Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Visualiseren van Drosophila been Motor Neuron axonen via de volwassen cuticula

9.4K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/58365

⸱

30 oktober 2018

 ,  ,  ,  , 
1Institut de Génomique Fonctionnelle de Lyon, ENS de Lyon, CNRS, 2Departments of Biochemistry and Molecular Biophysics, and Neuroscience, Mortimer B. Zuckerman Mind Brain Behavior Institute, Columbia University, 3Neuroscience Program, NYU School of Medicine

In dit artikel

Samenvatting

Hier beschrijven we een protocol om te visualiseren de axonale richt met een TL proteïne in volwassen benen van Drosophila door fixatie, montage, imaging en na imaging stappen.

Samenvatting

Het merendeel van de werkzaamheden op de neuronale specificatie is in genetisch en fysiologisch hanteerbare modellen zoals Cuitgevoerd. elegans Drosophila larven en vis, die alle golvend bewegingen (zoals kruipen of zwemmen) deelnemen als hun primaire wijze van voortbewegen. Echter een meer verfijnd begrip van de individuele motor neuron (MN) specificatie — ten minste op het gebied van de voorlichting van ziekte therapieën — vraagt om een even hanteerbare systeem dat beter de motoriek van complexe aanhangsel gebaseerde regelingen van modellen gewervelde dieren. Het volwassen Drosophila bewegingsstelsel belast met wandelen voldoet aan al deze criteria met gemak, aangezien in dit model is het mogelijk om te bestuderen van de specificatie van een klein aantal gemakkelijk DN been MNs (ongeveer 50 MNs per poot) beide met behulp van een enorme matrix van krachtige genetische hulpmiddelen, en in de fysiologische context van een aanhangsel gebaseerde locomotion-regeling. Hier beschrijven we een protocol om te visualiseren het been spier innervatie arm in een volwassen vlieg.

Inleiding

Zoals de gewervelde ledematen, is de Drosophila volwassen poot onderverdeeld in segmenten. Elk vliegen been bevat 14 spieren, die bestaat uit meerdere spiervezels1,2. De organen van de cel van de volwassen been MNs bevinden zich in de T1 (prothoracic), (mesothoracic) T2 en T3 (metathoracic) ganglia aan elke kant van het ventrale zenuw snoer (VNC), een structurele analoog aan het gewervelde ruggenmerg (Figuur 1). Er zijn ongeveer 50 MNs in elke ganglia, welk doel spieren in vier segmenten van de ipsilaterale poot (coxa, trochanter, femur en tibia) (Figuur 1)3. Nog belangrijker is, heeft elke individuele volwassen been MN een unieke morfologische identiteit die is zeer stereotiep tussen dieren3,4. Alle deze unieke MNs zijn afgeleid van de 11 cellen van de stam, genaamd neuroblasten (NBs) been MNs produceren tijdens de larvale stadia3,4. Aan het einde van de larvale stadia van alle onderscheiden de onrijpe postmitotic MNs tijdens de metamorfose hun specifieke dendritische arbors en axonale terminal doelen die bepalen van hun unieke morfologie3,4te verwerven. Eerder testten we de hypothese dat een combinatorische code van transcriptiefactoren (TFs) Hiermee geeft u de unieke morfologie van elk Drosophila volwassen been MN5. Als een model, we gebruikten lineage B, één van de 11 NB lineages die zeven van de MNs produceert en aangetoond dat een combinatorische code van TFs uitgedrukt in postmitotic volwassen been MNs dicteert hun individuele morphologies. Door reprograming van de code van de TF van MNs is ons gelukt om over te schakelen van MN morphologies op een voorspelbare wijze. We noemen deze TFs: MTF's (morfologische TFs)5.

Een van de meest uitdagende onderdelen van de morfologische analyses van volwassen MNs is het visualiseren van de axonen door middel van een dikke en auto-belichting fluorescerende schubbenlaag met hoge resolutie. We meestal label axonen met een membraan-gelabeld GFP die wordt uitgedrukt in MNs met een binaire expressie systemen, zoals DVglut-Gal4/UAS-mCD8::GFP of DVglut-QF / QUAS mCD8::GFP, waar DVglut is een sterke driver uitgedrukt in motoneurons6. Door deze hulpmiddelen te combineren met andere klonen technieken zoals mozaïek analyse met een repressible marker (MARCM)7, cis-MARCM8of MARCMbow5, kunnen we de expressie GFP subpopulaties van MNs maken de fenotypische analyse beperken van axonen gemakkelijker. We hebben een protocol gegenereerd zodat been MN axonale morfologie intact voor beeldvorming en de daaropvolgende 3D reconstructie door het aanpakken van specifieke problemen inherent is aan de volwassen Drosophila been zoals (1) fixatie van de interne structuren van de volwassen poot zonder axon morfologie, endogene fluorescerende expressie, en been spieren, (2) montage van de poot voor het behoud van de algehele structuur onder een dekglaasje aan en in de juiste richting voor beeldvorming, en (3) beeldverwerking te verkrijgen van de epidermis achtergrond evenals axonale fluorescent signaal. Terwijl dit protocol heeft voor het opsporen van fluorescerende expressie in MN axonen zijn gedetailleerd, kan het worden toegepast om te visualiseren van andere onderdelen van been neuromusculature bij geleedpotigen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

1. been dissectie en fixatie

  1. Neem een multi goed glasplaat en vul de juiste aantal putjes met 70% ethanol. Toevoegen van 15 – 20 CO2-narcose vliegen (van hetzij geslacht en elke leeftijd) aan elk goed en met behulp van een penseel, zachtjes schar de vliegen in de ethanol oplossing tot vliegen zijn volledig ondergedompeld.
    Opmerking: Deze stap is het verwijderen van de hydrophobicity van de cuticle bestaat. Niet wassen voor meer dan 1 min, want dit auto-fluorescentie van de cuticle bestaat verhoogt.
  2. Spoel de vliegen 3 keer met 0,3% nonionic oppervlakteactieve stof schoonmaakmiddel in 1 x fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS). Houd de vliegen in deze oplossing voor minstens 10 min.
    Opmerking: Zijn benen beter vast wanneer met inbegrip van wasmiddel, die waarschijnlijk zal toenemen van penetratie van de fixeerspray binnen het been.
  3. Plaats een multi goed plaat op het ijs samen met een buis van 4% paraformaldehyde (PFA).
    Opmerking: De voorbereiding van vers 4% PFA van een 16% PFA ethanol gratis stamoplossing is van cruciaal belang.
  4. Gebruik pincet te verwijderen van het hoofd en buik van de vliegen zonder beschadiging van het thoracale segment of de benen.
    Opmerking: Het verwijderen van de buik gemakkelijker te houden van de vlieg en het ontleden van de benen.
  5. Ontleden van de benen uit het thoracale segment met een tang en plaats de benen in de putjes met 4% PFA. Duw zachtjes maar stevig op de kruising van de coxa-thorax met het puntje van fijne pincet totdat het been los hiervoor.
  6. Corrigeer de benen in 4% PFA overnacht bij 4 ° C (ongeveer 20 h totaal).
  7. Wassen van de benen met 0,3% nonionic oppervlakteactieve stof schoonmaakmiddel in 1 x PBS, 5 x voor 20 minuten elk.
  8. Vervang de buffer wassen met montage medium. Houd het been montage medium voor ten minste een dag voorafgaand aan de montage te maken voor haar volledige penetratie in het been.
    Opmerking: Als het medium van de montage zeer viskeuze is, Verdun de montage middellange tot 80% met 1 x PBS omdat de plotselinge verandering in de viscositeit de cuticle samenvouwen en de algehele structuur van het been schade kan veroorzaken. Afhankelijk van het stuurprogramma Gal4 , kunnen vliegen worden bewaard voor 1 tot 3 weken bij 4 ° C in de montage media tot montage.

2. leg montage

  1. Plaats ongeveer 20 µL 70% glycerol aan de linkerkant van een microscoopglaasje en dek met een vierkante 22 x 22 mm2 dekglaasje aan (figuur 2A, B). Pipetteer ongeveer 10 µL van montage medium langs een lijn parallel aan en op een kleine afstand van de rechterrand van deze dekglaasje aan. Voeg een andere 30 µL van montage medium verder aan de rechterkant van de dia (figuur 2C).
    Opmerking: Bij de toepassing van een dekglaasje aan over de benen (zie hieronder) het montage medium zal zachtjes verspreid onder het dekglaasje aan en rond de benen zonder hen.
  2. Met behulp van fijne pincet heffen van het been van de oplossing en zet het zachtjes op de drager van de montage in de buurt van de linker dekglaasje aan. Doe hetzelfde voor elk been en lijnen van boven naar beneden (figuur 2D).
    1. Heffen en breng de benen in een druppel medium gehouden tussen beide uiteinden van de verlostang. Oriënteren van de benen op twee manieren: externe kant omhoog of omlaag.
  3. Zodra alle de benen (max. 6 – 8 benen kunnen worden gemonteerd) op de juiste manier worden uitgelijnd, zet een tweede dekglaasje aan over de benen zodat deze dekglaasje aan iets op het eerder geplaatste dekglaasje aan (figuur 2E berust) te maken voor de ruimte tussen het dekglaasje aan en het weefsel en voorkomen dat de benen van krijgen beschadigd (Figuur 2 g).
    Opmerking: Gebruik als alternatief sticker putten of orthodontische wax om ruimte tussen het dekglaasje aan en de dia te maken.
  4. Gebruik een nagellak teneinde de positie van de coverslips op elke hoek (figuur 2F).
    Opmerking: Het weefsel is nu klaar om het imago.

3. beeldvorming

  1. Instellen van een track met behulp van de 488 nm laser en twee detectoren tegelijkertijd zowel het GFP fluorescentie en de cuticula auto-fluorescentie te verkrijgen. Met behulp van de controle van het bereik of de schuifregelaar weergave in de spectrale venster van het lichtpad venster van de software, instellen het detectiebereik van één detector (detector 1) tussen 498 – 535 nm en die van de andere (detector 2) tussen 566-652 nm
    Opmerking: Doorgaans de detector 1 moet een detector GaAsP en de detector 2 een fotomultiplicator. Het kanaal van 498-535 optimaal detecteert GFP signaal maar ook detecteert automatisch fluorescentie van de epidermis. Het kanaal van 566-652 detecteert echter alleen de auto fluorescentie van de cuticle (figuur 3A).
  2. Gebruikt u een 20 X of 25 X olie onderdompeling doelstelling, resolutie van 1024 x 1024 pixels, 12-bit diepte en Z afstand instellen zoals 1 µm. Set pixel Nadruktijd tijd als ongeveer 1.58 µs en gemiddelde 2 frames/afbeelding. Doelstellingen met hoge numerieke diafragma hanteren.
  3. Stel alle andere instellingen, afhankelijk van de confocal microscoop en imaging software wordt gebruikt.
    1. Zorg ervoor om het verkrijgen van een helderder signaal van de epidermis van de detector 566-652 in plaats van de detector van 498 – 535. Om dit te doen, gebruik de dezelfde kracht van de laser van de 488-laser voor beide detectoren. Eerst de winst van de detector 1 te verkrijgen van een helder genoeg GFP-signaal (figuur 3B, D) met behulp van de markers van verzadiging, aanpassen. Pas vervolgens de winst van de detector 2 om ervoor te zorgen dat bepaalde gebieden met hoge cuticula signaal (randen van benen, gewrichten) een verzadigde signaal in deze detector (Figuur 3 c, E produceren).
    2. Als het been is uitgebreid en te groot is om het image worden gemaakt in een enkel frame, optie tegel of positie van de Microscoop denkbaar software.
  4. Reconstrueren de laatste beelden hetzij met behulp van de gepatenteerde Microscoop denkbaar software of het gebruik van ImageJ/FIJI freeware (zie hieronder).

4. post Processing Imaging

  1. Open de confocal stack in ImageJ/FIJI.
    1. Gebruik de Bioformats-plugin (Plugins | Bio-formaten | Bio-formats-importeur) in FIJI te openen van afbeeldingen die niet in. TIF-formaat van merkgebonden imaging software pakketten9.
  2. De kanalen splitsen door het selecteren van de afbeelding | Kleur | Kanalen splitsen.
    Opmerking: Als de beelden vanuit verschillende posities werden gemaakt en moeten worden gerecombineerde, gebruiken de paarsgewijze stiksels plugin in FIJI van (Plugins > Stitching > paarsgewijs Stitching)10,11.
  3. Als u wilt aftrekken van het signaal van de epidermis van het GFP-signaal, open de afbeelding rekenmachine (proces | Afbeelding Calculator): Selecteer de stack in detector 1 als afbeelding 1 (GFP + schubbenlaag) (figuur 4A), selecteer aftrekkenop het operatie-venster en selecteer de stack in detector 2 als afbeelding 2 (schubbenlaag) (figuur 4B). Dientengevolge, wordt alleen het endogene GFP signaal (GFP) (figuur 4C) verkregen.
    1. Samenvoegen terug deze stapel (GFP) met de 'cuticula-only' stack verkregen detector 2 (figuur 4B afbeelding | Kleur | Kanalen verenigen) om een RGB-beeld bestaat uit het weefsel-specifieke GFP signaal evenals de cuticula signaal, dat helpt identificeren van de axon arbors binnen het been segmenten (Figuur 4 d).
    2. Contrast en helderheid van elke image (beeld | Aanpassen | Brightness/Contrast) en genereer vervolgens een één RGB-afbeelding (afbeelding | Type | RGB-kleur).
      Opmerking: Voor het genereren van een maximale projectie van de Z-stack (afbeelding | Stapels | Z Project...), maximale intensiteit projectie gebruiken voor het GFP-signaal en de gemiddelde intensiteit van de epidermis, die vervolgens kan worden aangepast voor helderheid voorafgaand aan het samenvoegen van de twee kanalen.
  4. U kunt ook een macro gebruiken voor automatische aftrekken, en de verwerking van beelden in ImageJ/FIJI. Kopieer de tekst in aanvullende bestand 1 in de macro editor (Plugins | Nieuw | Macro), de macro opslaan in de map Plugins en ImageJ/FIJI eenmaal om de macro te kunnen starten.
    1. Als u de macro, open de confocal stack, en open het venster Helderheid/Contrast (Image| Aanpassen | Brightness/Contrast). Daarna de macro uitvoert (Plugin | Macro | Stormloop) en volg de instructies.
    2. Wanneer u wordt gevraagd om op te geven van de werking (afbeeldingsvenster rekenmachine), kies Afbeelding 1 stapel 1 (GFP), afbeelding 2 stapel 2 (schubbenlaag) en aftrekken.
      Opmerking: De macro genereert een maximale projectie-beeld van het verwerkte GFP-signaal (MAX_Result van stack1), een gemiddelde projectie van de cuticle (AVG_stack2), het resultaat van het aftrekken van de stack van de epidermis van het GFP-stack (resultaat van stack1), en de onverwerkte Cuticula stack (stack2).
    3. Wanneer u wordt gevraagd om aan te passen contrast, gebruik de besturingselementen in het venster/helderheid aanpassen van de helderheid/contrast van de afbeelding van de maximale projectie van GFP, en de gemiddelde projectie van de cuticle bestaat, voor het genereren van een RGB-samengevoegde afbeelding van beide signalen waaruit blijkt het GFP in groen en de epidermis in grijs. Samengevoegd resultaat van stack1, en stack2, ook het genereren van een gecombineerde GFP en cuticula stack die kan worden gebruikt in de volgende fase.
  5. Om te visualiseren de benen in drie dimensies, door gespecialiseerde 3D software te gebruiken met de nieuw gegenereerde stacks (figuur 4E).
    1. Open de RGB-stack met 3D software (Zie Tabel van materialen). In het pop-up venster, selecteer alle kanalen in de modus conversie sectie en de grootte opgeven van een voxel (deel van een pixel).
      Opmerking: Alle nodige informatie is opgenomen in de afbeeldingsbestanden vanuit welke merkgebonden Microscoop software wordt gebruikt.
    2. Op kanaal 2 module (GFP signaal), klik met de rechtermuisknop en selecteer Display | volren. Klik vervolgens met de linkermuisknop op de volren module. In de sectie eigenschappen (linksonder in het scherm) klikt u op links op bewerken en selecteer volrengreen.col. Op kanaal 1 module (schubbenlaag signaal) met de rechtermuisknop op en selecteer Display | volren. Klik vervolgens met de linkermuisknop op de volren module. In de sectie Properties Klik met de linkermuisknop op Geavanceerd en selecteer ddr (een transparante radiografie-achtige scherm), vervolgens aanpassen de gammawaarde om te zien de cuticula achtergrond (figuur 4E).
    3. Voor het genereren van een 3D-rotatie, klik met de rechtermuisknop op de stapel van de projectmodule. Selecteer vervolgens animeren | draaien. Klik met de linkermuisknop op de draaien module.
    4. In de Eigenschappen sectie Klik op bbox center gebruiken. Op de draaien module met de rechtermuisknop op en selecteer berekenen | film maker. Klik op de film maker -module op de linker mouse button. Klik in de sectie Eigenschappen met de linkermuisknop links op Geavanceerd (rechtsboven van de sectie-eigenschappen).
    5. Vul in het veld bestandsnaam de naam van de rotatie van de film. Schrijf 1 (max kwaliteit) op het gebied van kwaliteit . Frame bij 200 verlaten indien een 8.3 s rotatie is gewenst (dit nummer kan worden verlaagd of verhoogd om te wijzigen van de snelheid van de rotatie). Drukt u vervolgens op toepassen (groene knop, linksonder in de sectie eigenschappen (Zie Video 1)).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Zoals blijkt uit Figuur 4, kunnen deze procedure uitstekende beeldvorming van GFP-geëtiketteerden axonen in volwassen Drosophila benen, samen met hun terminal arbors. Nog belangrijker is wordt een schone GFP-signaal verkregen zonder elke besmetting van de fluorescentie die wordt uitgestraald door de cuticle been. Het signaal van de cuticle kan dan worden gecombineerd met het GFP-signaal om te identificeren de positie van axonen in de benen (

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

De schubbenlaag van volwassen Drosophila en andere geleedpotigen, waarin vele donkere pigmenten, is een groot obstakel voor het bekijken van de structuren in hun lichaam. Het is bovendien sterk auto TL, die wordt verergerd door fixatie. Deze twee functies zijn zeer problematisch voor waarnemingen van fluorescente kleurstoffen of moleculen in het lichaam van dieren met een exoskelet.

De procedure die we hebben beschreven en die we regelmatig gebruiken in het lab levert schoon en gedetailleerde ...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

We bedanken Robert Renard voor het opstellen van vliegen voedsel medium. Dit werk werd ondersteund door een NIH-subsidie NS070644 voor R.S.M. en financiering uit ALS vereniging (#256), FRM (#AJE20170537445) en ATIP-Avenir programma aan J.E.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

```html
Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Ethanol absoluteFisherE/6550DF/17Absolute analytische reagentiakwaliteit
Niet-ionogene oppervlakteactieve stof detergentSigma-AldrichT8787Triton X-100, voor moleculaire biologie
Fijne pincettenSigma-AldrichF6521Juwelierspinnen, Dumont Nr. 5
Glas multi-well plaatElectron Microscopy Sciences71563-019 holtes Pyrex, 100 mm x 85 mm
PFAThermofisher28908Pierc 16% Formaldehyde (w/v), Methanol-vrij
GlycerolFisher BioReagentsBP 229-1Glycerol (Moleculair Biologie)
SpacersSun Jin Lab CoIS006iSpacer, vier putjes, ongeveer 12 μL werkvolume per putje, 7 mm diameter, 0,18 mm diep
Vierkante 22 mm x 22 mm dekglasjesFisher ScientificFIS#12-541-BNr.1.5-0.16 tot 0.19 mm dik
MontagemediumVector LaboratoriesH-1000Vectashield Antifade Montagemedium
Confocale microscoopCarl ZeissLSM780; objectief gebruikt LD LCI Plan-Apochromat
25X/0.8 Imm Korr DIC M27 (olie/
silicon/glycerol/water
onderdompeling) (420852-9871-000)
BeeldvormingssoftwareCarl ZeissZEN 2011
3D-BeeldsoftwareThermoFisher ScientificAmira 6.4
ImageJNational Institutes of Healthhttps://imagej.nih.gov/ij/ImageJ/FIJI
```

Referenties

  1. Miller, A. The internal anatomy and histology of the imago of Drosophila melanogaster. Biology of Drosophila. Demerec, M. , John Wiley & Sons. New York, NY. 420-531 (1950).
  2. Soler, C., Ladddada, L., Jagla, K. Coordinated development of muscles and tendons of the Drosophila leg. Development. 131 (24), 6041-6051 (2004).
  3. Baek, M., Mann, R. S. Lineage and Birth Date Specify Motor Neuron Targeting and Dendritic Architecture in adult Drosophila. Journal of Neuroscience. 29 (21), 6904-6916 (2009).
  4. Brierley, D. J., Rathore, K., VijayRaghavan, K., Williams, D. W. Developmental origins and architecture of Drosophila leg motoneurons. Journal of Comparative Neurology. 520 (8), 1629-1649 (2012).
  5. Enriquez, J., Mann, R. S. Specification of Individual Adult Motor Neuron Morphologies by Combinatorial Transcription Factor Codes. Neuron. 86 (4), 955-970 (2015).
  6. Mahr, A., Aberle, H. The expression pattern of the Drosophila vesicular glutamate transporter: a marker protein for motoneurons and glutamatergic centers in the brain. Gene Expression Patterns. 6 (3), 299-309 (2006).
  7. Lee, T., Luo, L. Mosaic analysis with a repressible cell marker (MARCM) for Drosophila neural development. Trends in Neuroscience. 24 (5), 251-254 (2001).
  8. Enriquez, J., Rio, L. Q., Blazeski, R., Bellemin, S., Godement, P., Mason, C. A., Mann, R. S. Differing Strategies Despite Shared Lineages of Motor Neurons and Glia to Achieve Robust Development of an Adult Neuropil in Drosophila. Neuron. 97 (3), 538-554 (2018).
  9. ImageJ. Bio-Formats. , Available from: http://imagej.net/Bio-Formats (2018).
  10. ImageJ. Image Stitching. , Available from: http://imagej.net/Image_Stitching (2018).
  11. Preibisch, S., Saalfeld, S., Tomancak, P. Globally optimal stitching of tiled 3D microscopic image acquisitions. Bioinformatics. 25 (11), 1463-1465 (2009).
  12. Brierley, D. J., Blanc, E., Reddy, O. V., Vijayraghavan, K., Williams, D. W. Dendritic targeting in the leg neuropil of Drosophila: the role of midline signalling molecules in generating a myotopic map. PLoS Biology. 7 (9), e1000199(2009).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Meer artikelen verkennen

AxonvisualisatieCuticulabeeldingConfocale MicroscopieGFP-signaaldetectie3D-reconstructieProtocol voor het Monteren van PotenFluorescerende ProteïnebeeldingSpecificatie van MotorneuronenAnatomie van de Volwassen Vlieg
Visualiseren van Drosophila been Motor Neuron axonen via de volwassen cuticula
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.