Methodenartikel

Geautomatiseerde Multiplex immunofluorescentie paneel voor Immuno-oncologie Studies over formaline-vaste Carcinoma weefsel Specimens

DOI:

10.3791/58390

⸱

21 januari 2019

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Laboratory of Pathology, MedImmune, 2Laboratory of Pathology, MedImmune, 3Akoya Biosciences Inc., 4Department of Translational Molecular Pathology, University of Texas - MD Anderson Cancer Center

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Een gedetailleerd protocol voor een zes-marker multiplex immunofluorescentie paneel is geoptimaliseerd en uitgevoerd, met behulp van een geautomatiseerde stainer voor meer consistente resultaten en een kortere tijd van de procedure. Deze aanpak kan direct worden aangepast door elk laboratorium voor immuno-oncologie studies.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Verdere ontwikkelingen in immuno-oncologie vereisen een toegenomen inzicht in de mechanismen van kanker immunologie. De immunoprofiling analyse van weefselmonsters van Biopten van formaline-vaste, paraffine-ingebedde (FFPE) is een belangrijk instrument voor inzicht in de complexiteit van de Tumorimmunologie en ontdekken van nieuwe voorspellende biomarkers voor kanker immunotherapie geworden. Immunoprofiling analyse van weefsels vereist de evaluatie van gecombineerde markers, met inbegrip van inflammatoire cel subpopulaties en immuun controleposten, in de communicatie van de tumor. De komst van de nieuwe multiplex immunohistochemische methoden zorgt voor een efficiënter multiparametric analyse van enkele weefselsecties dan standaard monoplex immunohistochemistry (IHC). Een commercieel beschikbare multiplex immunofluorescentie zorgt (IF) methode is gebaseerd op tyramide-signaal versterking en, in combinatie met multispectrale microscopische analyse, voor een betere scheiding van het signaal van uiteenlopende markers in weefsel. Deze methodologie is compatibel met het gebruik van unconjugated primaire antilichamen die zijn geoptimaliseerd voor standaard IHC op FFPE weefselmonsters. Hierin beschrijven we in detail een geautomatiseerde protocol waarmee multiplex als etikettering van weefselmonsters carcinoom met een zes-marker multiplex antilichaam panel bestaande uit PD-L1, PD-1, CD68 CD8, Ki-67 en AE1/AE3 Cytokeratines met 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole Als een nucleaire cel counterstain. Het protocol multiplex deelvenster wordt in een geautomatiseerde IHC stainer geoptimaliseerd voor een kleuring tijd die korter is dan die van de handmatige protocol en kan worden direct toegepast en aangepast door elk laboratorium-Detective voor immuno-oncologie studies over menselijke FFPE weefselmonsters. Ook beschreven zijn verschillende controles en instrumenten, met inbegrip van een drop-control methode voor fijne controle van de kwaliteit van een nieuwe multiplex als panel, die nuttig voor de optimalisatie en validatie van de techniek zijn.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Immunoprofiling analyse van FFPE tumor weefselsteekproeven uitgegroeid tot een essentieel onderdeel van immuno-oncologie studies, met name voor de detectie en validatie van nieuwe voorspellende biomarkers voor kanker immunotherapie in het kader van klinische proeven1 ,2. Chromogenic IHC, met behulp van chemische chromogens zoals diaminobenzidine, blijft de standaard techniek in diagnostische pathologie voor de immunolabeling van de biopsie weefsel3. Standaard IHC kan ook worden gebruikt voor kanker weefsel immunoprofiling, met inbegrip van de kwantificatie van de subpopulaties van tumor-geassocieerde lymfocyten en de beoordeling van de niveaus van de expressie van immuun checkpoints zoals geprogrammeerde cel dood ligand 1 (PD-L1)4 ,5. Standaard IHC is echter beperkt, in die slechts één antigeen kan worden gelabeld per weefselsectie. Omdat immunoprofiling studies vergen doorgaans de analyse van de gecombineerde uitdrukking van verschillende markeringen, het gebruik van standaard IHC zou vereisen de kleuring van meerdere weefselsecties, elk gekleurd met een enkele gegevensmarkering, en daarom zou aanzienlijk beperkt voor de analyse van kleine weefselsteekproeven zoals kern naald biopsieën. IHC standaardmethoden zijn ook beperkt zijn voor de beoordeling van de markeringen die zijn coexpressed door diverse cel populaties, zoals gebruikelijk is bij immuun checkpoint markeringen zoals PD-L1, die wordt uitgedrukt door zowel de kankercellen als de tumor-geassocieerde macrofagen. Deze beperking is gemeld in, bijvoorbeeld, het gebruik van standaard monoplex IHC door pathologen voor de kwantitatieve analyse van een marker van de IHC uitgedrukt door diverse cel typen6. De ontwikkeling van een multiplex chromogenic IHC technieken met divers gekleurde chromogens op de dezelfde weefsel sectie vertegenwoordigt een vooruitgang over de IHC monoplex standaardmethode,7 hoewel ze blijven beperkt door de immunolabeling van slechts een paar Markeringen en ook een belangrijke technische uitdaging voor de juiste beoordeling van markeringen uitgedrukt in de dezelfde subcellular compartimenten van de dezelfde cel populaties aanwezig.

De voornoemde beperkingen met betrekking tot de beschikbaarheid van het weefsel van klinische monsters, evenals de beperkingen van multiplex chromogenic IHC technieken, hebben aanleiding gegeven tot de noodzaak tot het ontwikkelen van verbeterde multiplex methoden voor immuno-oncologie studies op basis van fluorescerende labeling gecombineerd met beeldvormende systemen die effectief de signalen van meerdere fluorophores van de dezelfde dia scheiden kunnen. Een dergelijke techniek is gebaseerd op tyramide signaal versterking (TSA) in combinatie met multispectrale microscopie imaging voor efficiënte kleur scheiding8. Een commercieel beschikbare TSA gebaseerde kit maakt gebruik van fluorophores geoptimaliseerd voor multispectrale imaging8 (Zie Tabel van materialen). Een cruciaal voordeel van dit systeem is de verenigbaarheid ervan met de dezelfde labelloze primaire antilichamen die reeds zijn gevalideerd en geoptimaliseerd voor standaard chromogenic IHC9,10,11. Hierdoor niet alleen sneller optimalisatie, maar ook flexibiliteit in de optimalisatie en paneel wijzigingen opnemen van nieuwe doelen. Bovendien, de methode van de TSA multiplex immunofluorescentie (mIF) kan worden geoptimaliseerd voor commercieel beschikbare geautomatiseerde IHC stainer systemen, waardoor voor een eenvoudige overdracht van monoplex chromogenic IHC aan mIF.

Hier presenteren we een protocol voor een mIF paneel voor immuno-oncologie-studies die is gebaseerd op mIF TSA kleuring geautomatiseerde en een multispectrale scanner voor imaging gebruikt. Dit protocol kan worden aangepast of gewijzigd door elk laboratorium gebruiker met toegang tot de beschreven instrumentatie en reagentia. Het protocol bevat een panel van zes primaire antilichamen voor de immunoprofiling van carcinomen: PD-L1, PD-1, CD68 (als een pan-macrofaag marker), CD8 (cytotoxische T cellen), Ki-67, en AE1/AE3 (pan-cytokeratin, gebruikt als een epitheliale merker voor de identificatie van carcinoom cellen). Een recente studie beschrijft de optimalisatie van een handmatige TSA mIF protocol met behulp van chromogenic IHC als standaard referentie voor het valideren van de multiplex12kleuring. De bijgewerkte methode hier gepresenteerd is ontwikkeld met behulp van een commercieel beschikbaar, zeven-kleur TSA kit geoptimaliseerd in een geautomatiseerd brandschilderen, drastisch verkorten van de kleuring tijd van 3 – 5 dagen tot 14 h, terwijl ook het verbeteren van de consistentie van de kleuring. Naast het gedetailleerde belangrijkste protocol hier gepresenteerd, bevat een sectie Aanvullende materialen de "drop-control"-methode, een extra kwaliteitscontrole proces te evalueren van een nieuw mIF deelvenster, evenals technische notities voor de optimalisatie, probleemoplossing en ontwikkeling van nieuwe multiplex panelen om de laboratorium-gebruiker instellen en optimaliseren van de mIF TSA methode voor aangepaste mIF panelen te helpen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opmerking: Het protocol gepresenteerd hier wordt beschreven hoe u immunoprofiling voor een mIF panel met behulp van TSA voor zes antilichamen (CD68, ki67, PD-L1, PD-1, CD8 en AE1/AE3) op een geautomatiseerde stainer (Zie Tabel van materialen). Het protocol wordt ook beschreven hoe uit te voeren van de daling van de besturingselementen voor een controle van de kwaliteit van een nieuwe mIF paneel (Zie Aanvullende materialen). In dit protocol, kleuring gebeurt met acht onbevlekt FFPE glijbanen van menselijke tonsillen (positieve controle) en acht onbevlekt dia's uit menselijke longen adenocarcinoom. De eerste dia wordt gebruikt voor volledige multiplex kleuring met alle zes markeringen, de tweede dia voor de controle van de isotype waarin geen primaire antilichamen worden gebruikt en de resterende zes dia's voor de besturingselementen van de daling (Zie Aanvullende materialen). Een extra controle voor weefsel autofluorescence wordt sterk aanbevolen en moet altijd worden opgenomen in een multiplex studie (Zie Aanvullende materialen). Onderzoekers kunnen echter gebruikmaken van andere tumor typen en de besturingselementen volgens hun eigen doelen van het project. Laboratorium gebruikers zonder eerdere ervaring met de mIF TSA methode en technieken van multispectrale scanner moeten lezen de Multiplex gids van de ontwikkeling van de IHC (beschikbaar online op http://info.perkinelmer.com/2016-lp-Opalassaydevelopmentguide-lp). Hoewel deze handleiding een handmatige protocol beschrijft, biedt het ook een goede introductie tot de mIF kleuring methode. Alle weefselsecties werkzaam in dit protocol werden geanonimiseerd en goedgekeurd volgens de verklaring van Helsinki.

1. de weefselmonsters

  1. Selecteer een FFPE menselijke tonsillen monster met lymfoïde hyperplasie moet worden gebruikt als positieve controle en een FFPE menselijke longen adenocarcinoom monster waarvan bekend is dat PD-L1 positief. Bespreek de haematoxyline en eosine (H & E) dia's van de geselecteerde long kanker blokken ter bevestiging van de aanwezigheid van een tumor. Het is belangrijk te voorkomen dat tumoren met overvloedige gebieden van necrose als dit aspecifieke achtergrondkleuring verhogen kan.
    Opmerking: Voor deze optimalisatie, Vermijd het gebruik van paraffineblokken die zijn opgeslagen voor 10 jaar of meer en weefsel met een gedroogde verschijning in het blok van paraffine (consult met een technicus van de histologie).
  2. Gebruikend microtome, 10 opeenvolgende seriële secties van elk blok, 4 µm dik gesneden. De secties op een positief geladen glasplaatje gebruikt voor IHC, één sectie per dia koppelen.
    Opmerking: Secties moeten worden gemonteerd perfect plat zonder rimpels, als rimpels kleuring artefacten kunnen genereren. De dia's nummeren van de seriële secties vanaf 1 tot en met 10.
  3. Voorbereiden van een nieuwe H & E dia op de eerste sectie. Bekijk de H & E dia met behulp van een patholoog ter bevestiging van de aanwezigheid van tonsillen weefsel of Long tumor nog in het blok.
    Opmerking: Deze H & E dia kan helpen, later met de selectie van de regio's van belang voor de multispectrale analyse en fenotypering.
  4. Opslag onbevlekt secties in een kunststof dia doos bij 4 ° C voor maximaal drie maanden.

2. het creëren van een nieuwe mIF Staining programma op een geautomatiseerd Stainer: registratie van de reagentia

Opmerking: Reagentia moeten worden toegevoegd aan de lijst van de reagens in de geautomatiseerde stainer software voordat ze beschikbaar voor gebruik in protocollen zijn. Zie de Tabel van materialen voor informatie over de geautomatiseerde stainer model en software-versie.

  1. Klik op het tabblad van de reagentia binnen de geautomatiseerde stainer software. Klik op toevoegen aan te wijzen van een nieuwe reagens. Voer de naam (bijvoorbeeld "520 TSA reagens") en de afgekorte naam (bijvoorbeeld "520 TSA"), overwegende dat er is een maximum van acht tekens. Selecteer aanvullende uit de drop-down menu en stel de leverancier. Wijzig niet Enkel/dubbel vlek uit Één/opeenvolgend DS. De kleuring van protocol bij Protocol Fstandaardwaarde instellen. Stel het standaardprotocol voor HIER op ER1 20.
  2. Sla het nieuwe reagens en herhaal stap 2.1 voor alle reagentia vermeld in tabel 1.

3. geautomatiseerde Stainer: Registratie van de Containers

  1. Schrijf de naam van het reagens te gebruiken aan de zijkant van elke container. Scan de barcode op de kant. Selecteer in het pop-upvenster, het juiste reagens in de lijst. Selecteer een vervaldatum en sla.
  2. Herhaal de procedure in stap 3.1 voor alle reagentia vermeld in tabel 1.
  3. Registreer de Open onderzoek Kit. Scannen van beide barcodes aan de zijkant van de kit en volg de aanwijzingen op het scherm. Naam van de kit "Multiplex Research Kit 1." Registreren van de 1 x tris (hydroxymethyl) aminomethane (Tris)-gebufferde zoutoplossing als onderdeel van deze kit (tabel 1).

4. geautomatiseerde Stainer: Oprichting van een mIF Protocol programma

  1. Het basis protocol van multiplex is voorgeladen met de naam Opaal 7 Multiplex op nieuwe geautomatiseerde stainers (Zie de versie van het model en software in de Tabel van de materialen). Zoek het protocol met een filter op "all" in plaats van "voorkeur" op het scherm van het protocol. Als het basis protocol niet aanwezig is, dan uw geautomatiseerde stainer-software bijwerken met de hulp van de fabrikant.
  2. Alle wijzigingen moeten worden uitgevoerd op de exemplaren van het oorspronkelijke protocol. Voordat u wijzigingen aanbrengt, sla het origineel en een kopie maken door te klikken op het tabblad protocollen , vervolgens met de rechtermuisknop op het protocol van Opal 7 Multiplex en exemplaarte selecteren.
  3. Wijzig de naam 7 Multiplex protocol 1 in het nieuwe venster en selecteer het tabblad geassocieerd met het juiste apparaat (vloer model of benchtop). Overeenkomen met het protocol in de Aanvullende tabel S1. Klik op Toevoegen reagens toe te voegen een 10 min peroxidase remming stap (die geen deel uitmaakt van het standaardprotocol) en selecteer het peroxidase-remmer als het reagens.
  4. Bevestigen dat de blokkerende stappen een buffer met blokkerend PKI gebruiken. Ervoor zorgen dat elke primair antilichaam verwijst naar de geschikt reagens, dat secundair antilichaam stappen gebruiken een HRP-polymeer, en dat spectrale 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) voorzien van de kit multispectrale automatisering wordt gebruikt. Bevestig alle keuzes door het controleren van het reagens die bestemd zijn voor elke respectieve stap in het drop-down menu op het scherm van het protocol.

5. geautomatiseerde Stainer: Toevoeging van Drop besturingselementen en Isotype Control Protocol

  1. Kopieer de naam 7 Multiplex protocol 1 en wijzig het 7 MultiplexProtocol 1 CD68 DROP. Het reagens CD68 antilichaam Verander Muis IgG en sla het protocol.
  2. Zes meer nieuwe protocollen, één voor elk besturingselement drop en één voor de controle van de volledige isotype (het veranderen van alle antilichamen aan de juiste isotypes) op dezelfde manier maken

6. automatische Stainer: Dia voorbereiding Protocol

  1. Kopieer het prestaining protocol * bak en Dewax en de naam van dit protocol multispectrale bak en Dewax 2 h.
  2. Aanpassen van het protocol zodat deze overeenkomen met de in tabel 2aangegeven reagentia. Bak-dia's gedurende 2 uur bij 60 ° C. Dewax voor 30 s bij 72 ° C.

7. automatische Stainer: Voorbereiding van de reagentia

  1. Één onderzoek detectie kit voor te bereiden. Een reagens moet permanent gekoppeld aan deze kit, zodat de vulling de 30 mL open container gemarkeerd voor 1 x Tris-gebufferde zoutoplossing (TBS) met 1 x TBS en zoek dit in positie 1 (het verst van het handvat) in het onderzoek detectie kit aangewezen Multiplex Research Kit 1. dit reagens wordt permanent gekoppeld dit onderzoek kit en moet niet veranderen van positie voor toekomstig gebruik.
  2. Label twee 30 mL open containers Multispectrale blok en Multispectrale secundaire. Vul de container Multispectrale blok met 30 mL van blokkerende buffer/antilichaam verdunningsmiddel uit de multispectrale kleuring kit. Vul de Multispectrale secundaire container met 30 mL anti-mouse/anti-rabbit secundair antilichaam polymeer uit de multispectrale kleuring kit.
  3. Tien 7 mL open containers voor te bereiden. Het vereiste volume in microliters is 600 + (150 x [aantal dia's]). Elke antilichaam zal worden toegepast op 12 dia's in dit geval (zes tonsillen en zes longkanker). De etikettering en de volumes voor alle containers zijn aangegeven in tabel 3.
  4. Voor elke antilichaam buis, eerst toevoegen het antilichaam verdunningsmiddel, gevolgd door de geconcentreerde primair antilichaam in de volumes aangegeven in tabel 3. Meng door zachte pipetteren.
  5. Een open container van 7 mL voorbereiden DAPI, met behulp van vier druppels DAPI concentraat per milliliter van tweemaal gedestilleerd water; een totaal van 16 zal worden gekleurd met de DAPI (600 + [150 x 16] = 3.000 µL). Voeg 3 mL tweemaal gedestilleerd water plus 12 druppels spectrale DAPI in de container. Bereiden van verse DAPI voor elke run.
  6. Een open container van 7 mL voorbereiden peroxidase-remmer. Alle 16 dia's zullen worden behandeld met peroxidase-remmer (600 + [150 x 16] = 3.000 µL). Voeg 3 mL van peroxidase blok in de container.
  7. Resuspendeer voordat u voorbereidt werken concentraties van fluors, alle gelyofiliseerd fluors door 75 µL van dimethylsulfoxide toe te voegen aan elke fluor buis geleverd door de fabrikant. Meng door pipetteren. Dit is de TSA fluor voorraad. Bewaren bij 4 ° C.
  8. Zes titratie containers, één voor elke fluor voor te bereiden. Het vereiste volume in microliters is 350 + (150 x [aantal dia's]). Elke fluor zal worden toegepast op 16 dia's in dit geval (acht tonsillen en acht longkanker). De etikettering en de volumes voor alle containers zijn aangegeven in tabel 4.
  9. Wanneer alle reagentia zijn geregistreerd en bereid, plaatst u elke container op elke locatie op een rek en laden alle reagentia op de geautomatiseerde stainer. De sonde zal het volume van elk reagens bevestigen.

8. geautomatiseerde Stainer: Proeven van Setup en multispectrale kleuring

  1. In de geautomatiseerde stainer software, klikt u op Slide Setup bij de bovenkant van het scherm. Klik op Add studie. Vullen van het pop-upvenster met de studie ID, naam van de studie en commentaar.
    1. Selecteer de naam van de onderzoeker voert de kleuring uitvoeren vanaf de drop-down lijst. Laat het Doseer volume op 150 µL. Selecteer multispectrale Dewax voor voorbereiding Protocol. Klik op OK en dia toevoegen. Typ onder opmerkingen"Multiplex 1 Long 123ABC." De volgende velden in te vullen zoals aangegeven: Weefseltype = Test weefsel; Doseer volume = 150 µL; Staining modus = Single, Routine; Marker = negatief; Kleuring = Typ "7 Multiplex Protocol 1"; Voorbereiding = multispectrale Bake, Dewax 2 h; Here = HIER 20 min met ER1.
  2. Klik op de dia toevoegen en wijzigen van de opmerkingen en het protocol bij de daling van de controle-dia's en isotype controle dia toevoegen. Wanneer alle dia's zijn toegevoegd aan de studie, sluit het venster Add dia en etiketten afdrukken. Toepassing van de etiketten op het gebied van de geschikte etiket op elke dia.
  3. Laden van de dia's in de rekken, cover tegels in de juiste stand van de toepassing, de rekken in de geautomatiseerde stainer invoegen en verlagen de schaaltjes. Het apparaat scant de dia-labels.
  4. Wanneer alle dia's en reagentia zijn gescand en gemeten. De stormloop knop (►) zal actief worden. Als de autostainer eventuele fouten, zoals onvoldoende reagens volume detecteert, weergegeven een geel waarschuwingssymbool door de desbetreffende lade. Als een fout optreedt, klik met de rechtermuisknop het waarschuwingssymbool en verhelpen van de fout.
  5. Initiëren kleuring onmiddellijk of een vertraagde begin instellen. Het protocol is ongeveer 14 h in duur. Opmerking: Controleer dat het protocol voltooit op een moment wanneer de dia's kunnen worden onmiddellijk verwijderd zoals exess wassen kleuring resultaten kon beïnvloeden.

9. Coverslipping van de multispectrale dia 's

  1. De dia's te verwijderen uit de geautomatiseerde stainer en bewaar ze in een rek ondergedompeld in 1 x eetlepels
  2. Monteer de monsters met no. 1.5 coverslips en 15 µL van de media van de montage (Zie Tabel van materialen). Alle bubbels verwijderen door op het dekglaasje aan met een uiteinde van de pipet zachtjes te drukken.
  3. Laat de dia's te genezen overnachten bij kamertemperatuur op de laboratorium-Bank. Niet-uitgeharde dia's kunnen onmiddellijk worden gescand met zorgvuldige omgang.

10. multispectrale Scanner

  1. Zet de multispectrale scanner en de computer (Zie Tabel van materialen voor model-en software). Start de software van de controle van de Microscoop. Open de voordeur van de multispectrale scanner door te drukken op de touch-sensitive knoop aan de voorkant van het apparaat. Elke Openspringende vervoerder in de scanner bevat vier dia's. Laden van alle dia's in de vervoerders en de volgorde opnemen voordat de vervoerders in het apparaat laden.
  2. Selecteer Bewerken Protocol en klikt u op Nieuw...; Maak vervolgens de protocolnaam Multiplex paneel 1 en Drop besturingselementen. De studie naam Multiplex Panel ontwikkelinghebt gemaakt en klik op Maken Protocoltypt Overzicht scannen Filter DAPI; Selecteer vervolgens Hele dia scannen en pixelresolutie 0,50 µm (20 X). Alle filters en banden moeten worden vertegenwoordigd. Als dat niet het geval is, klikt u op Filters bewerken en Bands, alle vijf filters (DAPI, FITC CY3, Texas Red en CY5) selecteren en klik vervolgens op Bewerken posities.
  3. De allesdrager door het selecteren van de vervoerder met de volledige multiplex van adenocarcinoom van de Long. Selecteer de juiste dia met behulp van de grafische gebruikersinterface. Het weefsel focus handmatig of met behulp van de autofocus. Navigeer naar elk willekeurig deel met aanvaardbare DAPI kleuring en klik op Auto-bloot om de blootstelling in milliseconden (0 – 2.000 ms).
  4. Herhaal de procedure voor alle vijf filter sets in zowel de hele scannen en MSI regio kolommen. Zorg om te navigeren naar een gebied met aanvaardbare kleuring en heroriëntatie van de Microscoop vóór de blootstelling voor elk filter en vergroting niveau te kunnen vaststellen. Auto-bloot voor alle vijf filters in een 20 x totale scan en 20 x multispectrale beelden (MSI) multispectrale regio's. Selecteer een pixelresolutie van 0,50 µm (20 x). Sla het protocol en klikt u op terug om terug te keren naar het beginscherm van de Vectra software; Klik vervolgens op Dia's scannen.
  5. Openen van de interface voor elke dia en taak ingesteld op het scannen. Studie aan Multiplex Panel ontwikkeling, ingesteld Protocol Multiplex paneel 1en Drop besturingselementen, en Dia-ID aan Multiplex Lung ABC123, Multiplex CD68 Drop Lung ABC123, enz . Wanneer alle dia's hebben het label en taken zijn ingesteld, klikt u op scannen. De geautomatiseerde multispectrale scanner zal het uitvoeren van volledige-dia scans van alle dia's met behulp van alle vijf filters.

11. multispectrale Scanner: Multispectrale Imaging

  1. Als de scans voltooid zijn, opent u de QPTIFF -software ("Phenochart") en klik op Load dia in de linkerbovenhoek. Hiermee opent u een QPTIFF, die is een vijf-filter geheel-dia scan. Elke laag bevat gegevens uit meer dan één fluor, dus het hulpprogramma beperkt is, maar de weefsel structuur en brede expressiepatronen zijn duidelijk en kunnen worden gebruikt voor het selecteren van regio's voor MSI.
  2. Navigeer naar en openen de juiste dia in de studie met behulp van de drop-down boom aan de linkerkant. Log in (rechtsboven) met de initialen van de gebruiker.
  3. Vijf regio's voor MSI met behulp van het gereedschap stempel op de bovenkant van het scherm selecteren Raadpleeg een patholoog als die beschikbaar is. Selecteer onder Selecteer voor, acquisitie; Selecteer onder grootte in velden, 1 x 1; en selecteer onder veld-beperking, 0,5 µm (20 x). Gebaseerd op cytokeratin (CK) kleuring (voornamelijk in Cy5), Selecteer verschillende regio's met zowel de tumor (CK +) en de stroma (CK-) aan het image van de algehele scan worden gemaakt. Herhaal deze procedure voor elke dia.
  4. Zodra alle MSIs zijn geselecteerd, sluit het Phenochart software en terugkeren naar de Vectra -software. Wijzigen van de taak van het scannen naar MSI voor elke dia en klik vervolgens op scannen om opnieuw uit te voeren van de MSI-collectie.

12. spectrale randverwijdering

Opmerking: De spectrale unmixing stap is vereist voor Zenderscheiding en beeldanalyse van de dia's. Voordat de spectrale randverwijdering wordt uitgevoerd in de inForm-software, moet de spectrale bibliotheek worden gebouwd met behulp van longkanker adenocarcinoom dia's gekleurd met elk fluor alleen en met DAPI alleen. Deze procedure wordt ook beschreven in het bovengenoemde Multiplex IHC Assay gids van de ontwikkeling.

  1. Wanneer de verwerving van MSI voltooid is, gebruik van de spectrale unmixing ("InForm") software om bestanden te openen in de map MSI . Deze bestanden eindigen in de .im3 bestandstype extensie.
  2. Selecteer onder beeldformaat, Multispectral; Selecteer onder Sample-formaat, fluorescentie; en schakel onder spectrale bibliotheek bron, InForm.
  3. Als fluors, selecteert u en alle zes fluors en DAPI laden vanuit de bibliotheek gebouwd met de Long adenocarcinoom bibliotheek glijbanen. Klik op Alle bereiden (linksonder). Spectrale unmixing software zal het uitvoeren van spectrale randverwijdering op alle geopende afbeeldingen, met behulp van de meegeleverde spectrale profielen.
  4. Met een patholoog, beoordelen de kleuring patroon tegen chromogenic enkele vlekken van hetzelfde doel in opeenvolgende dia's van de dezelfde weefsel.

13. evaluatie van de intensiteit van de fluorescentie en signaal demping

Opmerking: Het hulpmiddel van de graven, die wordt weergegeven als een pijl met een kleine bruine doos, is het belangrijkste instrument voor de optimalisatie van de multiplex en moeten vaak worden gebruikt (Zie Aanvullende materialen). Hulpprogramma voor het graven in de spectrale unmixing software, beoordelen de signal-to-noise verhouding, die minimaal moet meer bedragen dan 10:1 (Zie Aanvullende materialen voor het oplossen van problemen en voor de evaluatie van de multiplex kleuring met de daling van de controles).

  1. 13.1. met een afbeelding geopend in de spectrale unmixing software, gaan de graven tool en enquête beelden te beoordelen van de intensiteit van de fluorescentie van elk kanaal. De intensiteit van de doelgroep in longweefsel is tussen 10 en 20 genormaliseerde graven. De genormaliseerde graven tool is afgebeeld in Figuur 1.
  2. Dia's met maximaal signaal graven van minder dan 10 of normale signaal gebied graven van minder dan vijf voor elke hoofdstukmarkering uitsluiten zodat autofluorescence en uit-target vlekken niet met het authentieke signaal concurreren.
  3. Uitsluiten dia's met maximum telt meer dan 30 voor elk kanaal om te voorkomen dat de spectrale bloeden of inefficiënte spectrale randverwijdering.
  4. Adres hoog of laag genormaliseerd graven door de TSA concentratie aan te passen.

14. multispectrale beeldanalyse

  1. Open een of meer MSI in de spectrale unmixing software en alleen Selecteer fluors voor randverwijdering die zijn vertegenwoordigd in ten minste één afbeelding openen. Klik op Alle bereiden om unmix alle geopende kleurenafbeeldingen om spectraal ongemengde beelden opleveren.
  2. Selecteer het gereedschap graven graven enquête over elk beeld door zweefde over het (de) gebied(en) van belang.
  3. Selecteer het pictogram van het oog om de weergave-editor te openen. Selecteer en pas de intensiteit van de weergave van elk onafhankelijk kanaal.
  4. Selecteert u configureren om te openen de weefsel segmentatie, cel segmentatie fenotypering en scoren modules. Deze hulpprogramma's zijn nodig voor de objectieve validatie van multiplex kleuring tegen chromogenic enkele vlekken en kunnen worden gebruikt voor het genereren van gegevens van de kwantitatieve phenoptic (Figuur S1).
  5. Gebruik het tabblad exporteren te slaan grijswaarden, TL, pathview-stijl ongecomprimeerde TIFF- en gegevensbestanden van de phenoptic analyse modules voor verdere analyse, archivering en presentaties (Figuur S1).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het protocol hier beschreven zal produceren resultaten zoals aangegeven in Figuur 2. Beginnen met een evaluatie van de kleuring in het besturingselement van de tonsillen, beginnend met de oppervlakte squamous cell epitheel. De histologie van het monster van de tonsillen kan worden herzien met een patholoog, met de H & E dia als referentie. Als chromogenic IHC secties worden uitgevoerd met de dezelfde markers op hetzelfde weefsel blok, kunnen dan deze worden g...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De lopende kanker immunotherapie revolutie is opening nieuwe en veelbelovende therapeutische opties voor kanker patiënten13. Vooruitgang op het gebied van immuno-oncologie vergt meer kennis van de inflammatoire tumor communicatie, niet alleen om te begrijpen van de biologie van de immunologische mechanismen die betrokken zijn bij carcinogenese, maar ook om voorspellende biomarkers voor nieuwe immunotherapie gebaseerde behandelingen1,2. Als...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit werk werd gesteund door MedImmune, de wereldwijde biologics R & D arm van AstraZeneca. C.W., K.R. en C.C.H. zijn werknemers van Perkin Elmer, die de reagentia (TSA kit produceert) en multispectrale scanners die werden gebruikt in dit werk. M.S., K.D., A.H., W.Z. C. Bagnall, C. Brown, J.C., A.L., K.S., M.R. en J.R.C. zijn werknemers van MedImmune met stock eigendom en/of voorraad belangen of opties in AstraZeneca.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Redactionele ondersteuning werd geleverd door Deborah Shuman van MedImmune.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
"InForm 2.4.2" Software voor spectraal unmixing en beeldanalysePerkinElmerCLS151066Genoemd "spectral unmixing software" in tekst
"Phenochart 1.0.9" QPTIFF Software voor selectie van MSI en overzichtsweergave van dia'sPerkinElmerCLS151067Genoemd "QPTIFF software" in tekst
#1.5 DekglasjesSigma Aldrich2975246
200 Proof EthanolKoptecV1001
20x Tris-buffered salineVWRJ640-4L
Antilichaam verdunnerDAKOS2203
Anti-CD68 muis monoklonaalDAKOM087601-2Clone PG-M1
Anti-CD8 konijn monoklonaalVentanaM5392Clone SP239
Anti-CK muis monoklonaalDAKOM351501-2Clone AE1/AE3
Anti-ki67 muis monoklonaalDAKOM724001-2Clone MIB-1
Anti-PD-1 konijn monoklonaalCell Signaling#86163Clone D4W2J
Anti-PD-L1 konijn monoklonaalVentana790-4905Clone SP263
Bond OntwaxingsoplossingLeicaAR9222Genoemd "ontwaxingsoplossing" in tekst
Bond Epitope Retrieval Solution 1LeicaAR9961Genoemd "ER1" in tekst
Bond Epitope Retrieval Solution 2LeicaAR9640Genoemd "ER2" in tekst
Bond Open Containers, 30 mLLeicaOP309700Genoemd "open containers 30 mL" in tekst
Bond Open Containers, 7 mLLeicaOP79193Genoemd "open containers 7 mL" in tekst
Bond Polymer Refine DetectionLeicaDS9800Genoemd "chromogeen detectiekit" in tekst
Bond Research Detection KitLeicaDS9455Genoemd "onderzoeksdetectiekit" in tekst
Bond Titration KitLeicaOPT9049Genoemd "titratiekit" in tekst
Bond Universal Covertile NovocastraLeicaS21.2001Genoemd "covertiles" in tekst
Bond Wash Solution 10X ConcentraatLeicaAR9590Genoemd "10x wasoplossing" in tekst
BondRX AutostainerLeicaGenoemd "geautomatiseerde kleurstofapplicateur" in tekst
BondRX Software Versie 5.2.1.204LeicaGenoemd "geautomatiseerde kleurstofapplicateur software" in tekst
Opal 7-Kleur Automatisering IHC KitPerkinElmerNEL801001KTGenoemd "multispectrale kleuringskit" in tekst
Peroxidase BlokLeicaRE7101
ProLong Diamond Antifade MountantThermoP36965Genoemd "dia mountant" in tekst
Starfrost Dia'sFisher15-183-51
Vectra Polaris Multispectral Microscoop met "Vectra 3.0.5" Software voor Multispectrale Microscoop ControlePerkinElmerCLS143455Genoemd "microscoopcontrolesoftware" in tekst

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Bethmann, D., Feng, Z., Fox, B. A. Immunoprofiling as a predictor of patient's response to cancer therapy-promises and challenges. Current Opinion in Immunology. 45, 60-72 (2017).
  2. Taube, J. M., et al. Implications of the tumor immune microenvironment for staging and therapeutics. Modern Pathology. 31 (2), 214-234 (2018).
  3. Idikio, H. A. Immunohistochemistry in diagnostic surgical pathology: contributions of protein life-cycle, use of evidence-based methods and data normalization on interpretation of immunohistochemical stains. International Journal of Clinical and Experimental Pathology. 3 (2), 169-176 (2009).
  4. Rebelatto, M. C., et al. Development of a programmed cell death ligand-1 immunohistochemical assay validated for analysis of non-small cell lung cancer and head and neck squamous cell carcinoma. Diagnostic Pathology. 11 (1), 95(2016).
  5. Parra, E. R., et al. Immunohistochemical and image analysis-based study shows that several immune checkpoints are co-expressed in non-small cell lung carcinoma tumors. Journal of Thoracic Oncology. 13 (6), 779-791 (2018).
  6. Rehman, J. A., et al. Quantitative and pathologist-read comparison of the heterogeneity of programmed death-ligand 1 (PD-L1) expression in non-small cell lung cancer. Modern Pathology. 30 (3), 340-349 (2017).
  7. Dixon, A. R., et al. Recent developments in multiplexing techniques for immunohistochemistry. Expert Review of Molecular Diagnostics. 15 (9), 1171-1186 (2015).
  8. Stack, E. C., Wang, C., Roman, K. A., Hoyt, C. C. Multiplexed immunohistochemistry, imaging, and quantitation: a review, with an assessment of Tyramide signal amplification, multispectral imaging and multiplex analysis. Methods. 70 (1), 46-58 (2014).
  9. Feng, Z., et al. Multiparametric immune profiling in HPV- oral squamous cell cancer. JCI Insight. 2 (14), (2017).
  10. Feng, Z., et al. Multispectral imaging of formalin-fixed tissue predicts ability to generate tumor-infiltrating lymphocytes from melanoma. Journal for ImmunoTherapy of Cancer. 3, 47(2015).
  11. Granier, C., et al. Multiplexed immunofluorescence analysis and quantification of intratumoral PD-1+ Tim-3+ CD8+ T cells. Journal of Visualized Experiments. (132), e56606(2018).
  12. Parra, E. R., et al. Validation of multiplex immunofluorescence panels using multispectral microscopy for immune-profiling of formalin-fixed and paraffin-embedded human tumor tissues. Scientific Reports. 7 (1), 13380(2017).
  13. Ribas, A., Wolchok, J. D. Cancer immunotherapy using checkpoint blockade. Science. 359 (6382), 1350-1355 (2018).
  14. Gorris, M. A. J., et al. Eight-color multiplex immunohistochemistry for simultaneous detection of multiple immune checkpoint molecules within the tumor microenvironment. Journal of Immunology. 200 (1), 347-354 (2018).
  15. Parra, E. R., et al. Effect of neoadjuvant chemotherapy on the immune microenvironment in non-small cell lung carcinomas as determined by multiplex immunofluorescence and image analysis approaches. Journal for ImmunoTherapy of Cancer. 6 (1), 48(2018).
  16. Rimm, D., Schalper, K., Pusztai, L. Unvalidated antibodies and misleading results. Breast Cancer Research and Treatment. 147 (2), 457-458 (2014).
  17. Baskin, D. G., Hewitt, S. M. Improving the state of the science of immunohistochemistry: the Histochemical Society's standards of practice. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 62 (10), 691-692 (2014).
  18. Freedman, L. P., et al. The need for improved education and training in research antibody usage and validation practices. Biotechniques. 61 (1), Letter to the Editor 16-18 (2016).
  19. Hewitt, S. M. Reproducibility: it is just good science. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 64 (4), 223(2016).
  20. Uhlen, M., et al. A proposal for validation of antibodies. Nature Methods. 13 (10), 823-827 (2016).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

FFPE weefselmonstersgeautomatiseerde IHC kleurmachinetyramide signaalversterkingmultispectrale microscopiePD L1 PD 1 CD68 CD8 Ki 67 AE1 AE3drop control methodespectrale ontmenging softwaremultispectraal beeldvormingsplatform

Gerelateerde artikelen