Isolatie van fysiologisch actief thylakoiden en hun gebruik in energie-afhankelijke proteïne vervoer Assays

Summary

Wij presenteren protocollen hierin voor hoog rendement isolatie van fysiologisch actief ze en eiwit vervoer testen voor de chloroplast twin arginine translocatie (cpTat), secretoire (cpSec1) en signaal erkenning deeltje (cpSRP) trajecten.

Abstract

Chloroplasten zijn de organellen in groene planten verantwoordelijk voor de uitvoering van talrijke onontbeerlijke metabolische pathways, vooral fotosynthese. Binnen de chloroplasten, het thylakoïde membraan systeem herbergt alle de fotosynthetische pigmenten, reactie center complexen en het merendeel van de elektron-vervoerders, en is verantwoordelijk voor de licht-afhankelijke ATP-synthese. Meer dan 90% van chloroplast eiwitten zijn gecodeerd in de kern, vertaald in het cytosol en vervolgens geïmporteerd in de chloroplast. Verdere eiwit vervoer in of over het membraan thylakoïde maakt gebruik van een van de vier trajecten van de translocatie. Hier beschrijven we een hoog rendement methode voor isolatie van vervoer-bevoegde ze uit erwten (Pisum sativum), samen met vervoer testen door middel van de drie energie-afhankelijke cpTat, cpSec1 en cpSRP-gemedieerde trajecten. Deze methoden kunnen experimenten met betrekking tot thylakoïde eiwit lokalisatie, vervoer energetics en de mechanismen van de translocatie van de eiwitten in biologische membranen.

Introduction

Bijna alle van de eiwithoudende machine verantwoordelijk voor goede chloroplast functie moet worden translocated van het cytosol¹. Op de chloroplast enveloppen, worden eiwit substraten geïmporteerd door middel van de translocon van het buitenste membraan (TOC) en de translocon van het binnenste membraan (TIC)². Verder richt aan de thylakoïde membraan en lumen vindt plaats via de twin arginine translocatie (cpTat)³, de secretoire (cpSec1)⁴, het signaal erkenning deeltje (cpSRP)⁵en de spontane invoeging trajecten⁶ . Een methode ....

Protocol

1. initiële materialen

1. Geniet van ongeveer 55 gram erwten voor 3 uur in 400 mL gedestilleerd water, en dan zaaien in een kunststof dienblad (35 cm x 20 cm x 6 cm) in bodem bedekt met een dun laagje vermiculiet.
2. Groeien de lade van erwten bij 20 ° C onder de 12/12 h (50 µE/m²s) licht/donker cyclus voor 9 tot 15 dagen.
3. Eiwit substraat volgens een voorkeur voor te bereiden.
   Opmerking: Wij hebben bereid proteïne substraten met behulp van een verscheidenheid van methoden, met inbegrip van 1) in vitro transcriptie van gezuiverde plasmiden gevolgd door vertaling met behulp van tarwekiemen extracten of konijn Retikulocyt ly....

Results

Om te meten de hoeveelheid substraat met succes vervoerd, is het nuttig om één of meer "percentage input" rijstroken. Voor de gegevens hieronder, werd 10% van de reactie van de uiteindelijke vervoer zonder ze gebruikt. Deze "percentage input" helpt ook om het visualiseren van de grootte van het substraat voorloper. Het percentage vertegenwoordigt van een bekende, omschreven hoeveelheid substraat waarmee op vergelijk vervoerd ondergrond tegen en omhoog of omlaag kan worden geschaald als ei.......

Discussion

Chloroplast en thylakoïde isolement

Buitensporige breuk kan resulteren in slechte chloroplast isolatie en dus slechte thylakoïde opbrengst na scheiding in het verloop. Het is best om het homogeniseren van het geoogste weefsel voorzichtig door ervoor te zorgen dat al het materiaal voor het mengen en pulserende in 15 s-cycli totdat volledig gehomogeniseerd wordt ondergedompeld. Gebruik indien nodig meerdere kortere rondes van mengen met minder weefsel in elke ronde.

Alle.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Pisum sativum seeds	Seedway LLC, Hall, NY	8686 - Little Marvel
Miracloth	Calbiochem, Gibbstown, NJ	475855-1
80% Acetone	Sigma, Saint Louis, MO	67-64-1
Blender with sharpened blades	Waring Commercial	BB155S
Polytron 10-35	Fischer Sci	13-874-617
Percoll	Sigma, Saint Louis, MO	GE17-0891-01
Beckman J2-MC with JA 20 rotor	Beckman-Coulter	8043-30-1180
Sorvall RC-5B with HB-4 rotor	Sorvall	8327-30-1016
100 mM dithiothreitol (DTT) in 1xIB	Sigma, Saint Louis, MO	12/3/83	Can be frozen in aliquots for future use
200 mM MgATP in 1xIB	Sigma, Saint Louis, MO	74804-12-9	Can be frozen in aliquots for future use
Thermolysin in 1xIB (2mg/mL)	Sigma, Saint Louis, MO	9073-78-3	Can be frozen in aliquots for future use
HEPES	Sigma, Saint Louis, MO	H3375
K-Tricine	Sigma, Saint Louis, MO	T0377
Sorbitol	Sigma, Saint Louis, MO	50-70-4
Magnesium Chloride	Sigma, Saint Louis, MO	7791-18-6
Manganese Chloride	Sigma, Saint Louis, MO	13446-34-9
EDTA	Sigma, Saint Louis, MO	60-00-4
BSA	Sigma, Saint Louis, MO	9048-46-8
Tris	Sigma, Saint Louis, MO	77-86-1
SDS	Sigma, Saint Louis, MO	151-21-3
Glycerol	Sigma, Saint Louis, MO	56-81-5
Bromophenol Blue	Sigma, Saint Louis, MO	115-39-9
B-Mercaptoethanol	Sigma, Saint Louis, MO	60-24-2