Methodenartikel

Inductie van Endothelial differentiatie in cardiale voorlopercellen onder lage Serum voorwaarden

DOI:

10.3791/58370

⸱

7 januari 2019

 ,  ,  ,  , 
1Department of Biomedicine, University Hospital and University of Basel, 2Division of Cardiology, University Hospital Basel

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit protocol beschrijft een endothelial differentiatie techniek voor cardiale voorlopercellen. Het richt zich vooral op de invloed van serumconcentratie en cel-zaaien dichtheid op de endotheliale differentiatie mogelijkheden.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Cardiale voorlopercellen (CPC) wellicht therapeutisch potentieel voor cardiale herstel na blessure. In de volwassen zoogdieren hart, intrinsieke CPCs zijn uiterst schaars, maar uitgebreide CPCs zou nuttig voor celtherapie. Een voorwaarde voor het gebruik ervan is hun vermogen om te onderscheiden op een gecontroleerde manier in de diverse cardiale geslachten gedefinieerd en efficiënte protocollen gebruiken. Bovendien, bij in vitro expansie, CPC's die bij patiënten geïsoleerd zijn of preklinische ziekte modellen vruchtbare onderzoeksmiddelen voor het onderzoek naar de ziekte mechanismen kunnen bieden.

Huidige studies gebruiken verschillende markeringen ter identificatie van CPC. Echter zijn niet alle van hen uitgedrukt in mens, die beperkt de translationeel impact van sommige Preklinische studies. Differentiatie-protocollen die zijn van toepassing ongeacht de isolatie-techniek en marker-expressie zal voor de gestandaardiseerde uitbreiding en priming van CPC's voor cel therapie doel toestaan. Hier beschrijven we dat de priming van CPC's onder een lage foetale runderserum (FBS) concentratie laag cel dichtheid vergemakkelijkt de endothelial differentiatie van het CPCs. met behulp van twee verschillende subpopulaties van muis en rat CPCs, we laten zien dat laminin is een meer geschikt substraat dan fibronectine daartoe krachtens het volgende protocol: na het kweken voor 2-3 dagen in medium met inbegrip van de supplementen die multipotent handhaven en met 3,5% FBS, CPCs worden overgeënt op laminin op < 60% samenvloeiing en gekweekte in supplement-gratis medium met lage concentraties van FBS (0,1%) voor 20-24 uur voor differentiatie in endotheel differentiatie medium. Omdat het CPCs zijn een heterogene populatie, wellicht serum concentraties en incubatie tijden worden aangepast afhankelijk van de eigenschappen van de respectieve CPC subpopulatie. Gezien dit, de techniek kan worden toegepast op andere soorten CPCs ook en biedt een handige methode om te onderzoeken van het potentieel en de mechanismen van differentiatie en hoe ze worden beïnvloed door ziekte bij het gebruik van CPC's geïsoleerd van de respectieve ziekte modellen.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Recente studies ondersteunen het bestaan van resident cardiale voorlopercellen (CPC) in de2,van volwassen zoogdieren hart1,3, en CPC's zou een nuttige bron voor celtherapie na cardiale letsel4, 5. Bovendien uitgebreide CPCs kunnen voorzien in een vruchtbare model drug screening en het onderzoek naar de ziekte mechanismen als geïsoleerde patiënten met zeldzame aandoeningen, of aan respectieve ziekte modellen6,7.

CPC's geïsoleerd van de volwassen hart bezitten stam/progenitor cel kenmerken1,2,3,8 , zoals ze multipotente zijn, clonogenic, en hebben de capaciteit voor zelf-vernieuwing. Echter, er zijn veel verschillende (sub) bevolking van CPC's verschillende oppervlakte marker profielen, met inbegrip van, bijvoorbeeld, c-kit, Sca-1 en anderen, tentoonstellen of opgehaald door verschillende isolatie technieken (tabel 1). Diverse protocollen van de cultuur en de differentiatie zijn gevestigde1,2,8,9,10,11,12, 13,14,15,16,17,18. Deze protocollen verschillen meestal met betrekking tot de groeifactor en serum inhoud, die zijn aangepast aan het doel van het kweken en die kan leiden tot verschillen in de resultaten en effecten, met inbegrip van differentiatie efficiëntie.

Marker gebaseerde isolatie technieken:

CPC's kunnen worden geïsoleerd op basis van een specifieke oppervlakte marker expressie1,2,8,9,10,11,12,13 ,14,15,16,17,18. Eerdere studies suggereren dat de c-kit en Sca-1 de beste markers zijn kunnen te isoleren van de resident CPCs1,11,14,19,20. Omdat geen van deze markers echt specifiek voor CPC is, worden combinaties van verschillende markeringen gewoonlijk toegepast. Bijvoorbeeld, terwijl het CPCs express lage niveaus van c-kit21, is c-kit ook uitgedrukt door andere celtypes, met inbegrip van mestcellen22, endotheliale cellen23en hematopoietische stamcellen/voorlopercellen cellen24. Een bijkomend probleem is het feit dat niet alle markeertekens worden uitgedrukt in alle soorten. Dit is het geval voor Sca-1, die in de muis maar niet in menselijke25 uitdrukt. Met behulp van protocollen die onafhankelijk van isolatie markeringen zijn kan dus voordelig met het oog op klinische proeven en studies met menselijke specimens.

Marker-onafhankelijke isolatie technieken:

Er zijn verschillende belangrijke technieken voor CPC-isolatie, die vooral onafhankelijk zijn van oppervlakte marker expressie, maar die kunnen worden verfijnd door de opeenvolgende selectie van specifieke marker-positieve subfractions zo nodig (Zie ook tabel 1). (1) de kant bevolking (SP) techniek was oorspronkelijk gekenmerkt in een primitieve bevolking van hematopoietische stamcellen, gebaseerd op de mogelijkheid om de DNA kleurstof Hoechst 3334226 efflux van ATP-binding cassette (ABC) vervoerders27. SP hartcellen zijn geïsoleerd door verschillende groepen en gerapporteerd om uit te drukken een scala aan markeringen met enkele kleine verschillen tussen rapporten2,8,13,14. (2) kolonie-vormende eenheid fibroblast cellen (CFU-Fs) zijn oorspronkelijk vastgesteld gebaseerd op een mesenchymale stromale cel (MSC)-als fenotype. Geïsoleerde MSCs worden gekweekt op gerechten voor het opwekken van de vorming van de kolonie. Dergelijke kolonie-vormende MSC-achtige CFU-Fs kunnen worden geïsoleerd uit het volwassen hart en zijn in staat om het verschil in cardiale lineages15. (3) Cardiosphere-afgeleide cellen (CDC) zijn afzonderlijke cellen afgeleid van clusters van cellen gegroeid van weefsel biopsieën of28,29,30,31explants. Het werd onlangs aangetoond dat meestal de CD105+/CD90-/c-kit- cel breuk vertoont cardiomyogenic en regeneratieve potentiële32.

Hier, voorzien wij een protocol met behulp van SP-CPC's geïsoleerd van muizen, voor de efficiënte inductie van endothelial overdrachtslijn op basis van een eerdere studie in het CPCs rat en muis SP-CPCs33. Het protocol bevat specifieke aanpassingen aan de cultuur en techniek van de uitbreiding met betrekking tot de celdichtheid, de serum-inhoud van het medium, en het substraat. Het kan worden toegepast op muis SP-CPC's niet alleen maar aan verschillende soorten-CPC's voor het doel voor het opwekken van de overstap van een lot van een sturen naar een CPC endotheel-begaan, zij het met het oog op de transplantatie van deze cellen of het gebruik ervan voor mechanistische in vitro studies.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het gebruik van muizen voor cel isolatie doel was volgens de richtsnoeren voor de zorg en het gebruik van proefdieren en met de Zwitserse wet op dier en werd goedgekeurd door de Zwitserse kantonnale autoriteiten.

Opmerking: De isolatie van Sca-1+/CD31- SP-CPC's vanuit het hart van de muis was in wezen gedaan als eerder beschreven34 met enkele wijzigingen. Zie Tabel van materialenvoor de materialen en de gebruikte reagentia. Voor alle experimenten, werden cardiale SP-CPC's geïsoleerd van muizen versterkt gepasseerd en gebruikt in een cel lijn-achtige manier. Passages 7-20 werden gebruikt voor deze studie.

1. de weefsels voorbereiding

Opmerking: Alle experimenten met behulp van muizen moeten worden uitgevoerd volgens de richtlijnen en verordeningen. Dit protocol maakt gebruik van vier muizen. Cultuur-platen die 100 mm diameter zijn worden beschreven als P100 en cultuur platen die 60 mm diameter worden beschreven als P60 voor de volgende onderdelen van het protocol.

  1. Injecteer elke muis met 200 mg/kg pentobarbital intraperitoneally (i.p.) en wacht totdat het is volledig verdoofd door het controleren van haar reactie om te Teen knijpen.
  2. Veeg de borst met 70% ethanol. Snijd de huid en thoracale muur met een schaar de borstholte bloot te stellen.
  3. Til het hart met een tang en snijd het op het honk met behulp van schaar. Het hart in een P100 met 25 mL (5 mL voor P60) koude-fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) (drie tot vijf harten per P100) of één tot twee harten per P60 plaatsen
  4. Het hart pomp met een tang om uit te werpen van het bloed uit de holten (figuur 1A).
  5. Zet het hart in een P100 met 25 mL (5 mL voor P60) van koude PBS voor wassen. Verwijder de atria met behulp van kleine schaar. Het hart in twee longitudinale stukjes gesneden en was ze weer in ijskoude PBS (25 mL/P100, 5 mL/P60).
  6. De stukken overbrengen in een nieuwe P100 met 25 mL (5 mL voor P60) koude PBS. Snij de stukken in kleinere stukken met behulp van kleine schaar (figuur 1B). Voeg een druppel van 1 mg/mL collagenase B verdund in Henks evenwichtige zoutoplossing (HBSS) en gehakt van de kleine stukjes grondig met een steriele scheermesje (Figuur 1 c).

2. de spijsvertering

  1. Voeg 10 mL (2,5 mL voor P60) van de 1 mg/mL collagenase B oplossing om de schotel vanaf stap 1.6.
  2. Zet de collagenase B-oplossing met de gehakt hart stuks in een gekantelde (ongeveer 30°) P100 (of P60) in een 37 ° C incubator (Figuur 1 d).
  3. Incubeer de stukken gehakt hart voor een maximum van 30 min; Meng door herhaaldelijk passeren hen een pipet van Pasteur elke 10 min tijdens de incubatie (figuur 1E).
    Opmerking: Het is belangrijk niet meer bedragen dan 30 min van incubatie in totaal voor stap 1.3.

3. filtratie

  1. Voeg vervolgens 10 mL (5 mL voor P60) van koude HBSS aangevuld met 2% FBS aan de stukken gehakt en gehomogeniseerde hart.
    Opmerking: HBSS aangevuld met 2% FBS lest collagenase B activiteit.
  2. Filtreer het hart stukken door 100 µm filter verwijderen onverteerd weefsel en centrifuge op 470 x g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur (RT) (figuur 1F, gele filters).
  3. Verwijder het supernatant en resuspendeer de pellet in 5 mL (3 mL voor P60) rode bloedcel lysis-buffermengsel en Incubeer de pellet voor 5 min met af en toe schudden op ijs.
  4. Voeg vervolgens 10 mL (5 mL voor P60) van PBS (om te stoppen met de lysis van de reactie) en filtreer het monster door een filter van 40 µm uit te sluiten van grotere cellen, met inbegrip van residuele cardiomyocytes (figuur 1F, blauwe filters).
  5. Centrifugeer de buis bij 470 x g gedurende 5 min op RT (zonder de rem). Verwijder het supernatant en resuspendeer de pellet in 1 mL DMEM inclusief 10% FBS.
  6. De cellen in een aliquot deel met een hemocytometer tellen. Resuspendeer de cellen met DMEM inclusief 10% FBS, die gericht zijn op een concentratie van de laatste cel van 1 x 106 cellen/mL.
    Opmerking: Ongeveer 5 x 106 cardiomyocyte - en erytrocyt-verarmd cellen kunnen worden geschat per muis.
  7. De cellen verdelen over twee buizen (Figuur 2): in buis A, voeg 1,5 mL voor Hoechst 33342 kleuring met verapamil; in buis B, voeg 18.5 mL voor Hoechst 33342 kleuring en overgaan tot de vlek en stroom cytometry (stap 4.1 en 4.2) SP hartcellen wilt sorteren.

4. het sorteren van cardiale SP cellen door Stroom Cytometry

Opmerking: Verapamil remt Hoechst efflux door het blokkeren van multidrug resistentie (MDR) ABC vervoerder activiteit. Hoechst 33342 is een DNA-bindende kleurstof die in levende cellen kan worden gebruikt voor het detecteren van de celcyclus tijdens het correleert met de DNA-inhoud. Hoechst-33342-diepte cellen worden weergegeven in het lage deel van Hoechst van beide kanalen emissie (450 nm, Hoechst blauw; 650 nm, Hoechst rood), dat wil zeggen, afgezien van de Hoechst-behoud "belangrijkste bevolking", waardoor ze hun naam "kant bevolking". SP cellen zijn verrijkt met cellen met voorlopercellen eigenschappen en tonen een hoge uitdrukking van multiresistente ABC vervoerders (zoals MDR1 en ABCG2). Hoechst 33342 wordt geschreven als Hoechst voor de volgende onderdelen van het protocol. Het is belangrijk om te beschermen lichtgevoelig materiaal voor ideale resultaten.

  1. Kleuring met Hoechst in de aanwezigheid en de afwezigheid van verapamil
    1. Verapamil (met een eindconcentratie van 83.3 µM) en Hoechst (met een eindconcentratie van 5 µg/106 cellen) toevoegen aan de oplossing van de cel. Voor buis A, het gebruik van Verapamil en Hoechst; buis B, alleen voor gebruik door Hoechst. Incubeer in een waterbad (bij 37 ° C) voor 90 min en terugkeren van de buizen iedere 20 min (figuur 1G).
    2. Centrifugeer de buizen bij 470 x g gedurende 5 min op RT. Discard het supernatant en resuspendeer elke pellet in HBSS (1 x 106 cellen/mL).
    3. Neem een 1,5 mL aliquoot voor enkele technieken en negatieve controle uit buis B (Figuur 2): (i) fluoresceïne-isothiocyanaat (FITC)-geconjugeerd anti-Sca-1; (ii) allophycocyanin (APC)-geconjugeerd anti-CD31; (iii) nonstained cellen (negatieve controle).
      Opmerking: Isotype besturingselementen worden hier gebruikt voor het opzetten van het protocol van de isolatie.
    4. Centrifugeer buizen A en B en de single-kleuring en negatieve controle aliquots bij 470 x g gedurende 5 min op RT voor het wassen van Hoechst en verapamil.
    5. Verwijder het supernatant en resuspendeer de pellets van buis A en (iii) de negatieve controle in een 250 µL van HBSS en houden hen op ijs in het donker tot sorteren.
    6. Resuspendeer de pellet van buisje B in 200 µL van HBSS en de pellet van (i, ii) de single-kleuring aliquots in 100 µL van HBSS. Voeg FITC-geconjugeerd anti-Sca-1 (0,6 µg/107 cellen) en APC-geconjugeerde anti-CD31 (0,25 µg/107 cellen). Incubeer de pellets voor 30 min op ijs en schud ze van tijd tot tijd in het donker.
    7. Voeg 2 mL HBSS de buizen. Centrifugeer de buizen bij 470 x g gedurende 5 min op RT.
    8. Verwijder het supernatant en resuspendeer alle pellets met 1 mL HBSS en centrifuge als hierboven. Gooi het supernatant. Resuspendeer de pellet van de single-kleuring aliquots in 200 µL van HBSS. Resuspendeer de pellet van buisje B in HBSS (20 x 106 cellen/mL).
    9. Houd de monsters op ijs en beschermd tegen licht tot sorteren.
  2. Sorteren met stroom cytometry
    1. Bereiden van steriele 1,5 mL buisjes met 500 µL van HBSS inclusief 2% sorteren FBS.
    2. Vlek van de cellen met 7-aminoactinomycin D (7-AAD) (0,15 µg/106 cellen) op het ijs gedurende 10 minuten om uit te sluiten van de dode cellen.
    3. Sorteren van de cardiale SP met de volgende instellingen: excite Hoechst met behulp van 350 nm (UV) excitatie, fluorescentie emissie met een 450/50 nm band pass filter (Hoechst blauw) en een 670/30 nm band pass filter (Hoechst rood) verzamelen en gebruiken van een mondstuk grootte van 100 µm en druk van 15 psi.
    4. Vastleggen voor analyse, 5 x 105 evenementen voor de sorteer monsters en 1 x 105 evenementen voor de negatieve controle, verapamil controle en single-kleuring monsters.
      Opmerking: De cardiale SP is ongeveer 0,5% - 2% (Figuur 1 H) maar kan variëren tussen laboratoria en isolaten. De Sca-1+-/CD31- breuk is ongeveer 1-11% van de totale cardiale SP (figuur 1I) maar kan variëren tussen laboratoria en isolaten. SCA-1+/CD31- SP-CPC's zijn geschreven als SP-CPC's voor de volgende onderdelen van het protocol.

5. primaire cultuur van geïsoleerde SP-CPC 's

Opmerking: Drie verschillende soorten media werden gebruikt in dit protocol. Ze worden aangeduid als Medium 1 (volgens Noseda et al.) 8en 3 Medium en medium 2, zijn beschreven in de Tabel van materialen met betrekking tot hun samenstelling.

  1. Opwarmen van Medium 1 tot en met 37 ° C vóór gebruik en afkoelen van de centrifuge tot 4 ° C. Centrifugeer het sorteren buizen bij 4 ° C en 470 x g voor 6 min en resuspendeer de cellen in Medium 1.
  2. Zet de cellen op een gas-permeabele P60 schotel met 4 mL Medium 1. Het medium elke 3 d totdat de cellen hebben bereikt van 70% - 80% samenvloeiing wijzigen
    Opmerking: Stap 5.2 kan ongeveer 2-3 weken duren.

6. uitbreiding en differentiatie van SP-CPC 's

  1. Celcultuur
    1. 3 x 105 SP-CPC's in 8 mL Medium 1 in een maatkolf van T75 cultuur.
    2. SP-CPCs incuberen bij 37 ° C met 5% CO2 tot 70% - 80% samenvloeiing, wijzigen van het medium elke 2-3-d.
      Opmerking: Het aantal cellen moet worden aangepast volgens het type van het CPCs gebruikt, de verdubbeling tijd en grootte van de cel.
  2. SP-CPC groei en levensvatbaarheid onder verschillende serum concentraties
    1. Cultuur-SP-CPC's voor 2-3 d in T75 kolven met 8 mL Medium 1. Zorgvuldig gecombineerd van het medium en spoel zachtjes met 5 mL warm (37 ° C) HBSS.
    2. De cellen met 5 mL trypsine-EDTA gedurende 5 min. in de cel incubator behandelen, voeg 5 mL van Medium 1 naar het stoppen van de trypsine-activiteit en de celsuspensie overbrengen in een tube van 15 mL.
    3. Centrifugeer de cellen bij 470 x g gedurende 5 min op RT.
    4. Resuspendeer de cellen in Medium of Medium 2 (gemiddeld van de inductie van de bloedlijn) 1en plaat 2.5 x 105 SP-CPC's op P60 gerechten met 3 mL medium dat van concentraties van de verschillende serum.
    5. Het medium van de schotel van stap 6.2.4 voor het verzamelen van dode cellen in een tube van 15 mL na 2 d van kweken in Medium 1 of Medium 2 verzamelen.
    6. Trypsinize Adherente cellen zoals in stap 6.2.2 en het verzamelen van de celsuspensie in de tube van 15 mL van stap 6.2.5. Centrifugeer de cellen bij 840 x g gedurende 5 min op RT.
    7. De bovendrijvende substantie gecombineerd en voeg 1 mL Medium 1 of 2 Medium voor het tellen van de cel. Vlek SP-CPC's met trypan blauw (0,4%) en graaf trypan blauw-positieve (doden) en trypan blauw-negatief (levensvatbare) cellen.
      Opmerking: De levensvatbaarheid van de cellen (stap 6.2.7) wordt gegeven als de trypan-blauw negatieve celaantal in verhouding tot de cel totaal.
  3. Inductie van endothelial differentiatie
    1. Precoat een plaat (6-well) cultuur met 10 µg/mL laminin (LN) of fibronectine (FN).
      1. Maak een oplossing van de substraat met 10 µg/mL LN of FN met F12 medium (of PBS). Voeg 2 mL substraat oplossing aan elk putje. Handhaven van de plaat gedurende 30 minuten bij 37 ° C.
      2. De oplossing van de plaat gecombineerd en voeg 2 mL PBS aan elk putje tot het gebruik ervan.
    2. Het medium van de cellen vanaf stap 6.1.2 gecombineerd, spoel ze zachtjes met 5 mL warm (37 ° C) HBSS behandel hen met 5 mL trypsine-EDTA gedurende 5 min. in de cel incubator, voeg 5 mL van Medium 1 naar het stoppen van de trypsine-activiteit en de celsuspensie overbrengen in een tube van 15 mL.
    3. Centrifugeer de cellen bij 470 x g gedurende 5 min op RT. Aspirate het supernatant en Medium 2 toe te voegen voor het tellen van de cel.
    4. Zaad 8 x 104 cellen per goed op de beklede plaat met 3 mL Medium 2 en houd het bij 37 ° C gedurende 20-24 h. verandering het medium tot 3 mL van Medium 3.
      Opmerking: We raden opslagmedium met een lage serumconcentratie — en zonder supplementen — voor de eerste 20-24 uur. Het wordt afgeraden gebruik < 60% cel samenvloeiing (dat wil zeggen, het nummer van de cel van deelactiviteit 6.3.4 moet worden aangepast afhankelijk van de snelheid van de cel grootte en groei).
    5. Cultuur van de cellen voor 21 d en het medium elke 3 d te wijzigen.
    6. Controleren van het endotheel karakter van gedifferentieerde cellen door hen kleuring met een endothelial marker zoals von Willebrand Factor (vWF) en presterende fluorescentie microscopie.
      1. De cellen met 1 mL PBS wassen en repareren van cellen in 3,7% formaldehyde voor 2 min op RT.
      2. Permeabilize van de cellen met 0,1% Triton X in ddH2O (of PBS) voor 30 min en blokkeren met 10% serum van de geit gedurende 1 uur op RT.
      3. Incubeer de cellen met anti-von Willebrand factor antilichaam (1:100) voor 48 uur bij 4 ° C
      4. Wassen van de cellen 3 x met 1 mL PBS, gedurende 10 minuten elke keer. Incubeer hen met Alexa Fluor 546 geit anti-konijn secundair antilichaam (1:500) gedurende 1 h bij RT in het donker.
      5. Wassen weer 3 x, voor 10 minuten elk, met 1 mL PBS. Vlek de celkernen met 4'6-diamidino-2-phenylindole, dihydrochloride (DAPI; 1:500) gedurende 5 min. op de RT in het donker.
      6. Wassen van de cellen 3 x, voor 5 minuten elk, met 1 mL PBS. Monteren van de cellen en hen bewaren bij 4 ° C
        Opmerking: De kweken gebruiksvoorwaarden (substraat, medium, aanvullende reagentia en FBS concentratie) stap 6.1 en 6.3 worden beschreven in Figuur 3.
  4. Buis vorming assay
    1. Bereiden van een kelder membraan matrix (bijvoorbeeld, Matrigel, voortaan matrix genoemd) plaat.
      1. Ontdooi de matrix bij 4 ° C's nachts.
      2. Jas een 96-wells-plaat met 100 µL van de matrix op ijs.
        Opmerking: Het is belangrijk te voorkomen dat alle bubbels in de matrix. De platen moeten worden bekleed op het ijs om te voorkomen dat de jellification van de matrix.
      3. Het handhaven van de plaat bij 37 ° C gedurende 30 minuten.
    2. Het medium van de cellen (na de voltooiing van stap 6.3.5) gecombineerd, zachtjes spoel de cellen met 5 mL warm (37 ° C) HBSS en behandel hen met trypsine-EDTA gedurende 5 min. in de cel incubator. Voeg Medium 3 om te stoppen de trypsine-activiteit en de celsuspensie overbrengen in een tube van 15 mL.
    3. Centrifugeer de cellen bij 470 x g gedurende 5 min op RT. Aspirate het supernatant, voeg 1 mL Medium 3 en pipet zachtjes.
    4. Filter de cellen met een 35 µm cel zeef, als de cellen worden samengevoegd.
    5. Cellen tellen en 2 x 10,3 naar 4 x 103 cellen in 100 µL van Medium 3 in elk matrix-gecoate goed zaad. Houd de plaat bij 37 ° C in de cel incubator voor 16 h.
    6. Maak een foto met een helder-veld Microscoop bij 2 X vergroting.
      Opmerking: In het geval van een incomplete trypsinebehandeling, verlengen de belichtingstijd te trypsine-EDTA tot een maximum van 7-8 min.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Muis SP-CPC-isolatie:

In deze studie gebruikten we muis CPCs geïsoleerd volgens de SP fenotype, overwegende dat de resultaten van rat CPCs zijn gewijzigd en toegevoegd van een vorig rapport met toestemming (Figuur 8)33.

Celproliferatie onder hoge en lage cel dichtheden en met verschillende Serum concentraties:

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Voordelen van dit Protocol:

Dit protocol biedt een endothelial differentiatie techniek van het CPCs. We vonden dat een lage serumconcentratie en lage celdichtheid de efficiëntie van endothelial differentiatie, waarbij LN bleek te zijn een meer geschikte substraat dan FN onder deze omstandigheden zou kunnen verbeteren. We gebruikten twee verschillende soorten CPCs: rat CPCs, die werden gebruikt in een cel lijn-achtige wijze, en muis SP-CPC's, die werden geïsoleerd en uitgebreid. Met name het proto...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs bedanken Vera Lorenz voor haar nuttige ondersteuning tijdens de experimenten en het personeel van de Stroom Cytometry faciliteit van het departement van biogeneeskunde (DBM), de Universiteit en de Universiteit ziekenhuis Bazel. Dit werk werd gesteund door het verblijf-on track program van de Universiteit van Bazel (tot Michika Mochizuki). Gabriela M. Kuster wordt ondersteund door een subsidie van de Zwitserse National Science Foundation (subsidie nummer 310030_156953).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Kweekmedium
Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM)ThermoFisher#12440
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)/Nutrient Mixture F12 HamMerck#D8437
Penicillin-Streptomycin (P/S)ThermoFisher#15140122
Fetal Bovine Serum (FBS)Hyclone#SH300713.5% (0.1% voor lijnage-inductie)
L-Glutamine ThermoFisher#25030Eindconcentratie 2 mM
GlutathioneMerck#G6013
Recombinant Human Epidermal Growth Factor (EGF)Peprotech#AF-100-15
Recombinant Basic Fibroblast Growth Factor (FGF)Peprotech#AF-100-18B
B27 SupplementThermoFisher#17504044
Cardiotrophin 1 Peprotech#250-25
ThrombinDiagontech AG, Zwitserland#100-125
Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) CaCl2(-), MgCl2(-)ThermoFisher#14170
0.05 % Trypsin-EDTAThermoFisher#25300
T75 FlaskSarstedt#83.3911
Endotheeldifferentiatie  
Endothelial Cell Growth Medium (EGM)-2 BulletKitLonza#CC-3162
Ham's F-12K (Kaighn's) MediumThermoFisher#21127
Laminin Merck#L2020
Fibronectin Merck#F4759Verdunnen in ddH2O
6 Well PlateFalcon#353046
Formaldehyde SolutionMerck#F1635Verdunnen 1:10 in PBS (3.7% eindconcentratie)
Triton X-100Merck#934200.1% in ddH2O
Normal Goat Serum (10%)ThermoFisher#50062Z
Anti-von Willebrand Factor antibodyAbcam#ab69941:100 in 10% geitenserum
Goat anti-Rabbit IgG, Alexa Fluor 546ThermoFisher#A110101:500 in 10% geitenserum
4',6-diamidino-2-fenylindole, dihydrochloride (DAPI)ThermoFisher#622471:500 in ddH2O 
SlowFade Antifade KitThermoFisher#S2828
BX63 widefield microscopeOlympus
Buisvorming
96 Well PlateFalcon#353072
5 ml ronde bodembuis met zeefdopFalcon#352235
Matrigel Growth Factor ReducedCorning#354230
IX50 widefield microscopeOlympus
Sca-1+/CD31- cardiac side population isolatie34 
Reagentia
Pentobarbital Natrium 50 mg/ml voor veterinair gebruikeigen ziekenhuisapotheek#9077862Werkoplossing: 200 mg/kg
Phosphate Buffered Saline (PBS) CaCl2(-), MgCl2(-)ThermoFisher#20012
Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) CaCl2(-), MgCl2(-), fenolrood (-)ThermoFisher#14175Bereid HBSS 500 mL + 2% FBS  voor het dempen van Collagenase B-activiteit 
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) 1g/L van D-Glucose, L-Glutamine, PyruvaatThermoFisher#331885Bereid DMEM + 10% FBS  + 25 mM HEPES+ P/S voor Hoechst-kleuring
Penicillin-Streptomycin  (P/S)ThermoFisher#15140122
HEPES 1 MThermoFisher#15630080Eindconcentratie 25 mM
Fetal Bovine Serum (FBS)Hyclone#SH30071
RBC LysisBuffer (10X)BioLegend#420301/100mLVerdunnen tot 1X in ddH2O en filteren door een 0.2 µm filter
Collagenase BMerck#11088807001Eindconcentratie 1 mg/mL in HBSS, gefilterd door een 0.2 µm filter
bisBenzimide H33342 Trihydrochloride (Hoechst)Merck#B2261Bereid 1 mg/mL in ddH2O
Verapamil-hydrochloride Merck#V4629Eindconcentratie 83.3 µM 
APC Rat Anti-Mouse CD31BD Biosciences#5512620.25 µg/107cellen
FITC Rat Anti-Mouse Ly-6A/E (Sca-1)BD Biosciences#5574050.6 µg/107cellen
7-Aminoactinomycine D (7-ADD)ThermoFisher#A13100.15 µg/106cellen
APC rat IgG2a k Isotype ControlBD Biosciences#5539320.25 µg/107cellen
FITC Rat IgG2a k Isotype ControlBD Biosciences#5546880.6 µg/107

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Beltrami, A. P., et al. Adult cardiac stem cells are multipotent and support myocardial regeneration. Cell. 114 (6), 763-776 (2003).
  2. Hierlihy, A. M., Seale, P., Lobe, C. G., Rudnicki, M. A., Megeney, L. A. The post-natal heart contains a myocardial stem cell population. FEBS Letters. 530 (1-3), 239-243 (2002).
  3. Sandstedt, J., et al. Left atrium of the human adult heart contains a population of side population cells. Basic Research in Cardiology. 107 (2), 255(2012).
  4. Bolli, R., et al. Cardiac stem cells in patients with ischaemic cardiomyopathy (SCIPIO): initial results of a randomised phase 1 trial. Lancet. 378 (9806), 1847-1857 (2011).
  5. Makkar, R. R., et al. Intracoronary cardiosphere-derived cells for heart regeneration after myocardial infarction (CADUCEUS): a prospective, randomised phase 1 trial. Lancet. 379 (9819), 895-904 (2012).
  6. Wu, S. M., Chien, K. R., Mummery, C. Origins and fates of cardiovascular progenitor cells. Cell. 132 (4), 537-543 (2008).
  7. Smits, A. M., et al. Human cardiomyocyte progenitor cells differentiate into functional mature cardiomyocytes: an in vitro model for studying human cardiac physiology and pathophysiology. Nature Protocols. 4 (2), 232-243 (2009).
  8. Noseda, M., et al. PDGFRalpha demarcates the cardiogenic clonogenic Sca1+ stem/progenitor cell in adult murine myocardium. Nature Communications. 6, 6930(2015).
  9. Linke, A., et al. Stem cells in the dog heart are self-renewing, clonogenic, and multipotent and regenerate infarcted myocardium, improving cardiac function. Proceeding of the National Acadademy of Sciences of the United States of America. 102 (25), 8966-8971 (2005).
  10. El-Mounayri, O., et al. Serum-free differentiation of functional human coronary-like vascular smooth muscle cells from embryonic stem cells. Cardiovascular Research. 98 (1), 125-135 (2013).
  11. Ellison, G. M., et al. Adult c-kit(pos) cardiac stem cells are necessary and sufficient for functional cardiac regeneration and repair. Cell. 154 (4), 827-842 (2013).
  12. Oh, H., et al. Cardiac progenitor cells from adult myocardium: homing, differentiation, and fusion after infarction. Proceeding of the National Acadademy of Sciences of the United States of America. 100 (21), 12313-12318 (2003).
  13. Martin, C. M., et al. Persistent expression of the ATP-binding cassette transporter, Abcg2, identifies cardiac SP cells in the developing and adult heart. Developmental Biology. 265 (1), 262-275 (2004).
  14. Pfister, O., et al. CD31- but Not CD31+ cardiac side population cells exhibit functional cardiomyogenic differentiation. Circulation Research. 97 (1), 52-61 (2005).
  15. Pelekanos, R. A., et al. Comprehensive transcriptome and immunophenotype analysis of renal and cardiac MSC-like populations supports strong congruence with bone marrow MSC despite maintenance of distinct identities. Stem Cell Research. 8 (1), 58-73 (2012).
  16. Laugwitz, K. L., et al. Postnatal isl1+ cardioblasts enter fully differentiated cardiomyocyte lineages. Nature. 433 (7026), 647-653 (2005).
  17. Bu, L., et al. Human ISL1 heart progenitors generate diverse multipotent cardiovascular cell lineages. Nature. 460 (7251), 113-117 (2009).
  18. Smith, A. J., et al. Isolation and characterization of resident endogenous c-Kit+ cardiac stem cells from the adult mouse and rat heart. Nature Protocols. 9 (7), 1662-1681 (2014).
  19. Matsuura, K., et al. Adult cardiac Sca-1-positive cells differentiate into beating cardiomyocytes. Journal of Biological Chemistry. 279 (12), 11384-11391 (2004).
  20. Liang, S. X., Tan, T. Y., Gaudry, L., Chong, B. Differentiation and migration of Sca1+/CD31- cardiac side population cells in a murine myocardial ischemic model. International Journal of Cardiology. 138 (1), 40-49 (2010).
  21. Vicinanza, C., et al. Adult cardiac stem cells are multipotent and robustly myogenic: c-kit expression is necessary but not sufficient for their identification. Cell Death and Differentiation. 24 (12), 2101-2116 (2017).
  22. Galli, S. J., Tsai, M., Wershil, B. K. The c-kit receptor, stem cell factor, and mast cells. What each is teaching us about the others. American Journal of Pathology. 142 (4), 965-974 (1993).
  23. Konig, A., Corbacioglu, S., Ballmaier, M., Welte, K. Downregulation of c-kit expression in human endothelial cells by inflammatory stimuli. Blood. 90 (1), 148-155 (1997).
  24. Ogawa, M., et al. Expression and function of c-kit in hemopoietic progenitor cells. Journal of Experimental Medicine. 174 (1), 63-71 (1991).
  25. Bradfute, S. B., Graubert, T. A., Goodell, M. A. Roles of Sca-1 in hematopoietic stem/progenitor cell function. Experimental Hematology. 33 (7), 836-843 (2005).
  26. Goodell, M. A., Brose, K., Paradis, G., Conner, A. S., Mulligan, R. C. Isolation and functional properties of murine hematopoietic stem cells that are replicating in vivo. Journal of Experimental Medicine. 183 (4), 1797-1806 (1996).
  27. Pfister, O., et al. Role of the ATP-binding cassette transporter Abcg2 in the phenotype and function of cardiac side population cells. Circulation Research. 103 (8), 825-835 (2008).
  28. Messina, E., et al. Isolation and expansion of adult cardiac stem cells from human and murine heart. Circulation Research. 95 (9), 911-921 (2004).
  29. Davis, D. R., et al. Validation of the cardiosphere method to culture cardiac progenitor cells from myocardial tissue. PLoS One. 4 (9), e7195(2009).
  30. Carr, C. A., et al. Cardiosphere-derived cells improve function in the infarcted rat heart for at least 16 weeks--an MRI study. PLoS One. 6 (10), e25669(2011).
  31. Martens, A., et al. Rhesus monkey cardiosphere-derived cells for myocardial restoration. Cytotherapy. 13 (7), 864-872 (2011).
  32. Cheng, K., et al. Relative roles of CD90 and c-kit to the regenerative efficacy of cardiosphere-derived cells in humans and in a mouse model of myocardial infarction. Journal of the American Heart Association. 3 (5), e001260(2014).
  33. Mochizuki, M., et al. Polo-Like Kinase 2 is Dynamically Regulated to Coordinate Proliferation and Early Lineage Specification Downstream of Yes-Associated Protein 1 in Cardiac Progenitor Cells. Journal of the American Heart Association. 6 (10), (2017).
  34. Pfister, O., Oikonomopoulos, A., Sereti, K. I., Liao, R. Isolation of resident cardiac progenitor cells by Hoechst 33342 staining. Methods in Molecular Biology. 660, 53-63 (2010).
  35. Discher, D. E., Mooney, D. J., Zandstra, P. W. Growth factors, matrices, and forces combine and control stem cells. Science. 324 (5935), 1673-1677 (2009).
  36. Plaisance, I., et al. Cardiomyocyte Lineage Specification in Adult Human Cardiac Precursor Cells Via Modulation of Enhancer-Associated Long Noncoding RNA Expression. JACC: Basic to Translational Science. 1 (6), 472-493 (2016).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Celtherapielineage commitmentlaminine substraatbuikvormingfluorescentiemicroscopieceldichtheidcollagenase digestie

Gerelateerde artikelen