Analyse van eiwitcomplexen thylakoïde membraan door blauwe inheemse gelelektroforese

Samenvatting

Een protocol voor het ontrafelen van plant thylakoïde eiwit complexe organisatie en samenstelling met blauwe inheemse polyacrylamide gel elektroforese (BN-pagina) en 2D-SDS-pagina wordt beschreven. Het protocol is geoptimaliseerd voor Arabidopsis thaliana, maar kan worden gebruikt voor andere plantensoorten met kleine wijzigingen.

Samenvatting

Fotosynthetische elektron overdracht keten (ETC) omgezet zonne-energie in chemische energie in de vorm van NADPH en ATP. Vier grote eiwitcomplexen ingebed in de thylakoïde membraan oogst zonne-energie rijden elektronen van water naar NADP⁺ via twee photosystems, en het verloop van de gemaakte proton gebruiken voor productie van ATP. Photosystem PSII, PSI, cytochroom b₆f (Cyt b₆f) en ATPase zijn alle multiprotein complexen met verschillende oriëntatie en dynamiek in het membraan van thylakoïde. Waardevolle informatie over de samenstelling en de interacties van de complexen van de eiwitten in het membraan van thylakoïde kan worden verkregen door het solubilizing van de complexen van de membraan integriteit door milde detergentia gevolgd door inheemse gel elektroforetische scheiding van de complexen. Blauwe inheemse polyacrylamide-gel-elektroforese (BN-pagina) is een analytische methode gebruikt voor het scheiden van eiwitcomplexen in hun geboorteland en functionele vorm. De methode kan worden gebruikt voor complexe eiwitreiniging voor meer gedetailleerde structurele analyse, maar het biedt ook een instrument om de dynamische interacties tussen de eiwitcomplexen ontleden. De methode heeft werd ontwikkeld voor de analyse van mitochondriale respiratoire eiwitcomplexen, maar sindsdien zijn geoptimaliseerd en verbeterd voor de dissectie van de thylakoïde eiwitcomplexen. Hier, bieden wij een gedetailleerde up-to-date protocol voor analyse van onstabiele fotosynthetische eiwitcomplexen en hun interacties in Arabidopsis thaliana.

Inleiding

Grote multisubunit eiwit complexen Fotosysteem PSI en PSII, Cyt b₆f en ATPase coördineren de productie van NADPH en ATP in fotosynthetische licht reacties. In hogere planten chloroplasten, bevinden de complexen zich in de thylakoïde membraan, dat een structureel heterogene membraan structuur is, bestaande uit appressed grana en niet-appressed stroma ze. Blauwe inheemse polyacrylamide-gel-elektroforese (BN-pagina) is een veel gebruikte methode bij de analyse van grote multisubunit eiwitcomplexen in hun geboorteland en biologisch actieve vorm. De methode werd opgericht voor de dissectie van de mitochondriale membraan eiwit complexen¹, maar is later aangepast voor de scheiding van eiwitcomplexen van de thylakoïde membraan netwerk³. De methode is geschikt is (i) voor de zuivering van individuele thylakoïde eiwitcomplexen voor structurele analyse, (ii) voor het bepalen van de inheemse interacties tussen eiwitcomplexen en (iii) voor de analyse van de algemene organisatie van de eiwitcomplexen op het veranderende milieu signalen.

Voorafgaand aan de scheiding, eiwitcomplexen worden geïsoleerd van het membraan met zorgvuldig gekozen nonionic detergentia die zijn over het algemeen mild en de inheemse structuur van de eiwitcomplexen behouden. Wasmiddelen bevatten hydrofobe en hydrofiele sites en de stabiele micellen vorm boven een bepaalde concentratie, een kritische micellaire concentratie (CMC) genoemd. Verhoging van het wasmiddel concentratie boven de CMC-resultaten in verstoring van de lipide-lipide-interacties en de solubilisatie van eiwitcomplexen. De keuze van wasmiddel is afhankelijk van de stabiliteit van het eiwit complex van belang en de capaciteit van de solubilisatie van het wasmiddel. Routinematig gebruikte detergentia omvatten α/β-dodecyl-maltoside en digitonin. Na de solubilisatie van eiwitcomplexen in hun geboortestaat, onoplosbaar materiaal wordt verwijderd door centrifugeren. In hogere planten, het membraan thylakoïde is zeer heterogenic in structuur en sommige wasmiddelen (b.v. digitonin) solubilize selectief slechts een specifiek deel van de membraan-³. Karakteriseren de complexe organisatie van eiwit of de interacties tussen de eiwitcomplexen, is het daarom cruciaal om altijd de solubilisatie capaciteit van het gekozen wasmiddel door het bepalen van de inhoud van de chlorofyl en de chlorofyl a/b verhouding van de bovendrijvende substantie te beoordelen het rendement en de vertegenwoordigde thylakoïde (sub) domein, respectievelijk van de ontbindend breuk. De chlorofyl a/b-verhouding in intact ze van groei-licht acclimated planten is meestal ongeveer 3, terwijl de chl een / b-waarde van thylakoïde breuken verrijkt in grana of stroma ze beneden (~ 2.5) of de waarde van het totaal (~ 4.5) overschrijdt thylakoiden, respectievelijk.

Om negatieve lading aan de eiwitcomplexen, wordt Coomassie briljant blauw (CBB) kleurstof toegevoegd aan het ontbindend monster. Als gevolg van de verschuiving van de lading, eiwitcomplexen migreren naar de anode en worden gescheiden op een helling van acrylamide (AA) volgens hun moleculaire massa en de vorm. Doeltreffend en met hoge resolutie scheiding wordt bereikt met behulp van een lineaire acrylamide concentratie verloop. Tijdens de elektroforese migreren de eiwitcomplexen naar de anode totdat ze hun grootte-afhankelijke porie-grootte limiet is bereikt. De porie-grootte van polyacrylamidegel hangt af van (i) de totale acrylamide /BIB- acrylamide concentratie (T) en (ii) op de cross-linker bis- acrylamide monomeer concentratie (C) ten opzichte van de totale monomeren⁴. Na de scheiding met BN-pagina, kunnen de eiwitcomplexen worden verder onderverdeeld in hun individuele eiwit subeenheden door tweede-dimensie (2D) - SDS - PAGE. Hier beschrijven we een gedetailleerd protocol voor de analyse van thylakoïde membraan eiwitcomplexen door BN-/ 2D-SDS-pagina.

Protocol

1. voorbereiding BN Gel^1,2,3

1. De gel-wiel met 8 x 10 cm platen (rechthoekig glas en ingekeepte aluminiumoxide plaat) volgens de instructies van de fabrikant van met behulp van 0,75 mm afstandhouders instellen.
2. Plaats een kleurovergang mixer op een roer-plaat en verbind deze met de peristaltische pomp door een slang. Een naald van de spuit hechten aan het andere uiteinde van de buis en plaats de naald tussen het glas en aluminium plaat. Magneetroerder plaats aan de "heavy" (H)-kamer.
3. De 3,5% (v/v) en 12,5% (v/v) acrylamide (AA) oplossingen in 15 mL conische centrifuge buizen te bereiden voor de scheiding gel gradatie (Zie recepten in tabel 1). Voorkom vroegtijdige polymerisatie en houden de centrifuge buizen op ijs bij de voorbereiding van de oplossingen.
   Let op: Acrylamide is neurotoxische en kankerverwekkende, Draag beschermende kleding en handschoenen.
4. Voeg 5% APS en TEMED recht vóór de oplossingen voor de kleurovergang mixer pipetteren. Pipetteer de 12,5%-oplossing voor de H-kamer.
   1. Verwijder luchtbellen uit het kanaal aansluiten van de "light" (L) en H-kamer door het openen van de klep aansluiten van de twee kamers waardoor oplossing om aan de L-kamer te gaan. Sluit de klep en Pipetteer die de sporen van oplossing terug naar H-kamer.
   2. Ten slotte, Pipetteer de 3,5%-oplossing voor de L-kamer.
5. Overschakelen op de magneetroerder (de snelheid van het roer is niet kritisch, maar het moet goed mengen van de zware en lichte oplossingen), de kleppen open en zet de peristaltische pomp. Laat de gel oplossingen te stromen tussen het glas en aluminium plaat, het debiet moet ongeveer 0,5 mL/min. De naald moet boven de vloeistof op de hele tijd, het kan worden aangesloten op het bovenste gedeelte van de glasplaat met een tape.
6. Wanneer de H - en L-kamers hebben leeggemaakt, vul ze met ultrazuiver water en water zachtjes het oppervlak van de gel overlay toestaan. De gel polymerisatie duurt ongeveer 1-2 uur op RT.
7. Bereid de oplossing van 3% acrylamide (zie recept in tabel 1) voor het stapelen gel op RT. Pipet de stapelvolgorde gel op de top van de gepolymeriseerde scheiding gel (vóór gieten de stapelvolgorde gel, verwijder het water bedekken de oppervlakte van de gel) en plaats een monster gel kam tussen het glas en aluminium plaat vermijden luchtbellen.
   1. Laat 30-60 min RT. verwijderd de kam voorzichtig onder ultrazuiver water polymeriseren. Opslaan van de gel op + 4 ˚C.
      Pauze punt. De gel kan worden achtergelaten bij + 4 ˚C voor een paar dagen. De gel moet worden bewaard in vochtige omstandigheden om te voorkomen dat het drogen van de putten en het oppervlak van de gel.

2. thylakoïde solubilisatie^1,2,3

Opmerking: Alle stappen moeten worden uitgevoerd onder zeer weinig licht. Houd de monsters en buffers op ijs.

1. Geïsoleerde ze met ijskoude 25BTH20G buffer tot een definitieve chlorofylconcentratie van 1 mg/mL verdund. Voor 2D-BN-SDS-pagina analyse ongeveer 4-8 µg chlorofyl / monster is geschikt.
   Opmerking: Het thylakoiden gebruikt in de experimenten moeten worden geïsoleerd van verse bladeren (voor protocol van thylakoïde isolatie, Zie³)
2. Voeg een gelijke hoeveelheid wasmiddel buffer, d.w.z. 2% β-DM (w/v) of 2% toe digitonin (m/v). Meng het wasmiddel aan het monster thylakoïde zachtjes met de pipet-tip en luchtbellen voorkomen. De uiteindelijke concentratie van het wasmiddel is 1% en dat van de ze 0.5 mg Chl/mL.
   1. Solubilize de thylakoiden gedurende 2 minuten op ijs (β-DM) of 10 minuten bij RT met continue Zacht mengen op een rocker/shaker (digitonin).
      Opmerking: Digitonin en β-DM zijn over het algemeen gebruikt voor de solubilisatie van een thylakoïde eiwitcomplexen. Als andere niet-ionogene wasmiddelen worden gebruikt, moeten de wasmiddel concentratie en de tijd van de solubilisatie worden eerst geoptimaliseerd. Meestal het wasmiddel concentratiebereik van 0,5% - 5% (v/v).
      Let op: Digitonin is toxisch, Draag beschermende kleding en handschoenen
3. Het insolubilized materiaal verwijderen door centrifugeren bij 18.000 x g gedurende 20 minuten, bij + 4 ˚C.
4. Het supernatant overbrengen in een nieuwe tube 1,5 mL en voeg 1/10 (v/v) van CBB buffer aan het monster.
   Opmerking: Wanneer de globale samenstelling van de thylakoïde membraan eiwitcomplexen wordt onderzocht, bepalen van het rendement en de vertegenwoordigde thylakoïde domein van ontbindend breuk wordt aanbevolen. Om te bepalen van het rendement van de ontbindend materiaal, neem 5 µL van het supernatans dat aan een nieuwe buis (alvorens toe te voegen CBB) en meet de Chl inhoud en Chl een / b verhouding⁵.

3. BN-PAGE^1,2,3

1. Instellen van de gel met een verticale elektroforese systeem (bijvoorbeeld Hoefer SE 250). Vul het bovenste buffer kamer met blauwe kathode buffer (Zie tabel 1) en giet anode buffer naar de tweede kamer van de buffer.
2. Laad thylakoïde monster (bijvoorbeeld 5 µg van chlorofyl) in de putjes.
3. Start de elektroforese en geleidelijk verhogen de spanning: 75 V voor 30 min 100 V voor 30 min, 125 V voor 30 min, 150 V voor 1 h en 175 V tot de complexen zijn volledig gescheiden. Voer de gel op + 4˚C, hetzij met behulp van een koude kamer of aanpassing van de temperatuur van de gel met een koelsysteem.
   Opmerking: Omzetten in de blauwe kathode buffer een duidelijke kathode buffer wanneer de steekproef voorkant ongeveer eenderde van de gel is gemigreerd.
4. Na de elektroforetische run, de gel met een photoscanner voor het archiveren van de afbeelding te scannen.

4. 2D-SDS-PAGINA

1. Het monteren van de Elektroforese van het verticale systeem (gel formaat 16 x 20 cm). Gebruik 1 mm afstandhouders.
2. Bereiden standaard SDS gel (12% acrylamide, 6 M ureum, zie recept in tabel 2) met een 2D-kam (één groot goed voor de strip en één standaard goed voor moleculair gewicht marker).
3. Knip de baan van BN-gel en plaatst u deze in een tube (5 mL). Voeg 2 mL Laemmli buffer (met 5% β-mercaptoethanol) en Incubeer de strip voor 45 min met zacht schudden op RT.
4. Plaats de lane, met behulp van bijvoorbeeld een spacer, op de top van de gel om luchtbellen te voorkomen.
5. Pipetteer 5 µL van moleculair gewicht markering op een smal stuk van filtreerpapier en plaats het papier aan de standaard goed.
6. Om de strip BN-gel en het marker-papier, giet 0,5% agarose (in rijklare buffer) op de top van de gel-strip en laat het stollen.
7. Elektroforese volgens standaard protocollen uitvoeren. Nadat de elektroforetische uitgevoerd, visualiseer de proteïnen met bijvoorbeeld Sypro Ruby vlek of zilver kleuring volgens⁶.

Resultaten

Een representatieve 2D-BN/SDS-pagina systeem in Figuur 1 toont de scheiding tussen digitonin en β-DM-ontbindend thylakoïde eiwitcomplexen en hun gedetailleerde eiwit subeenheid samenstelling. Het eiwit complex patroon van digitonin ontbindend ze (horizontale gel op de bovenkant aan de bovenkant van figuur 1A) bevat de PSII-LHCII-PSI megacomplex, twee grote PSII-LHCII supercomplexes (sc), PSI-LHCII supercomplex, PSI monomeer (m), ...

Discussie

De fotosynthetische energie conversie machine bestaat uit grote multisubunit eiwitcomplexen, die zijn ingebed in het membraan van thylakoïde. Dit protocol beschrijft een basismethode voor analyse van de plant thylakoïde eiwitcomplexen van Arabidopsis thaliana met BN-pagina gecombineerd met 2D-SDS-pagina. Het protocol is ook geschikt voor de analyse van eiwitcomplexen thylakoïde van tabak en spinazie ze, maar omvat wellicht kleine aanpassingen.

Voor de solubilisatie van membraan eiwitc...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
6-aminocaproic acid (ACA)	Sigma-Aldrich	A2504
BisTris	Sigma-Aldrich	B4429
Sucrose	Sigma-Aldrich	S0389
Acrylamide (AA)	Sigma-Aldrich	A9099	Let op: Neurotoxisch!
n-dodecyl-β-D-maltoside	Sigma-Aldrich	D4641
Tricine	Sigma-Aldrich	T0377
Tris	Sigma-Aldrich	T1503
SDS	VWR	442444H
Urea	VWR	28877.292
Glycerol	J.T. Baker	7044
Sodium Fluoride (NaF)	J.T. Baker	3688
EDTA disodium salt	J.T. Baker	1073
Digitonin	Calbiochem	300410	Let op: Toxisch!
Pefabloc SC	Roche	11585916001
Serva Coomassie Blue G	Serva	35050
β-mercaptoethanol	Bio-Rad	1610710
APS (Ammonium persulfate)	Bio-Rad	161-0700
TEMED (Tetramethylethylenediamine)	Bio-Rad	1610801
(N,N'-Methylene)-Bis-Acrylamide	Omnipur	2610
Glycine	Fisher	G0800
Prestained Protein Marker, Broad Range (7-175 kDa)	New England Biolabs	P7708
Falcon, Conical Centrifuge Tubes 15 ml	Corning	352093
Dual gel caster with 10 x 8 cm plates	Hoefer	SE215
Gradient maker SG5	Hoefer
0.75 mm T-spacers	Hoefer	SE2119T-2-.75
Sample gel comb, 0.75 mm	Hoefer	SE211A-10-.75
Mighty Small SE250 vertical electrophoresis system	Hoefer	SE250
IPC-pump	Ismatec
Power supply, PowerPac HV	Bio-Rad	164-5097
Centrifuge	Eppendorf	5424R
Rocker-Shaker	Biosan	BS-010130-AAI
PROTEAN II xi Cell	Bio-Rad	1651813