De MUB40 Peptide voor gebruik bij de opsporing van ontsteking neutrofiele-gemedieerde gebeurtenissen

Samenvatting

Hier presenteren we een protocol voor het detecteren van de aanwezigheid van neutrofielen in secties van de histologie vaste/permeabel en beoordelen van de activeringsstatus van levende gezuiverde neutrofielen. In het bijzonder de MUB₄₀ peptide gebonden Lactoferrine in submodules neutrofiele-specifieke en tertiaire aanwezig. Blootstelling van de submodule inhoud via permeabilization of neutrofiele activering zorgt voor de markering van de neutrofielen.

Samenvatting

Wij bieden hier een protocol met betrekking tot het gebruik van MUB₄₀, een gesynthetiseerde peptide met de mogelijkheid om het binden van geglycosyleerde lactoferrine opgeslagen in hoge concentraties in specifieke en tertiaire korrels van neutrofiele granulocyten. De gegevens van dit protocol hoe MUB₄₀ geconjugeerd rechtstreeks met een fluorophore kunnen worden gebruikt om vlek neutrofielen in vaste/permeabel weefsels zo goed hoe dit kan worden gebruikt in het leven-cel imaging om assay voor neutrofiele activering en ambtshalve korreling. Neutrofiele detectiemethoden zijn beperkt tot soortspecifieke monoclonal antilichamen, die niet altijd geschikt voor bepaalde toepassingen zijn. MUB₄₀ doet niet doordringen in het celmembraan en is dus uitgesloten van lactoferrine opgeslagen in niet-geactiveerd/niet-permeabel neutrofiele granulocyten. MUB₄₀ heeft het extra voordeel van de erkenning van lactoferrine uit een brede gastheer, waardoor het vooral handig voor het vergelijken van resultaten in studies meerdere onderzoeksmodellen, waarbij het aantal dubbele reagentia te verminderen, en vereenvoudiging van de protocollen via-voor-stapmodus kleuring.

Inleiding

Neutrofielen zijn een van de belangrijkste takken van het aangeboren immuunsysteem en routinematig worden gerekruteerd voor de sites van ontsteking rond het lichaam. De studie van neutrofielen heeft geschaad grotendeels door hun korte levensduur in vitro (minder dan 8 h) en beperkte detectieprogramma's onder basale omstandigheden of na activering. Hier presenteren we een uitgebreid geteste protocol voor de brede en specifieke detectie van zoogdieren neutrofielen in vaste/permeabel monsters. We bieden ook een gedetailleerd protocol voor live neutrofiele granulocyten met MUB₄₀kleuring. Met behulp van de live neutrofiele kleuring protocol, kunnen het tijdstip en de locatie van neutrofiele activering worden gelokaliseerd. Dit protocol is ideaal voor onderzoekers die willen studeren neutrofiele activering of submodule release. Buiten hun antimicrobiële functies, worden neutrofielen nu gewaardeerd als immunomodulerende cellen betrokken bij een breed scala van ziekten en immuunrespons (aangeboren en adaptief)^1,2. Neutrofielen zijn aanwezig in de meest opruiende weefsels, op hoge aantallen in geïnfecteerde weefsels, inflammatoire tumoren³, tijdens IBS en ziekte van Crohn flare-ups⁴, en op gebied van niet-infectieuze ontstekingen zoals de synovia van reumatoïde artritis ( RA) patiënten⁵. Neutrofielen bevatten vier klassen van pre-gevormde korrels genaamd azurophil (α), specifieke (β1), tertiaire (β2) korrels en secretoire blaasjes (γ)⁶. Na de migratie naar een inflammatoire site, aangeworven neutrofielen worden geactiveerd en opeenvolgend afscheiden submodule inhoud (samengesteld uit hechting, antimicrobiële verbindingen en immunomodulerende moleculen), die bevordert verder werving en draagt bij aan infectie resolutie (maar ook voor host weefselschade)⁷. Terwijl neutrofielen worden beschouwd als een kritiek aspect van aangeboren immuniteit, tot op heden er zijn paar detectie reagentia beschikbaar voor deze bestuderen, en nog minder dat kan worden gebruikt voor het beoordelen van de activeringsstatus van levende neutrofiele granulocyten.

Huidige methoden voor het opsporen van neutrofielen afhankelijk van monoklonale antilichamen tegen celoppervlak blootgestelde antigenen, zoals Ly - 6 G² of eiwitten specifiek opgeslagen in neutrofiele korrels onder basale omstandigheden (bijvoorbeeld myeloperoxidase gegenereerd Lactoferrine). Voordelen van monoclonal antilichamen zijn hun sterke bindende, gevoeligheid en veelzijdigheid onder verschillende omstandigheden van de test. Er zijn echter ook verschillende nadelen aan het gebruik van monoklonale antilichamen en anti-Ly - 6G in het bijzonder. Deze nadelen zijn de specificiteit, zoals Ly - 6G is aanwezig op een meerderheid van myeloïde cellen in het beenmerg en op alle granulocyten met inbegrip van de eosinofielen; zo, neutrofielen van eosinofielen ontcijferen met deze markering vereist meer complexen benaderingen⁸. Een andere frequente afweging met monoklonale antilichamen is hun vaak beperkte host gastheerspecificiteit, waardoor vergelijking studies met meer dan één diersoort omvat moeilijk. Een derde nadeel van antilichaam detectiemethoden, vooral bij het gebruik van levende cellen of in vivo, is hun potentieel voor het verstoren van de functie cel of leiden tot cel activatie. Bijvoorbeeld, is de administratie van anti-Ly - 6G te muizen vaak toegepast op neutrofiele uitputting en voorbijgaande neutropenie⁹. Bovendien is gebleken dat antilichaam injectie neutrofiele antitumorale functie¹⁰kan stimuleren. Tot slot, de opsporing van antilichamen van neutrofielen niet onthullen de activeringsstatus van de cel.

We hebben een 40-amino acid peptide genaamd MUB₄₀, die kan worden gebruikt in een aantal testen om label neutrofielen in vitro of in vivo voorwaarden evenals de activeringsstatus van levende neutrofielen¹¹assay aangemerkt. MUB₄₀ is afgeleid van de MUB₇₀¹², een domein van de Lactobacillus reuteri oppervlakte slijm-bindend-proteïne oorspronkelijk beschreven voor haar vermogen om te binden slijm^13,14. MUB₄₀ interageert met geglycosyleerde lactoferrine die aanwezig is bij hoge concentraties in neutrofiele-specifieke en tertiaire korrels. MUB₄₀ kunt worden blootgesteld aan deze submodules standaard permeabilization stapsgewijs aanwezig in histopathologie of fluorescentie-activated cell sorting (FACS) protocollen voor robuuste kleuring van vaste neutrofiele granulocyten. Wanneer live neutrofielen in een geïnactiveerd staat worden gehouden, de MUB₄₀ peptide is uitgesloten van de inhoud van de submodule en cellen doen geen positieve vlekken met de markering. Na activatie, kan MUB₄₀ binden aan blootgestelde lactoferrine en leiden tot robuuste kleuring met de peptide. Dus, MUB-₄₀ mag worden gebruikt om de activeringsstatus van gezuiverde neutrofiele granulocyten, waardoor het een aantrekkelijke marker om de besmettelijke proces te volgen. Het vermogen om te binden aan het leven van geactiveerde neutrofiele granulocyten kan ook MUB₄₀ worden gebruikt als een instrument om te controleren op gebieden van neutrofiele ontsteking in levende dierlijke modellen (bijvoorbeeld een muis artritis model¹⁵). De protocollen in dit manuscript detail hoe fluorescently label MUB₄₀ kunnen worden gebruikt om te onthullen van de neutrofielen in histologie weefsels en hoe de activering van levende gezuiverde neutrofielen in vitroassay.

Protocol

Alle methoden die hier worden beschreven zijn herzien en goedgekeurd door de Franse organisaties CoRC (Comité de Recherche Clinique), CPP (Comité de Protection des Personnes) en CNIL (Commissie Nationale Informatique et Liberté).

1. vlekken neutrofielen in histopathologie weefsel met Fluorescently geëtiketteerd MUB₄₀

1. Voor het verkrijgen van het weefsel voor histopathologisch onderzoek, vast weefsel/biopsie secties in een geschikt volume van 4% paraformaldehyde (PFA) gedurende 30 minuten tot 4 uur afhankelijk van de dikte van het monster. Leg de monsters in een koelkast 4 ° C tijdens fixatie.
   Opmerking: Alternatieve fixatie methoden/tijdsinstellingen kan worden vervangen op basis van de unieke behoeften van de gebruiker.
   1. De PFA verwijderen, toevoegen van 16% sacharoseoplossing met genoeg volume ter helemaal dekking van het monster en leg het monster bij 4 ° C gedurende 4 h tot overnachting.
   2. 16% sacharoseoplossing verwijderen en toevoegen van 30% sacharoseoplossing op een groot genoeg volume ter helemaal dekking van het monster, en plaats deze bij 4 ° C gedurende 4 h tot overnachting.
   3. Verwijder de 30% sacharoseoplossing en vlek uit overtollige oplossing van het weefsel met een papieren handdoek. Plaats de weefselsectie in optimale scherpe temperatuur (OCT) media en module-freeze in 2-methylbutane gekoeld in een bad van droogijs-ethanol (-72 ° C). Zodra bevroren solide (na ~ 2 min), Verwijder blokken van de 2-methylbutane en leg ze op droog ijs totdat alle blokken afgewerkt en klaar voor langdurige opslag zijn. Winkel de bevroren blokken bij-80 ° C voor langdurige opslag.
2. De nacht voordat weefsel blokken zijn om te worden gesneden, verwijder ze uit de diepvries-80 ° C en plaats ze bij-20 ° C's nachts tot equilibreer.
   1. Met behulp van een cryostaat, OCT-embedded weefsel in 10 - tot 30 μm-dikke plakjes gesneden en adsorberen aan kwalitatief hoogwaardige glazen dia's.
      Opmerking: Afhankelijk van de experimentele vereisten kunnen dikker of dunner segmenten worden gebruikt.
   2. Met een wax pen of andere hydrofobe methode, tekent u een vak rond het weefsel segment op het glasplaatje en laten drogen.
   3. Bereiden de kleurstofoplossing door het uitvoeren van een verdunning 1:1,000 MUB₄₀-Cy5 (of andere tl MUB-versie₄₀, 1 mg/mL stockoplossing) in 0,1% saponine-PBS oplossing. De optimale eindconcentratie voor MUB₄₀ moet 1 μg/mL.
      Opmerking: Lagere eindconcentraties mogen worden gebruikt (0.1-0,01 μg/mL) maar kan leiden tot lagere signaal intensiteit.
      Let op: Saponine poeder kan irritatie van ademhaling. Zorg ervoor dat wegen saponine in een kast of beschermde gebied. Alternatieve permeabilization methoden kunnen worden gebruikt zoals Triton. Extra markeertekens toevoegen bij fabrikant-recommended concentraties (bv., 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI), phalloidin, fluorescerende antilichamen).
   4. Voorzichtig Dompel het glasplaatje in een oplossing van 0,1% saponine-PBS driemaal.
   5. Zorgvuldig blot weg overtollige vocht rond de weefselsectie en genoeg kleurstofoplossing om het volledig bedekt de weefselsectie toevoegen. Plaats de dia in een kamer vochtigheid te voorkomen van verdamping en het Incubeer gedurende 1 uur bij kamertemperatuur. Houd het beschermd tegen licht.
   6. Voorzichtig Dompel de dia in 0,1% saponine-PBS oplossing 3 x. Vervolgens voorzichtig Dompel de dia in PBS oplossing 3 x. Ten slotte, voorzichtig Dompel de dia in gedestilleerd H₂O 3 x. Zorgvuldig droog overtollige vloeistof uit de dia.
   7. Voeg een kleine hoeveelheid (~ 20 μL) van montage medium (20 mM Tris pH 8.0, 0,5% N-propyl gallaat, 90% glycerol) naast het weefsel segment en voorzichtig vast een glas dekglaasje aan bovenop het glasplaatje. Zacht en gelijkmatig druk op het dekglaasje aan op de weefselsectie en, met behulp van een papieren handdoek, verwijder voorzichtig alle montage-media die gesteenten langs de randen van het dekglaasje aan.
   8. Plaats de gekoppelde dia in een donkere kast gedurende 24 uur om de media van de montage te stollen. Als alternatief, plaatst u de gekoppelde dia bij 37 ° C gedurende 1 uur.
3. Het imago van de plakjes weefsel op een fluorescente microscoop volgens de gewenste overname-methode.

2. visualisatie van neutrofiele activering met Retro-Inverso-MUB₄₀-Cy5 Peptide

1. Het verkrijgen van menselijke neutrofiele granulocyten met behulp van de onderstaande voorschriften. Voorbereiding van de volgende oplossingen en plaats ze in een zuurstofvrije kabinet overnachting. Blootstelling aan zuurstof zullen beginnen te activeren van neutrofielen en verdere induceren^16,17van de dood van de cel.
   Opmerking: Neutrofiele granulocyten kunnen ook gezuiverd worden "op de Bank" voor MUB₄₀-labeling experimenten; echter, Let erop dat zuurstof blootstelling beginnen zal te beïnvloeden neutrofiele activering.
   1. Bereid de volgende oplossing:
      Oplossing 1 [natriumchloride (NaCl) 0.9%]: Meng 4.5 g NaCl 500 mL H₂O. Filter de oplossing.
      Oplossing 2 (dextran 6%): 6 g dextran in NaCl 0,9% oplossing toevoegen aan 100 mL.
      Oplossing 3 (wassen buffer): Los ethyleendiamminetetra azijnzuuroplossing (NA2EDTA) in PBS pH 7,2 tot een uiteindelijke concentratie van het EDTA van 2 mM. Onmiddellijk vóór gebruik, ontbinden bovien serumalbumine (BSA) in PBS/EDTA-oplossing zodanig zijn dat de uiteindelijke concentratie van de BSA 10% w/v.
   2. Centrifugeren van bloed collectie buizen bij 650 x g gedurende 20 min zonder pauzes.
   3. Zonder te onderbreken gescheiden bloed, door het bloed collectie buizen te overbrengen in een zuurstofvrije kabinet en verzamelen plasma breuken (boven) in een conische tube van 50 mL.
   4. Verwijder de plasma-bevattende buis uit de zuurstofvrije kabinet en centrifugeer bij 2900 x g gedurende 20 min met pauzes aan de bloedplaatjes pellet.
   5. Zonder de Ingehuld bloedplaatjes verstoren, transfer zachtjes de plasma buis terug in de zuurstofvrije kabinet en Pipetteer de bloedplaatjes arme plasma in een tube van de verse 50 mL (hierna genoemd "plasma").
2. Scheiding van de rode bloedcellen van leukocyten
   1. Met behulp van de buizen met de rode bloedcellen (RBC) uit stap 2.1.3., combineren de RBC in een conische 50 mL-buis (5 bloed collectie buis inhoud per tube 50 mL).
   2. Voeg NaCl 0,9% totdat het totale volume 44 mL bereikt. Voeg 6 mL dextran 6% (laatste).
   3. Meng het mengsel bloed/dextran zachtjes door het omkeren van de buis 10 - 20 keer. Laat het sediment buis voor minstens 30 min.
   4. Terwijl de sedimentatie plaatsvindt, bereiden een Percoll verloop door toevoeging van 4.2 mL van Percoll oplossing aan 5,8 mL plasma in een conische tube van 15 mL en meng goed door het omkeren van de buis.
   5. Het bovenste deel van de dextran verzamelen terwijl het proberen om te voorkomen dat pipetting rode bloedcellen.
   6. Draai de schroefdop, verwijderen de dextran buis uit de zuurstofvrije zaal en centrifugeer de buis bij 300 x g gedurende 10 minuten met pauzes.
   7. Zorgvuldig plaats de buis terug in de zuurstofvrije kamer zonder verstoring van de Ingehuld cellen, en verwijder de vloeistof via pipetteren.
   8. Zachtjes resuspendeer de cel pellet in 1 mL plasma en voeg heel langzaam naar de top van de Percoll oplossing. Wees voorzichtig niet voor het opwekken van de vermenging van de lagen wanneer pipetteren de cellen op de top.
   9. Verwijder voorzichtig de Percoll oplossing buis uit de zuurstofvrije kamer (het vermijden van mengen) en centrifugeer bij 800 x g gedurende 20 min zonder pauzes. Perifere bloed mononucleaire cellen (PBMCs) zal blijven op het oppervlak van de oplossing Percoll en neutrofielen zal pellet met de RBC.
3. Verwijdering van verontreiniging van RBC
   1. Bereiden van 14 mL bufferoplossing te wassen door toevoeging van 700 μL PBS + 10% BSA tot 14 mL buffer te wassen.
   2. Plaats de buis van de oplossing Percoll terug in de zuurstofvrije kamer. Verwijder de Percoll en de PBMCs via pipetteren en resuspendeer de Ingehuld cellen in 1 mL bufferoplossing te wassen. De pellet opnieuw geschorst worden zal een rode kleur als gevolg van contaminerende RBC hebben.
   3. 200 μL van anti-CD235a (glycophorin) magnetische kralen aan het opnieuw gesuspendeerde cellen toevoegen, voorzichtig mengen en incubeer gedurende een minimum van 15 min. Deze stap laadt de besmettende RBC met magnetische kralen zodat ze kunnen worden verwijderd.
   4. Wash de scheiding kolom met 2 mL wassen buffer 3 x.
   5. Houd een conische tube van 15 mL onder de kolom scheiding en Pipetteer langzaam de neutrofiele/RBC mengsel naar de top van de kolom. De cellen in de conische tube van 15 mL verzamelen als ze doorstromen. De doorstroming moet bewolkt en verliezen de rode kleur als gevolg van de RBC resterende gebonden aan de kolom.
   6. Voeg toe 2 mL buffer naar de top van de kolom te wassen en verzamelen in de dezelfde conische tube van 15 mL. Tegen het einde van the wash van 2 mL moet de doorstroming duidelijk zijn, wat betekent dat alle de neutrofielen zijn verzameld.
   7. Meng voorzichtig de buis om te zorgen voor gelijkmatige verdeling van neutrofielen en verzamelen van 10 μL voor het tellen van de cel. Opmerking het eindvolume voor cel tellen van doeleinden. Het totale aantal cellen met een standaard cel tellen methode opsommen
   8. Verwijder de neutrofiele buis uit de zuurstofvrije kamer en centrifugeer de neutrofielen bij 300 x g gedurende 20 min met pauzes.
   9. Gesedimenteerd neutrofielen terug in de zuurstofvrije kamer plaatsen en verwijderen van de buffer wassen via pipetteren. Resuspendeer de pellet neutrofiele in plasma met een maximale celdichtheid van 10⁷ PMN/mL.
4. Opsomming van gezuiverde neutrofielen en visualisatie met MUB₄₀
   1. Voeg 1 μl van RI-MUB₄₀-Cy5 (1 mg/mL) tot 1 mL van Rosewell Park Memorial Instituut (RPMI) 1640 medium zonder fenol rood. Meng door pipetteren goed.
   2. Voor de toepassing van dit protocol, is het resultaat beschreven als een krachtige neutrofiele activeren reagens, N-formylmethionyl-leucyl-fenylalanine (FMLP), is toegevoegd. Voeg 1 μm van FMLP aan de RPMI/RI-MUB₄₀-Cy5 buis en mengeling via pipetteren op en neer.
      Opmerking: Elke experimentele procedure zullen afwijken van dit punt naar voren, afhankelijk van de vragen.
   3. Breng de 1 mL RPMI/RI-MUB₄₀-Cy5/FMLP mengsel een glazen bodem microscopie schotel. Toevoegen aan dit gerecht, een volume van gezuiverde cellen overeenkomt met 10⁶ totaal neutrofiele granulocyten. Meng door zachtjes pipetteren.
   4. Zet de schotel in een omgekeerde fluorescente microscoop en beeldacquisitie beginnen. Bijvoorbeeld, is het aanbevolen om het verwerven van basislijn beelden voordat het prestatiemeteritembestand van een reagens neutrofiele-activeren zoals FMLP of bacteriën. In dit voorbeeld start de overname van RPMI/RI-MUB₄₀-Cy5/neutrofielen, en op een later timepoint, Pipetteer het reagens neutrofiele-activeren in de glazen schotel en beeldacquisitie blijven.
      Opmerking: Wijzigingen in deze stappen kunnen worden gemaakt op basis van wetenschappelijke behoeften.
   5. Proces verkregen beelden/one-time-lapse films zoals heeft betrekking op de specifieke Microscoop gebruikt.

Resultaten

Resultaten van de MUB₄₀-gebeitst weefsels van een histopathologisch onderzoek dia's onthullen meestal afzonderlijke cellen verspreid over het weefsel. MUB₄₀ vlekken lactoferrine, die aanwezig is in neutrofiele korrels en verzuilde. Dus meestal gezien punctate kleuring of verschillende grote gescheiden gebieden van signaal afkomstig zijn uit afzonderlijke neutrofiele granulocyten (Figuur 1). Het is handig om een tweede cel markering zoals...

Discussie

Hier zijn twee tests beschreven waarin de MUB₄₀ peptide wordt gebruikt om te studeren neutrofiele ontsteking en activering. Laten we zien hoe MUB₄₀ kan onthullen neutrofielen presenteren in histopathologie secties of hun activeringsstatus met behulp van live gezuiverde neutrofielen weergeven. De kritische stappen voor het gebruik van MUB₄₀ als een kleuring reagens zijn hetzelfde als met elke andere tl detectiemethode. Zorg moet men zich ervan vergewissen van de compatibiliteit van fluores...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
MUB40-Cy5	Benoit Marteyn	benoit.marteyn@pasteur.fr	Fluorescent MUB40 peptide (beschikbaar met andere geconjugeerde fluoroforen)
RI-MUB40-Cy5	Benoit Marteyn	benoit.marteyn@pasteur.fr	Retro-inverso fluorescerend MUB40 peptide. Gesynthetiseerd met D-aminozuren en resistent tegen proteasen (beschikbaar met andere geconjugeerde fluoroforen)
Parformaldehyde	Sigma-Aldrich	16005	Fixeermiddel voor histologie
Sucrose	Sigma-Aldrich	S7903	Oplossing gebruikt om overtollig PFA te verwijderen
Optimal Cutting Temperature Compound (OCT)	Sakura Finetek USA	4583	Gebruikt om weefsel te bevriezen voor cryostat secties
2-Methylbutaan	Sigma-Aldrich	M32631	Gebruikt om weefsel te bevriezen voor cryostat secties
Ethanol	Sigma-Aldrich	1.00974	Gebruikt voor droogijsbad om weefsel te bevriezen
Leica Cryostat	Leica Biosystems	CM1520	Gebruikt om weefsels te snijden
Glasmijkroscoopglaasjes	Fisher Scientific	12-518-101
Dekglasjes	Thor Labs	CG15CH	Precisiedeksel
Dako pen	Sigma-Aldrich	Z377821	Gebruikt om vloeistofverlies te voorkomen tijdens weefselkleuring
Saponine	Sigma-Aldrich	47036	Gebruikt om cellen te permeabiliseren voor IF-kleuring
DAPI	Sigma-Aldrich	10236276001	Kleurt DNA
Alexa Fluor 488 Phalloidin	Fisher Scientific	A12379	Bindt aan actine
Prolong Gold antifade Mountant	Fisher Scientific	P36930	Verlengt IF-signaal en weerstand tegen fotobleken
Fluorescente microscoop	Diverse	Diverse	Gebruikt om IF-plaatjes te bekijken
Anoxiekast	Diverse	Diverse	Gebruikt voor de zuivering van levende geïnactiveerde neutrofielen
Natriumchloride NaCl	Sigma-Aldrich	S7653
EDTA	Sigma-Aldrich	E9884	Wasbuffercomponent
MACS BSA-buffer	Miltenyi Biotec	130-091-376	Wasbuffercomponent
Percoll	Sigma-Aldrich	P4937	Gradient voor neutrofielen zuivering
CD235a glycophorine magnetische microbeads	Miltenyi Biotec	130-050-501	Gebruikt om besmettende RBC's te verwijderen
LS-kolommen	Miltenyi Biotec	130-042-401	Gebruikt bij het verwijderen van RBC's van neutrofielen
RPMI-1640 zonder Fenolrood	Sigma-Aldrich	R8755	Gebruikt voor neutrofielen assays