de plaat mogelijk.
    5. Alle plaat inhoud overbrengen in een centrifugebuis en Centrifugeer gedurende 3 minuten op 180 x g. Voeg toe 2 mL PBS, gecombineerd het supernatant en resuspendeer door te onttrekken.
    6. Gebruik 10 µL van cell oplossing cellen tellen met een hemocytometer zoals hierboven beschreven.
    7. Cell oplossing gedurende 3 minuten op 180 x gcentrifugeren. De bovendrijvende substantie gecombineerd en aanpassen van de hoeveelheid basale media nodig; dan, voeg een gelijke hoeveelheid van 2 x bevriezing media.
      Opmerking: Cellen worden ingevroren bij een concentratie van 1 x 106 cellen/mL (1 mL per cryovial).
    8. Cellen omzetten in cryovials en etiket dienovereenkomstig. Plaats cryovials in een hardplastic polystyreen doos voor een langzame afkoeling tempo-80 ° C gedurende ten minste 24 uur vóór de overbrenging van vloeibare stikstof.
      Opmerking: Voor de beste resultaten, minimaliseren de cel tellen van de tijd en de tijd tussen het toevoegen van 2 x de bevriezing van de media en de overdracht van flesjes tot-80 ° C.

4. de manipulatie van O9-1 cellen

  1. Uitvoeren van siRNA knockdown in O9-1 cellen
    1. Ontdooien en jas van een 24-well plaat met kelder membraan matrix, zoals hierboven (stappen 3.1.4–3.1.8) voordat het experiment beschreven. Herstellen en zaad O9-1 cellen, zodat ze kunnen groeien tot 60% tot 80% confluency.
    2. Verdunde liposomen in serumvrij media volgens het juiste goed volume. Verdunde siRNA in serumvrij media naar de finale. Verdunde siRNA aan verdunde liposomen in een verhouding die door de fabrikant aanbevolen toevoegen. Meng goed door pipetteren en uit te broeden.
      Opmerking: Volg de fabrikant gids op het volume dat wordt gebruikt-, tijd- en temperatuurdisplays van incubatie.
    3. Een passende omvang van siRNA-lipide complex toevoegen aan cellen volgens de aanbevelingen van de fabrikant.
    4. Incubeer de cellen gedurende 24 uur in een standaard cel cultuur incubator (37 ° C, 5% CO2). Stroomafwaarts stappen als passende (uittreksel RNA, eiwitten extract, vlekken, enz.)
      Opmerking: siRNA vechtpartij tijden en concentraties kunnen variëren afhankelijk van de individuele experiment.
  2. Uitvoeren van gene knock-out in O9-1 cellen met behulp van CRISPR-Cas9 genoom bewerken
    Nota: Verwijs naar het eerder gepubliceerde protocol voor het gebruik van CRISPR-Cas9 in zoogdiercellen lijnen29. Voorwaarde hier een vereenvoudigde beschrijving van CRISPR-Cas9 genoom bewerken en verwante stappen is.
    1. Opvragen sgRNA sequenties met behulp van een programma voor het ontwerpen van sgRNA.
    2. Afbinden van de sgRNA naar pSpCas9 (bb) - 2a - GFP vector30.
    3. Transfect O9-1 cellen met de vector met behulp van een standaard lipofection protocol volgens de aanbevelingen van de fabrikant.
    4. Incubeer de cellen in een standaard cel cultuur incubator bij 37 ° C met 5% CO2 gedurende 24 uur.
    5. Fluorescentie-activated cell sorting (FACS) op basis van GFP/7-AAD uitvoeren Zaad GFP + afzonderlijke cellen in 96-wells-platen.
    6. De cellen in de incubator voor extra 4 dagen groeien. Gooi alle putjes die meer dan één kolonie hebben.
    7. Het uitvoeren van PCR met inleidingen ontworpen voor het opsporen van de verwijdering. Voer na PCR, PCR producten op een agarose gel te evalueren van de band grootte. Valideren van de efficiëntie van de knock-out bereikt met behulp van CRISPR-Cas9 editingby uitvoeren met het westelijke bevlekken (een voorbeeld van Yap knockout resultaten is afgebeeld in Figuur 3).

5. O9-1 celdifferentiatie

  1. Differentiatie van O9-1 cellen in botcellen
    1. Ter voorbereiding van osteogenic differentiatie media, Verdun de volgende handelingen uit in de alpha-MEM (eindconcentraties zijn aangegeven): 0.1 mM dexamethason 100 ng/mL bot morfogenetische eiwit 2 (BMP2), 50 µg Mo/mL ascorbinezuur, 10 mM b-glycerophosphate, 10% FBS, 100 U/mL penicilline en 100 mg/mL streptomycine.
    2. Bemerk de osteoblast-markering, osteocalcin, in gedifferentieerde botcellen door immunokleuring zoals weergegeven in Figuur 4.
      Opmerking: Osteogenic differentiatie kan ook worden geëvalueerd met behulp van andere markeringen van botcellen of met Alizarine rode kleuring of alkalisch fosfatase kleuring.
  2. Differentiatie van O9-1 cellen in chondrocyten
    1. Ter voorbereiding van chondrocyten differentiatie media, Verdun de volgende handelingen uit in de alpha-MEM (eindconcentraties zijn aangegeven): 5% foetaal kalfsserum (FCS), 1% insuline-transferrine-selenium (ITS), 100 U/mL penicilline, 100 mg/mL streptomycine, 10 ng/mL transformeren groeifactor bèta (TGF-b3), ascorbinezuur van 50 mg/mL 10 ng/mL BMP2, 0,1 mM dexamethason en 1 mM natrium pyruvaat.
    2. Eerste cultuur een enkelgelaagde voor O9-1 cellen met osteogenic media voor 3 dagen en dan trypsinize en cultuur een micromass indeling in chondrocyten differentiatie media voor een extra 7 dagen.
    3. Ezels chondrogenic differentiatie met Alcian blauw kleuring of markers van chondrocyten.
  3. Differentiatie van cellen O9-1 in de zachte spiercellen
    1. Ter voorbereiding van gladde spieren cel differentiatie media, Verdun de volgende in DMEM (eindconcentraties zijn aangegeven): 100 U/mL penicilline, 100 µg/mL streptomycine, en 10% FBS.
    2. Glad spierweefsel celdifferentiatie ezels met immunofluorescentie kleuring met behulp van antilichamen tegen markers van zachte spiercellen, zoals de gladde spieren actine (SMA), weergegeven als een voorbeeld in Figuur 5.
  4. Differentiatie van O9-1 cellen in gliacellen
    1. Ter voorbereiding van gliale cel differentiatie media, Verdun de volgende in DMEM/F12 (eindconcentraties zijn aangegeven): 1 x B-27 supplement, 2 mM L-glutamine, 50 ng/mL BMP2, 100 U/mL penicilline, 100 mg/mL streptomycine, 50 ng/mL LIF en 1% warmte-geïnactiveerd FBS.
    2. Evalueren gliale celdifferentiatie door immunofluorescentie kleuring met antilichamen tegen gliale cel markeringen zoals vetzuur bindend-proteïne 7 (FABP7) uit te voeren.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Het doel van onze vechtpartij en knockoutstadia experimenten was het bestuderen van de effecten van Yap en Taz -van-verliesfunctie in O9-1 cellen. Voordat de vechtpartij en knockoutstadia experimenten moeten we ervoor zorgen dat voor basale media en cultuur O9-1 cellen bereiden zoals hierboven beschreven (bijvoorbeeld kelder membraan matrix behoeften te dekken de gehele plaat zoals afgebeeld in Figuur 1en O9-1 cellen hersteld van vloeibare s...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

De NCC is een veelzijdige en belangrijke bijdrage aan de verschillende weefsels en organen tijdens de embryonale morfogenese. De regel van de cel O9-1 onderhoudt zijn potentieel om te differentiëren in vele verschillende soorten cellen en bootst de kenmerken in vivo van NCCs, waardoor het een nuttig in vitro -hulpmiddel voor de studie van genfuncties en moleculaire verordening in NCCs. De verschillende status van O9-1 cellen kan komen overeen met verschillende neurale crest nakomelingen in vivo...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

Nicole Stancel, Ph.D., ELS, wetenschappelijke publicaties op de Texas Heart Institute, verleend redactionele steun. Wij danken ook de volgende financieringsbronnen: de American Heart Association nationale Center wetenschapper ontwikkeling Grant (14SDG19840000 naar J. Wang), de 2014 Lawrence Research Award van de Rolanette en de Berdon bot ziekte van Lawrence programma van Texas (naar J. Wang ), en de National Institutes of Health (DE026561 en DE025873 J. Wang, DE016320 en DE019650 naar R. Maxson).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Actieve STO feeder cellenATCCATCC CRL-1503Ook verkrijgbaar in met mitomycin C geïnactiveerde vorm, catalogus # ATCC 56-X
O9-1 muis craniale neurale crest cel lijnMillipore SigmaSCC049
DMEM, hoge glucose, geen glutamineGibco11960-044
DMEM, hoge glucoseHycloneSH30243.01
FBS (foetaal bovien serum)Millipore SigmaES-009-B
Penicilline - streptomycineGibco15140-122
L-glutamine 200 mM (100x)Gibco25030-081
Gelatine van porcine huidSigmaG1890
Trypsine-EDTA 0,25% in HBSSGenesee Scientific25-510
DPBS (Dulbecco's fosfaat gebufferde zoutoplossing) zonder calcium of magnesiumLonza17-512F
MEM niet-essentiële aminozuren (MEM NEAA) 100XxGibco11140-050
Natriumpyruvaat (100 mM)Gibco11360-070
2-MercaptoethanolSigmaM-7522
ESGRO leukemie inhibitoir factor (LIF) 106 unit/mLMillipore SigmaESG1106
Recombinant humaan fibroblast groei factor-basis (rhFGF-basis)R&D Systems233-FB-025
Mitomycin CRoche10107409001
Matrigel matrixCorning356234
DMSO (dimethylsulfoxide)Millipore SigmaMX1458-6
Lipofectamine RNAiMAXThermo Fisher Scientific13778-075
Opti-MEM I (1x)Gibco31985-070
Minimum essentieel medium, alpha 1x met Earle's zouten, ribonucleosiden, deoxyribonucleosiden, & L-glutamineCorning10-022-CV
ON-TARGETplus Wwtr1 siRNADharmaconL-041057
ON-TARGETplus Non-targeting PoolDharmaconD-001810
ON-TARGETplus Yap1 siRNADharmaconL-046247
FCS (foetaal kalfs serum)
ITS (insuline-transferrine-selenium)
TGF-b3
Ascorbinezuur
BMP2 (botmorfogenetisch proteïne 2)
Dexamethason
B-27 supplement

Referenties

  1. Achilleos, A., Trainor, P. A. Neural crest stem cells: discovery, properties and potential for therapy. Cell Research. 22 (2), 288-304 (2012).
  2. Le Douarin, N. M., Dupin, E. Multipotentiality of the neural crest. Current Opinion in Genetics and Development. 13 (5), 529-536 (2003).
  3. Santagati, F., Rijli, F. M. Cranial neural crest and the building of the vertebrate head. Nature Reviews. Neuroscience. 4 (10), 806-818 (2003).
  4. Cordero, D. R., et al. Cranial neural crest cells on the move: their roles in craniofacial development. American Journal of Medical Genetics. Part A. 155 (2), 270-279 (2011).
  5. Trainor, P. A. Craniofacial birth defects: The role of neural crest cells in the etiology and pathogenesis of Treacher Collins syndrome and the potential for prevention. American Journal of Medical Genetics. Part A. 152 (12), 2984-2994 (2010).
  6. Bronner, M. E., Simoes-Costa, M. The neural crest migrating into the twenty-first century. Current Topics in Developmental Biology. , 115-134 (2016).
  7. Zurkirchen, L., Sommer, L. Quo vadis: tracing the fate of neural crest cells. Current Opinion in Neurobiology. 47, 16-23 (2017).
  8. Sauka-Spengler, T., Bronner-Fraser, M. A gene regulatory network orchestrates neural crest formation. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 9 (7), 557-568 (2008).
  9. Knecht, A. K., Bronner-Fraser, M. Induction of the neural crest: a multigene process. Nature Reviews. Genetics. 3 (6), 453-461 (2002).
  10. Steventon, B., Carmona-Fontaine, C., Mayor, R. Genetic network during neural crest induction: from cell specification to cell survival. Seminars in Cell and Developmental Biology. 16 (6), 647-654 (2005).
  11. Raible, D. W. Development of the neural crest: achieving specificity in regulatory pathways. Current Opinion in Cell Biology. 18 (6), 698-703 (2006).
  12. Dupin, E., Sommer, L. Neural crest progenitors and stem cells: from early development to adulthood. Developmental Biology. 366 (1), 83-95 (2012).
  13. Henion, P. D., Weston, J. A. Timing and pattern of cell fate restrictions in the neural crest lineage. Development. 124 (21), 4351-4359 (1997).
  14. Harris, M. L., Erickson, C. A. Lineage specification in neural crest cell pathfinding. Developmental Dynamics. 236 (1), 1-19 (2007).
  15. Luo, R., Gao, J., Wehrle-Haller, B., Henion, P. D. Molecular identification of distinct neurogenic and melanogenic neural crest sublineages. Development. 130 (2), 321-330 (2003).
  16. Betters, E., Liu, Y., Kjaeldgaard, A., Sundstrom, E., Garcia-Castro, M. I. Analysis of early human neural crest development. Developmental Biology. 344 (2), 578-592 (2010).
  17. Yang, S. Y., Beavan, M., Chau, K. Y., Taanman, J. W., Schapira, A. H. V. A human neural crest stem cell-derived dopaminergic neuronal model recapitulates biochemical abnormalities in GBA1 mutation carriers. Stem Cell Reports. 8 (3), 728-742 (2017).
  18. Ishii, M., et al. A stable cranial neural crest cell line from mouse. Stem Cells and Development. 21 (17), 3069-3080 (2012).
  19. Yumoto, K., et al. TGF-beta-activated kinase 1 (Tak1) mediates agonist-induced Smad activation and linker region phosphorylation in embryonic craniofacial neural crest-derived cells. Journal of Biological Chemistry. 288 (19), 13467-13480 (2013).
  20. Wang, J., et al. Yap and Taz play a crucial role in neural crest-derived craniofacial development. Development. 143 (3), 504-515 (2016).
  21. Heallen, T., et al. Hippo pathway inhibits Wnt signaling to restrain cardiomyocyte proliferation and heart size. Science. 332 (6028), 458-461 (2011).
  22. Wang, J., Martin, J. F. Hippo pathway: An emerging regulator of craniofacial and dental development. Journal of Dental Research. 96 (11), 1229-1237 (2017).
  23. Pan, D. The hippo signaling pathway in development and cancer. Developmental Cell. 19 (4), 491-505 (2010).
  24. Xiao, Y., Leach, J., Wang, J., Martin, J. F. Hippo/Yap signaling in cardiac development and regeneration. Current Treatment Options in Cardiovascular Medicine. 18 (6), 38(2016).
  25. Yu, F. X., Meng, Z., Plouffe, S. W., Guan, K. L. Hippo pathway regulation of gastrointestinal tissues. Annual Review of Physiology. 77, 201-227 (2015).
  26. Fu, V., Plouffe, S. W., Guan, K. L. The Hippo pathway in organ development, homeostasis, and regeneration. Current Opinion in Cell Biology. 49, 99-107 (2017).
  27. Moya, I. M., Halder, G. The Hippo pathway in cellular reprogramming and regeneration of different organs. Current Opinion in Cell Biology. 43, 62-68 (2016).
  28. Piccolo, S., Dupont, S., Cordenonsi, M. The biology of YAP/TAZ: hippo signaling and beyond. Physiological Reviews. 94 (4), 1287-1312 (2014).
  29. Bauer, D. E., Canver, M. C., Orkin, S. H. Generation of genomic deletions in mammalian cell lines via CRISPR/Cas9. Journal of Visual Experiments : JoVE. (95), e52118(2015).
  30. Ran, F. A., et al. Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Nature Protocols. 8 (11), 2281-2308 (2013).
  31. Manderfield, L. J., et al. Hippo signaling is required for Notch-dependent smooth muscle differentiation of neural crest. Development. 142 (17), 2962-2971 (2015).
  32. Hindley, C. J., et al. The Hippo pathway member YAP enhances human neural crest cell fate and migration. Scientific Reports. 6, 23208(2016).
  33. Nejigane, S., Haramoto, Y., Okuno, M., Takahashi, S., Asashima, M. The transcriptional coactivators Yap and TAZ are expressed during early Xenopus development. International Journal of Developmental Biology. 55 (1), 121-126 (2011).
  34. Grefte, S., Vullinghs, S., Kuijpers-Jagtman, A. M., Torensma, R., Von den Hoff, J. W. Matrigel, but not collagen I, maintains the differentiation capacity of muscle derived cells in vitro. Biomedical Materials. 7 (5), 055004(2012).
  35. Kang, B. J., et al. Effect of matrigel on the osteogenic potential of canine adipose tissue-derived mesenchymal stem cells. Journal of Veterinary Medical Science. 74 (7), 827-836 (2012).
  36. Uemura, M., et al. Matrigel supports survival and neuronal differentiation of grafted embryonic stem cell-derived neural precursor cells. Journal of Neuroscience Research. 88 (3), 542-551 (2010).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Erratum


Formal Correction: Erratum: Culturing and Manipulation of O9-1 Neural Crest Cells
Posted by JoVE Editors on 11/30/2018. Citeable Link.

An erratum was issued for: Culturing and Manipulation of O9-1 Neural Crest Cells. The Protocol section was updated.

Step 2.1 was updated from:

Prepare basal media for O9-1 cell culture by adding the following in DMEM (final concentrations are indicated): 15% FBS, 0.1 mM minimum essential media (MEM) nonessential amino acids, 1 mM sodium pyruvate, 55 mM beta-mercaptoethanol, 100 U/mL penicillin, 100 U/mL streptomycin, 2 mM L-glutamine, 103 units/mL leukemia inhibitory factor (LIF; added immediately before use, do not add to stock bottle), and 25 ng/mL fibroblast growth factor-basic (bFGF; added immediately before use, do not add to stock bottle).

to:

Prepare basal media for O9-1 cell culture by adding the following in DMEM (final concentrations are indicated): 15% FBS, 0.1 mM minimum essential media (MEM) nonessential amino acids, 1 mM sodium pyruvate, 55 µM beta-mercaptoethanol, 100 U/mL penicillin, 100 µg/mL streptomycin, 2 mM L-glutamine, 103 units/mL leukemia inhibitory factor (LIF; added immediately before use, do not add to stock bottle), and 25 ng/mL fibroblast growth factor-basic (bFGF; added immediately before use, do not add to stock bottle).

Step 5.1.1 was updated from:

To prepare osteogenic differentiation media, dilute the following in alpha-MEM (final concentrations are indicated): 0.1 mM dexamethasone, 100 ng/mL bone morphogenetic protein 2 (BMP2), 50 µg/mL ascorbic acid, 10 mM b-glycerophosphate, 10% FBS, 100 U/mL penicillin, and 100 mg/mL streptomycin.

to:

To prepare osteogenic differentiation media, dilute the following in alpha-MEM (final concentrations are indicated): 0.1 µM dexamethasone, 100 ng/mL bone morphogenetic protein 2 (BMP2), 50 µg/mL ascorbic acid, 10 mM b-glycerophosphate, 10% FBS, 100 U/mL penicillin, and 100 µg/mL streptomycin.

Step 5.2.1 was updated from:

To prepare chondrocyte differentiation media, dilute the following in alpha-MEM (final concentrations are indicated): 5% fetal calf serum (FCS), 1% insulin-transferrin-selenium (ITS), 100 U/mL penicillin, 100 mg/mL streptomycin, 10 ng/mL transforming growth factor beta (TGF-b3), 50 mg/mL ascorbic acid, 10 ng/mL BMP2, 0.1 mM dexamethasone, and 1 mM sodium pyruvate.

to:

To prepare chondrocyte differentiation media, dilute the following in alpha-MEM (final concentrations are indicated): 5% fetal calf serum (FCS), 1% insulin-transferrin-selenium (ITS), 100 U/mL penicillin, 100 µg/mL streptomycin, 10 ng/mL transforming growth factor beta (TGF-b3), 50 µg/mL ascorbic acid, 10 ng/mL BMP2, 0.1 µM dexamethasone, and 1 mM sodium pyruvate.

Step 5.4.1 was updated from:

To prepare glial cell differentiation media, dilute the following in DMEM/F12 (final concentrations are indicated): 1x B-27 supplement, 2 mM L-glutamine, 50 ng/mL BMP2, 100 U/mL penicillin, 100 mg/mL streptomycin, 50 ng/mL LIF, and 1% heat-inactivated FBS.

to:

To prepare glial cell differentiation media, dilute the following in DMEM/F12 (final concentrations are indicated): 1x B-27 supplement, 2 mM L-glutamine, 50 ng/mL BMP2, 100 U/mL penicillin, 100 µg/mL streptomycin, 50 ng/mL LIF, and 1% heat-inactivated FBS.

Meer artikelen verkennen

O9-1 cellencelkweekbasale membraanmatrixgeconditioneerd mediumCRISPR-Cas9siRNA knockdownosteogene differentiatiegladspierdifferentiatieYap Taz
Kweken en manipulatie van O9-1 neurale kamcellen
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.