Phospho Stroom Cytometry met fluorescerende cel Barcoding voor eencellige signalering analyse en ontdekking van Biomarker

Samenvatting

Hier, wordt een protocol voor de analyse van de middellange - tot hoog-productie van proteïne fosforylatie gebeurtenissen op cellulair niveau gepresenteerd. Phospho stroom cytometry is een krachtige aanpak van signalering aberraties karakteriseren, identificeren en valideren van biomarkers en farmacodynamica beoordelen.

Samenvatting

Aberrant cel signalering speelt een centrale rol in de ontwikkeling van kanker en de progressie. Meest nieuwe gerichte therapieën zijn inderdaad gericht op eiwitten en eiwitfuncties en cel signalering aberraties kunnen dus dienen als biomarkers aan gepersonaliseerde behandelingsopties. In tegenstelling tot DNA en RNA analyses, kunnen wijzigingen in eiwit activiteit efficiënter de mechanismen die ten grondslag liggen aan de drug gevoeligheid en resistentie evalueren. Phospho stroom cytometry is een krachtige techniek die proteïne fosforylatie gebeurtenissen op cellulair niveau, een belangrijk kenmerk dat deze methode van andere benaderingen van antilichaam gebaseerde onderscheidt maatregelen. De methode geschikt is voor gelijktijdige analyse van meerdere signalering eiwitten. In combinatie met fluorescerende cel barcoding, kunnen grotere middellange - tot hoog-productie-gegevenssets worden verworven door standaard cytometer hardware in korte tijd. Phospho stroom cytometry kent toepassingen in studies van de fundamentele biologie, zowel in klinisch onderzoek, met inbegrip van analyse, de ontdekking van biomarker en de beoordeling van de farmacodynamica signalering. Een gedetailleerde experimenteel protocol is hier voorzien van phospho flow analyse van gezuiverde perifere bloed mononucleaire cellen, chronische lymfatische leukemie cellen gebruiken als voorbeeld.

Inleiding

Phospho stroom cytometry wordt gebruikt voor het analyseren van fosforylering eiwitniveaus bij eencellige resolutie. Het algemene doel van de methode is om cellulaire signalering patronen onder bepaalde voorwaarden in kaart. Door te profiteren van de multiparameter capaciteit van stroom cytometry, kunnen verschillende signaalroutes gelijktijdig in verschillende subgroepen van een heterogene celpopulatie zoals perifeer bloed worden geanalyseerd. Deze eigenschappen bieden voordelen ten opzichte van andere antilichaam gebaseerde technologieën zoals immunohistochemistry, enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), eiwitserie en omgekeerde fase eiwit matrix (RPPA)¹. Phospho stroom cytometry kan worden gecombineerd met fluorescerende cel barcoding (FCB), wat betekent dat individuele celsteekproeven worden aangeduid met unieke handtekeningen van fluorescente kleurstoffen, zodat ze kunnen worden vermengd, gekleurd en geanalyseerd als een monster². Dit vermindert het antilichaam-verbruik, verhoogt de robuustheid van de gegevens door de combinatie van controle en behandelde monsters, en verbetert de snelheid van de overname. De totale bevolking van de FCB kan vervolgens worden onderverdeeld in kleinere monsters en gekleurd met maximaal 35 verschillende phospho-specifieke antilichamen, afhankelijk van de hoeveelheid grondstof. Grote profiling experimenten kunnen daarmee worden uitgevoerd met standaard cytometer hardware. Phospho stroom cytometry is vereffend met profiel signalering trajecten in patiënt monsters van diverse hematologische kankers, met inbegrip van chronische lymfatische leukemie (CLL)^3,4,5, acute myeloïde leukemie (AML) ⁶ en non-Hodgkin lymfomen⁷. Phospho stroom cytometry is dus een krachtige aanpak van signalering aberraties karakteriseren, identificeren en valideren van biomarkers en farmacodynamica beoordelen.

Hier vindt u het geoptimaliseerde protocol voor analyse van CLL patiënt monsters door phospho stroom cytometry (figuur 1A). Voorbeelden van basale signalering karakterisering, anti-IgM/B-cel receptor stimulatie en drug perturbation worden weergegeven. Een gedetailleerde beschrijving van een FCB-matrix wordt gegeven. Het protocol kan gemakkelijk worden aangepast aan andere celtypes schorsing.

Protocol

Bloedmonsters werden ontvangen na schriftelijke toestemming van alle donoren. De studie werd goedgekeurd door de Commissie regionaal beleid voor medische en gezondheid onderzoek ethiek van Zuid-Oost-Noorwegen en het onderzoek op menselijk bloed werd uitgevoerd overeenkomstig de verklaring van Helsinki⁸.

Opmerking: Stap 1-3 moeten worden uitgevoerd onder steriele omstandigheden in de kap van een weefselkweek.

1. isolatie van perifere bloed mononucleaire cellen (PBMCs) van CLL patiënt bloedmonsters

Let op: Menselijk bloed moet worden behandeld volgens de voorschriften voor bioveiligheid niveau 2.

1. Verdunnen van het bloed 1:1 met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS: 136.9 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10.1 mM nb₂HPO₄ x 2 H₂O, 1,8 mM KH₂PO₄, pH 7.4) en overdracht aan 50 mL buizen (30 mL/buis).
2. Zorgvuldig laag 10 mL van een dichtheid kleurovergang medium (bvLymphoprep) naar de onderkant van de buis met behulp van een precisiepipet 10 mL.
3. Centrifugeer bij 800 x g gedurende 20 min bij 4 ° C. De PBMCs zijn nu zichtbaar op de top van de kleurovergang middellange laag dichtheid.
4. Gebruik een pipet van Pasteur te dragen van de cellen in twee nieuwe 50 mL buizen. Spoel tweemaal met PBS (Vul de buizen).
5. Centrifugeer bij 350 x g gedurende 15 min. negeren het supernatant en resuspendeer in 3 mL PBS.
6. Met behulp van een methode bij voorkeur cellen tellen.
7. Centrifugeer de cellen bij 350 x g gedurende 5 min. negeren het supernatant. Opmerking: Stappen 1,8 tot 3,2 zijn optioneel. Het is mogelijk om door te gaan rechtstreeks naar stap 3.3.
8. Resuspendeer de cellen in de foetale runderserum (FBS) aangevuld met 10% dimethylsulfoxide (DMSO) en bevriezen neer in geschikte aliquots met cryo buizen.
   Opmerking: DMSO is giftig voor de cellen. Werk snel zodra de cellen worden vermengd met de FBS/DMSO. Cellen kunnen opgeslagen lange termijn in vloeibare stikstof.

2. ontdooien van cellen

1. Snel ontdooien de cellen in een waterbad 37 ° C.
   Opmerking: DMSO is giftig voor de cellen. Werk snel te beperken van de blootstelling aan DMSO.
2. Wassen van de cellen een keer met 10 mL koude Roswell Park Memorial Instituut voedingsbodem (RPMI 1640 met aanvullende GlutaMAX, Zie Tabel van materialen).
3. Centrifugeer bij 300 x g gedurende 5 min. Verwijder het supernatant.
4. Resuspendeer de cellen in RPMI 1640 medium aangevuld met natrium pyruvaat, MEM niet-essentiële aminozuren en penicilline/streptomycine (toegevoegd bij 1 x verdunning volgens instructies) en 10% FBS. De cellen overbrengen in een maatkolf van kleincellige cultuur en laat in een broedmachine op 5% CO₂, 37 ° C gedurende 1 uur om de cellen te kalibreren.

3. voorbereiding van de cellen

1. Tellen de levensvatbare cellen met behulp van een voorkeur.
2. De cellen overbrengen in een tube van 50 mL en centrifugeer bij 300 x g gedurende 5 min. Verwijder het supernatant.
3. Resuspendeer de cellen in RPMI 1640 medium (stap 2.2) aangevuld met 1% FBS tot niet meer dan 50 x 10⁶ cellen/mL.
4. De benodigde hoeveelheid celsuspensie overbrengen in putten in een 96 goed V-bodemplaat.
   Opmerking: Aantal putten komt overeen met het aantal voorwaarden te worden getest. Voor een tijd-stimulatiekuur bemonstering uit een enkele bron. 50 µL monster per tijdstip + 50 µL van dood volume berekenen. Opslaan van monsters voor compensatie besturingselementen (één onbevlekt monster + één monster per barcoding kleurstof).
5. De 96 goed plaat overbrengen in een voorverwarmde 37 ° C waterbad. De cellen gedurende 10 minuten rusten.

4. stimulatie en fixatie van de cellen

Opmerking: Voer stappen 4-8 op de lab Bank (dat wil zeggen, niet steriel).

Let op: Het belangrijkste ingrediënt van Buffer Fix ik is paraformaldehyde, die is giftig (inhalatie en huid contact). Voorzichtig behandelen.

1. Bereiden van een 96 goed V-bodemplaat met 60 µL van Buffer Fix ik per putje per monster. Laat in het waterbad 37 ° C.
   Opmerking: Cellen: Fix buffer moet 1:1. Zodat verdamping bij 37 ° C, is de Fix-buffer in eerste instantie in overvloed.
2. U kunt desgewenst de cellen met drugs voordat stimulatie behandelen.
3. Een controlemonster 50 µL overbrengen in de fix-plaat. Meng door pipetteren omhoog en omlaag.
4. Optioneel, allereerst de stimulatie-tijdsverloop 10 µg/mL anti-IgM toe te voegen aan de cellen. Meng door pipetteren omhoog en omlaag.
5. Een 50 µL monster overbrengen in de fix-plaat op elk tijdstip. Meng door pipetteren omhoog en omlaag.
   Opmerking: Anti-IgM geïnduceerde signalering is gewoonlijk vroeg gestart (minuten).
6. Laat de fix-plaat bij 37 ° C gedurende 10 minuten nadat het laatste monster is toegevoegd.

5. fluorescerende cel Barcoding (FCB)

Opmerking: Zie tabel 1 voor een lijst met barcoding reagentia.

1. Wassen van de vaste cellen 3 x met PBS (Vul de putten).
2. Centrifugeer bij 500 x g gedurende 5 min. Verwijder het supernatant.
3. Een 96 goed V-bodemplaat met barcoding reagentia voor te bereiden. Pipetteer 5 µL van elke barcoding reagens per putje in het aantal combinaties vereist om alle monsters na de kleuring matrix, bijvoorbeeld in figuur 1Bvlek. Elk monster moet een unieke combinatie van verschillende barcoding concentraties.
4. Resuspendeer de cellen in 190 µL van PBS en overdracht aan de barcoding plaat. Meng grondig.
   Opmerking: Vlekken van één compensatie monster met de hoogste eindconcentratie gebruikt voor elke barcoding reagens en sla één onbevlekt monster.
5. Laat de cellen gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur, in het donker.
6. Wassen van de gekleurde cellen 2 x met flow wassen (PBS 1% FBS, 0.09% natriumazide) (ook wel de putjes vullen).
7. Centrifugeer bij 500 x g gedurende 5 min. Verwijder het supernatant.
8. 190 µL van flow wassen aan de cellen toevoegen en combineren de barcoded monsters in een tube van 15 mL. Elk besturingselement compensatie overbrengen in een aparte 1,7 mL-buis.
9. Centrifugeer bij 500 x g gedurende 5 min. Verwijder het supernatant.

6. cel Permeabilization voor het intracellulaire antigeen kleuring

Let op: Het hoofdbestanddeel van Perm Buffer III is methanol giftig (inhalatie en huid contact) en brandbaar. Voorzichtig behandelen.

1. 2 mL Perm Buffer III overbrengen in een tube van 15 mL. Laat bij-20 ° C, dus het is ijskoud van gebruik.
   Opmerking: De Perm-Buffer kan vanaf het begin van het experiment bij-20 ° C worden overgelaten.
2. Voeg 1,5 mL ijskoud Perm Buffer naar de barcoded celpopulatie (in een tube van 15 mL) en 100 µL aan elk besturingselement compensatie (1,7 mL in buizen in porties) drop-wise tijdens het vortexing om te voorkomen dat de cellen samen klomp.
3. De cellen rechtstreeks overdragen naar de-80 ° C. Verlof voor een minimum van 30 min.
   Opmerking: Het is natuurlijk om het experiment op dit punt onderbreken. Cellen in Perm Buffer kunnen worden opgeslagen op lange termijn bij-80 ° C.

7. antilichaam kleuring

Opmerking: Zie Tabel van materialen voor een lijst met gerapporteerde phospho-specifieke antilichamen.

1. De cellen van-80 ° C overbrengen naar een vak van ijs.
2. 3 x wassen met wash van stroom.
   Opmerking: Het is belangrijk om toe te voegen flow wassen in overmaat te zien van de cel pellet, bijvoorbeeld 3 mL flow wassen aan de barcoded-celpopulatie en 1 mL toevoegen aan elk besturingselement compensatie.
3. Centrifugeer bij 500 x g gedurende 5 min bij 4 ° C. Verwijder het supernatant.
4. Resuspendeer de barcoded-celpopulatie in een volume van stroom wash, waarmee 25 µL celsuspensie per phospho-antilichaam vlek. Resuspendeer de compensatie besturingselementen in 200 µL van flow wassen.
5. Voorbereiden op antilichamen kleuring in een 96 goed V-bodemplaat. Het eindvolume zullen 50 µL per putje. Voeg per putje, phospho-specifieke antilichaam verdund in flow wassen tot een eindvolume van 10 µL, oppervlakte marker verdund in flow wassen tot een eindvolume van 15 µL en 25 µL celsuspensie.
   Opmerking: Verdunningen van het antilichaam moeten worden getitreerd voorafgaand aan het experiment. Isotype-besturingselement bevatten.
6. Laat de cellen gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur, in het donker.
7. Wassen van de gekleurde cellen 2 x met flow wassen (Vul de putten).
8. Centrifugeer bij 500 x g gedurende 5 min. Verwijder het supernatant.
9. Resuspendeer de cellen in 150 µL van flow wassen.

8. voorbereiding van de controles van de compensatie

1. Compensatie besturingselementen voorbereiden op de antilichaam-geconjugeerd fluorochromes in parallel met de antilichaam-kleuring. Gebruik compensatie kralen volgens de instructies van de leverancier.

9. Stroom Cytometry analyse

Opmerking: Het experiment kan worden uitgevoerd op een stroom cytometer met een hoge doorvoersnelheid Sampler (HTS).

1. Optimaliseer de fotomultiplicator buis (PMT) spanning met de onbevlekt controle.
2. Compensatie-besturingselementen uitvoeren en bereken de matrix met compensatie.
3. Voorbeelden uitvoeren. De gebeurtenis tarief moet overeenkomstig de specificaties van het instrument.

10. gating strategie en Data-analyse

1. Importeer de FCS-bestanden uit het experiment naar een stroom cytometry analysesoftware zoals FlowJo of Cytobank (https://cellmass.cytobank.org).
2. Gating strategie
   1. Selecteer lymfocyten door SSC-A versus FSC-A in een dichtheid dot plot.
   2. De lymfocyten weergeven en selecteer de onderhemden door SSC-A versus FSC -W.
   3. De afzonderlijke cellen en de poort de cel typt door SSC-A versus de oppervlakte markering weergegeven.
   4. De type-celpopulatie geven in een Blue Pacific versus SSC-A dichtheid plot en selecteert u de verschillende FCB bevolkingsgroepen op basis van hun stille oceaan blauw kleuring intensiteit (Zie figuur 1A).
   5. Plot van het kanaal van phospho antilichaam tegen het FCB-kanaal, of als een heatmap (Zie figuur 1A) de fosforylatie gebeurtenissen wilt weergeven.
3. Berekenen van phospho-signalen met behulp van de inverse sinus hyperbolicus (arcsinh) van de MFI (mediane fluorescerende intensiteit) van phospho-signaal versus isotype besturingselement (basale fosforylatie niveaus, Zie Figuur 1 d), of van gestimuleerd versus ongestimuleerde cel populaties (Zie figuur 1E).

Resultaten

De belangrijkste stappen van de phospho stroom cytometry protocol worden geïllustreerd in figuur 1A. In het gepresenteerde voorbeeld werden CLL cellen gekleurd met het barcoding reagens Pacific Blue in vier verdunningen. Driedimensionale barcoding kan worden uitgevoerd door een combinatie van drie barcoding kleurstoffen, zoals geïllustreerd in figuur 1B. De afzonderlijke monsters worden vervolgens deconvoluted door latere gating ...

Discussie

Phospho stroom cytometry is een krachtige techniek voor het meten van fosforylering eiwitniveaus in afzonderlijke cellen. Aangezien de methode is afhankelijk van de kleuring met antilichamen, wordt phospho stroom cytometry beperkt door de beschikbaarheid van het antilichaam. Bovendien, met het oog op een betrouwbare resultaten, alle antilichamen moeten worden getitreerd en gecontroleerd vóór gebruik. Een gedetailleerd protocol voor titratie van antilichamen van de phospho-specifieke geweest¹²elder...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
RPMI 1640 GlutaMAX	ThermoFisher Scientific	61870-010	Celcultuurmedium
Fetal bovine serum	ThermoFisher Scientific	10270169	Additief voor celcultuurmedium
Sodium pyruvate	ThermoFisher Scientific	11360-039	Additief voor celcultuurmedium
MEM non-essential amino acids	ThermoFisher Scientific	11140-035	Additief voor celcultuurmedium
Lymphoprep	Alere Technologies AS	1114547	Dichtheidsgradiëntmedium
Anti-IgM	Southern Biotech	2022-01	Voor stimulatie van de B-celreceptor
BD Phosflow Fix Buffer I	BD	557870	Fixatiebuffer
BD Phosflow Perm Buffer III	BD	558050	Permeabilisatiebuffer
Alexa Fluor 488 5-TFP	ThermoFisher Scientific	A30005	Barcode-reagens
Pacific Blue Succinimidyl Ester	ThermoFisher Scientific	P10163	Barcode-reagens
Pacific Orange Succinimidyl Ester, Triethylammonium Salt	ThermoFisher Scientific	P30253	Barcode-reagens
Compensatiebeads	Door gebruiker gedefinieerd		Correcte soortreactiviteit
Falconbuisjes	Door gebruiker gedefinieerd
Eppendorfbuisjes	Door gebruiker gedefinieerd
96 well V-bodem platen	Door gebruiker gedefinieerd		Compatibel met de flowcytometer
Centrifuges	Door gebruiker gedefinieerd		Voor Eppendorfbuisjes, Falconbuisjes en platen
Waterbad	Door gebruiker gedefinieerd		Temperatuurgeregeld
Flowcytometer	Door gebruiker gedefinieerd		Met High Throughput Sampler (HTS)
Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Antigeen
AKT (pS473)	Cell Signaling Technologies	4075	Clone: D9E Referentie: Myhrvold et al., 2018, Single cell profiling of phospho-protein levels in.., Oncotarget, 9(10):9273-9284 Parente-Ribes et al., 2016, Spleen tyrosine kinase inhibitors reduce…, Haematologica, 101(2):e59-62 Skånland et al., 2014, T-cell co-stimulation through the CD2 and CD28…, Biochem J, 460(3):399-410 Kalland et al., 2012, Modulation of proximal signaling in normal and transformed…, Exp Cell Res, 318(14):1611-9
ATF-2 (pT71)	Santa Cruz Biotechnology	sc-8398	Clone: F-1 Referentie: Skånland et al., 2014, T-cell co-stimulation through the CD2 and CD28…, Biochem J, 460(3):399-410 Pollheimer et al., 2013, Interleukin-33 drives a proinflammatory endothelial…, Arterioscler Thromb Vasc Biol, 33(2):e47-55
BLNK (pY84)	Beckton Dickinson Pharmingen	558443	Clone: J117-1278 Referentie: Myhrvold et al., 2018, Single cell profiling of phospho-protein levels in.., Oncotarget, 9(10):9273-9284 Parente-Ribes et al., 2016, Spleen tyrosine kinase inhibitors reduce…, Haematologica, 101(2):e59-62 Kalland et al., 2012, Modulation of proximal signaling in normal and transformed…, Exp Cell Res, 318(14):1611-9 Myklebust et al., 2017, Distinct patterns of B-cell receptor signaling in…, Blood, 129(6): 759-770
Btk (pY223)/Itk (pY180)	Beckton Dickinson Pharmingen	564846	Clone: N35-86 Referentie: Myklebust et al., 2017, Distinct patterns of B-cell receptor signaling in…, Blood, 129(6): 759-770
Btk (pY551)	Beckton Dickinson Pharmingen	558129	Clone: 24a/BTK (Y551)  Referentie: Kalland et al., 2012, Modulation of proximal signaling in normal and transformed…, Exp Cell Res, 318(14):1611-9
Btk (pY551)/Itk (pY511)	Beckton Dickinson Pharmingen	558134	Clone: 24a/BTK (Y551)  Referentie: Myhrvold et al., 2018, Single cell profiling of phospho-protein levels in.., Oncotarget, 9(10):9273-9284 Parente-Ribes et al., 2016, Spleen tyrosine kinase inhibitors reduce…, Haematologica, 101(2):e59-62
CD3ζ (pY142)	Beckton Dickinson Pharmingen	558489	Clone: K25-407.69 Referentie: Skånland et al., 2014, T-cell co-stimulation through the CD2 and CD28…, Biochem J, 460(3):399-410
Histone H3 (pS10)	Cell Signaling Technologies	9716	Clone: D2C8 Referentie: Myhrvold et al., 2018, Single cell profiling of phospho-protein levels in.., Oncotarget, 9(10):9273-9284
IκBα	Cell Signaling Technologies	5743	Clone: L35A5 Referentie: Myklebust et al.,