Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Isolatie van volwassen ruggenmerg kernen voor Massively Parallel Single-nucleus RNA Sequencing

18.7K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/58413

⸱

12 oktober 2018

 ,  ,  ,  ,  , 
1Spinal Circuits and Plasticity Unit, National Institute of Neurological Disorders and Stroke, 2Bioinformatics Section, Information Technology Program, National Institute of Neurological Disorders and Stroke, 3Laboratory of Cochlear Development, National Institute on Deafness and Other Communication Disorders, 4Single Cell Analysis Facility, Frederick National Laboratory

In dit artikel

Erratum-melding

Important: There has been an erratum issued for this article. View Erratum Notice

Samenvatting

Hier presenteren we een protocol om snel isoleren kwalitatief hoogwaardige kernen uit de verse of bevroren weefsel voor downstream massaal parallelle RNA sequencing. Wij omvatten wasmiddel-mechanische en hypotone-mechanische weefsel verstoring en cel lysis van de opties, die beide kunnen worden gebruikt voor isolatie van kernen.

Samenvatting

Een afzonderlijke cel genexpressie indringende maakt de identificatie van celtype en cel staat. Eencellige RNA sequencing heeft ontpopt als een krachtig hulpmiddel voor de studie van transcriptionele profielen van cellen, met name in heterogene weefsels zoals het centrale zenuwstelsel. Echter, dissociatie methoden die nodig zijn voor het eencellige rangschikken kunnen leiden tot experimentele wijzigingen in de gen-expressie en cel dood. Bovendien, deze methoden zijn over het algemeen beperkt aan verse weefsel, waarbinnen de studies over de archivering en bio-bank materiaal te beperken. Enkele kern RNA sequencing (snRNA-Seq) is een aantrekkelijk alternatief voor transcriptionele studies, gezien het feit dat het nauwkeurig identificeert celtypes, vergunningen van de studie van weefsel dat is bevroren of moeilijk te distantiëren, en vermindert dissociatie-geïnduceerde transcriptie. Hier presenteren we een protocol hoge gegevensdoorvoer voor snelle Isolatievan kernen voor downstream snRNA-Seq. Deze methode maakt Isolatievan kernen van vers of bevroren ruggenmerg monsters en kan gecombineerd worden met twee massaal parallelle druppel inkapseling platforms.

Inleiding

Het zenuwstelsel bestaat uit heterogene groepen van cellen die een veelzijdige elektrofysiologische, morfologische en biochemische eigenschappen worden weergegeven. Terwijl de bulk RNA sequencing is nuttig voor het bepalen van weefsel bestrijkende veranderingen in de genexpressie onder verschillende omstandigheden, het verzet zich tegen de detectie van transcriptionele veranderingen op het niveau van één cel. Recente vooruitgang in de eencellige transcriptionele analyse de indeling van heterogene cellen in functionele groepen op basis van hun moleculaire repertoire hebt ingeschakeld en zelfs kunnen worden benut voor het detecteren van sets van neuronen die had onlangs actief geweest. 1 , 2 , 3 , 4 de afgelopen tien jaar heeft de ontwikkeling van eencellige RNA sequencing (scRNA-Seq) de studie van genexpressie in afzonderlijke cellen, die een mening wordt celtype diversiteit. 5

De opkomst van schaalbare benaderingen zoals Seq-massively parallel scRNA, heeft verstrekt platformen op volgorde heterogene weefsels, met inbegrip van vele regio's in het centrale zenuwstelsel. 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 echter eencellige dissociatie methoden kunnen leiden tot de dood van de cel, evenals de experimentele wijzigingen in genexpressie. 16 recent werk heeft aangepast methodes van eencellige sequencing zodat behoud van endogene transcriptionele profielen. 1 , 3 , 4 , 17 , 18 , 19 deze strategieën zijn bijzonder geschikt voor het opsporen van onmiddellijke vroege (IEG) genexpressie na zintuiglijke prikkel of gedrag. 3 , 4 In de toekomst deze strategie kan ook worden gebruikt om dynamische veranderingen in weefsels in ziekte staten of in reactie op spanning te bestuderen. Van deze methoden, één kern RNA sequencing (snRNA-Seq) is een veelbelovende aanpak die geen stress-inducerende cel dissociatie en kan gebruikt worden op de moeilijk te distantiëren van weefsel (zoals het ruggenmerg), evenals bevroren weefsel. 4 , 17 , 18 , 19 aangepast uit de vorige kernen isolatie methoden,20,21,22,23,25 snRNA-Seq meestal maakt gebruik van verstoring van de snelle weefsel en cel Lysis onder koude omstandigheden, centrifugeren en scheiding van de kernen van cellulaire puin. 4 kernen kunnen worden geïsoleerd voor de downstream sequencing van de volgende generatie op meerdere microfluidic druppel inkapseling platformen. 4 , 7 , 24 , 25 deze methode zorgt voor een momentopname van de transcriptionele activiteit van duizenden cellen op een moment.

Er zijn meerdere strategieën voor het vrijgeven van de kernen van cellen voor isolatie en sequencing, elk met hun eigen voor- en nadelen. Hier, we beschrijven en vergelijken van twee protocollen om te schakelen van de isolatie van de kernen van de volwassen ruggenmerg voor de downstream massively parallel snRNA-Seq: wasmiddel-mechanische lysis en hypotone-mechanische lysis. Wasmiddel-mechanische lysis biedt volledige weefsel verstoring en een hogere uiteindelijke opbrengst van kernen. Hypotone mechanische-lysis omvat een beheersbare mate van verstoring van de weefsel, een mogelijkheid voor het selecteren van een evenwicht tussen de hoeveelheid en de zuiverheid van het definitieve nucleaire rendement bieden. Deze benaderingen bieden vergelijkbare RNA opbrengst, gedetecteerde aantal genen per celkern, en celtype profilering en ook kunnen zowel worden gebruikt met succes voor snRNA-Seq.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Alle dierlijke werk werd uitgevoerd overeenkomstig een protocol goedgekeurd door het National Institute of Neurological Disorders beroerte Animal Care en gebruik Comité. Evenwichtig monsters van mannelijke en vrouwelijke ICR/CD-1 wild-type muizen, tussen 8 en 12 weken oud, werden gebruikt voor alle experimenten. Muizen moeten worden behandeld in overeenstemming met lokale institutionele Animal Care en gebruik Comité richtsnoeren.

1. voorbereiding van de materialen en Buffers

  1. Bereiden alle buffers de dag van gebruik en vooraf chill op ijs (Zie tabel 1).
    1. Als gebruikt wasmiddel-mechanische lysis, bereiden de wasmiddel lysis-buffermengsel (> 500 μL per monster), lage sacharose buffer (> 6 mL per monster), sacharose dichtheid buffer (> 12,5 mL per monster) en de resuspensie oplossing (> 1 mL).
    2. Als gebruikt hypotone-mechanische lysis, bereiden de hypotone lysis-buffermengsel (> 5 mL per monster) HEB medium (> 5 mL per monster), lage sacharose buffer (> 3 mL per monster), sacharose dichtheid buffer (> 12,5 mL per monster), en de resuspensie oplossing (> 1 mL).
    3. 25 μL van dithiothreitol (DTT) aan 25 mL van de lage sacharose buffer en een ander 25 μL van DTT tot 25 mL van de dichtheid van de kleurovergang buffer van sacharose net voordat het protocol toevoegen.
  2. Betrekking hebben op het ontleden oppervlak met aluminium-folie om te minimaliseren van verontreiniging van het monster met vezels van papieren handdoeken of bench beschermers, die microfluidic kanalen gebruikt voor het vastleggen van enkele kernen kunnen verstoppen.
  3. Spray ontleden tools en Bank ruimte met een RNase decontaminatie oplossing. Bovendien, de binnenkant van de Dounce homogenizer buis (als gebruikt wasmiddel-mechanische cellysis) en Oak Ridge buis te spuiten met een RNase decontaminatie oplossing. De Dounce en Oak Ridge buis met ultrazuiver, RNase-gratis water spoelen.
  4. Chill vooraf alle collectie buizen (50 mL kegelvormig, Oak Ridge) en Dounce homogenizer buizen op ijs.
  5. Brand Pools een reeks van Pasteur pipetten (als hypotone-mechanische cellysis gebruikt).

2. voorbereiding van het ruggenmerg

  1. Als met behulp van vers weefsel, euthanaseren de muis bij CO2 inademing. Spray na euthanasie, de vacht van de muis met 70% ethanol tot een minimum beperken van haar besmetting in de steekproef.
  2. Decapitate de muis met een scherpe, RNase-gratis chirurgische schaar. Vervolgens voorzichtig het opheffen van de abdominale huid met een tang en een sneetje langs de lengte van het lichaam bloot de binnenorganen te maken.
  3. Verwijderen van de ingewanden de muis door te trekken van de innerlijke organen uit de lichaamsholte met pincet. Gebruik geen papieren handdoeken om het gebied schoon te maken of te verwijderen van organen zoals dit verontreinigingen kan invoeren. Met behulp van schaar, sneed de wervelkolom tussen de L2 en L3 wervelkolom wervels.
    Opmerking: Met de praktijk, deze stap kan worden bereikt in minder dan 30 seconden.
    1. Passen om uit te werpen het ruggenmerg, een 3 mL injectiespuit met ijskoude PBS met een 25 G ¼ inch naald. Plaats de punt van de naald in het sacrale einde van de wervelkolom. Gebruik twee vingers om te knijpen van de wervels te maken van een goede afdichting rond de punt van de naald en druk naar beneden op de plunjer rostrally uitwerpen van het ruggenmerg. Plaats het ruggenmerg in een petrischaal met ijskoude PBS.
    2. Op dit moment bevriezen van het weefsel en opslaan bij-80 ° C of onmiddellijk voor wasmiddel-mechanische (stap 3) of hypotone-mechanische lysis van de (stap 4) gebruiken.
  4. Als met behulp van bevroren weefsel, onderhoudt het weefsel op droog ijs, gaat u verder met wasmiddel-mechanische (stap 3) of hypotone-mechanische lysis van de (stap 4).

3. wasmiddel-mechanische cellysis

  1. Plaats het lumbale ruggenmerg in een vooraf gekoeld Dounce homogenizer en voeg 500 mL pre gekoeld wasmiddel lysis-buffermengsel.
    Opmerking: Een muis lumbale ruggemerg is 325.5 mg ± 63.9 mg standaardfout van het gemiddelde (SEM, N = 4). 50 mg-1.5 g van weefsel kan met succes worden gebruikt.
  2. Dounce met 5 lijnen van stamper een ('losse' stamper), dan 5-10 slagen van stamper B ('strak' stamper). Vermijd opheffing van de homogenizer uit de lysis oplossing tussen lijnen en te voorkomen dat de invoering van de bubbels.
  3. Plaats een 40 mm zeef boven een vooraf gekoeld 50 mL conische buis en prewet met 1 mL lage sacharose buffer.
  4. 1 mL van lage sacharose buffer toevoegen aan de homogenizer van de Dounce met de ruwe kernen in de lysis-buffermengsel en meng zachtjes door pipetteren 2 tot 3 keer.
  5. De ruwe kernen prep voorbij door de zeef van 40 mm in de vooraf gekoeld 50 mL conische buis.
  6. Een extra 1 mL lage sacharose buffer voorbij de zeef van 40 mm, waardoor het eindvolume tot 3 mL van de lage sacharose buffer en 500 mL van de lysis-buffermengsel.
  7. Herhaal stap 3.1 – 3.6 als het combineren van meerdere koorden, bundelen in de dezelfde conische buis.
  8. Centrifugeer het monster bij 3200 x g gedurende 10 minuten bij 4 ° C. Zodra het centrifugeren voltooid is, decanteren in de bovendrijvende substantie. Ga verder met stap 5.

4. hypotone-mechanische cellysis

  1. Plaats het lumbale ruggenmerg in 5 mL van de hypotone lysis-buffermengsel in een schotel weefselkweek. Met het botte uiteinde van voorjaar schaar bisect van het ruggenmerg en gebruikt u vervolgens voorjaar schaar te knippen het snoer in stukken van 3-4 mm, maar doen geen blad.
    Opmerking: 50 mg-1.5 g van weefsel kan met succes worden gebruikt.
  2. Incubeer op het ijs gedurende 15 minuten, 2 tot 3 keer zwenken.
  3. Voeg 5 mL van HEB medium om te verdunnen de hypotone lysis-buffermengsel.
  4. Triturate het weefsel 10 keer met een serologische 5 mL-Pipet, of totdat alle stukken van het weefsel soepel doorlopen naar de opening van de pipet.
  5. Triturate met een reeks van drie brand-gepolijst Pasteur pipetten met geleidelijk smaller diameters (~ 900-600 mm).
    1. Voor elke Pipet, triturate 5 - 15 keer, toestaan dat weefsel te regelen, verwijderen van 1-2 mL van het supernatans met gedissocieerde kernen en voorbij een 40 mm zeef in een conische buis van vooraf gekoeld 50 mL.
    2. Na verpulvering met de kleinste middelgrote Pasteur Pipet, zien erop toe dat de homogenaat vlot door het uiteinde van de pipet stroomt. De resterende oplossing voorbij door de zeef van 40 mm in de conische buis van 50 mL.
      Opmerking: Het totale aantal triturations kan worden aangepast als gewenste. De hersenvliezen van het ruggenmerg muis zal blijven, maar het is belangrijk dat de triturate zichtbare stukjes van het ruggenmerg. De resterende homogenaat voorbij de 40 m-zeef. Vermijd invoering van bubbels tijdens verpulvering.
  6. Centrifugeer het gefilterde monster bij 1.000 x g gedurende 10 minuten bij 4 ° C. Zodra het centrifugeren voltooid is, decanteren en verwijder het supernatant. Ga verder met stap 5.

5. de homogenisering en Sucrose dichtheid verloop

  1. Na stap 3 of 4, resuspendeer de pellet met behulp van 3 mL lage sacharose buffer. Zachtjes wervelen om te verwijderen van de pellet uit de muur om de resuspensie. Laat het monster zitten op het ijs gedurende 2 minuten en spoel de suspensie tot een koker Oak Ridge.
  2. Met behulp van de homogenizer op 1 instelt, meng de kernen in lage sacharose buffer voor 15 – 30 s, houden het monster op het ijs.
    Opmerking: Gebruik 15 s als een lumbale ruggemerg of 30 s als samengevoegde monsters of een hele ruggenmerg.
  3. Met behulp van een serologische precisiepipet, laag 12,5 mL dichtheid sacharose buffer onder de lage sacharose buffer homogenaat, verzorgen als u niet wilt maken van een zeepbel die de dichtheid lagen verstoort.
  4. Centrifugeer de buizen bij 3200 x g gedurende 20 min bij 4 ° C.
  5. Zodra het centrifugeren voltooid is, onmiddellijk decanteren in de bovendrijvende substantie in een flicking beweging.
    Opmerking: Een restvolume (minder dan 400 mL) van sacharose buffer kan worden verwijderd indien gewenst een lager volume en schoner eindmonster te produceren, maar deze restvolume bevat kernen en kan worden bewaard om te maximaliseren van de opbrengst van de kernen.
  6. Gebruik van 100 mL - 1 mL van resuspensie oplossing resuspendeer de kernen die nog op de muur. Vermijd de myeline 'frown' die bij de voorbereiding van wasmiddel gebaseerde opgeslagen blijft.
  7. Filtreer de kernen door een zeef 30 – 35 mm-poriegrootte en verzamelen in een vooraf gekoeld buis.
  8. Bepaal de kernen opleveren met behulp van een hemocytometer om te tellen kernen onder een 10 X doelstelling.
    Opmerking: Trypan blauw kan worden toegevoegd aan het visualiseren van kernen, die moeten worden in blauw weergegeven. Noteer de hoeveelheid cellulaire puin.
  9. Ga verder met stap 6 of 7.

6. massively Parallel snRNA-Sequencing: academisch Platform7

  1. Uitvoeren van de sequencing van massaal parallelle snRNA (b.v., Drop-Seq) zoals eerder beschreven methode7 met de volgende wijzigingen:4
    1. Aanpassen kernen om een eindconcentratie van 225 kernen per mL.
    2. Bereiden barcoded kralen bij een concentratie van 250 kralen per mL.
    3. De lysis-buffermengsel met 0,7% sarkosyl voor te bereiden.
    4. Aanpassen van de stroomsnelheid tot 35 mL per min voor kralen, 35 mL per min. voor kernen en 200 mL per min. voor olie.

7. massively parallel snRNA-sequencing: commercieel Platform26

  1. Uitvoeren van massaal parallelle snRNA-sequencing met behulp van de commerciële platform (bijvoorbeeld, chroom Single Cell gen expressie oplossing) producten volgens de fabrikant instructies26 met de volgende wijziging:
    1. Na omgekeerde-transcriptie, voeg toe een extra PCR cyclus aan het berekende aantal cycli voor versterking van cDNA op basis van het herstel van de gerichte cel ter compensatie van de verminderde cDNA van kernen in vergelijking met cellen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Hier, wij isolatie van kernen van de lumbale ruggemerg van volwassen muis voor downstream massaal parallelle RNA sequencing uitgevoerd. Het protocol betrokken drie hoofdonderdelen: weefsel verstoring en cellulaire lysis en homogenisering sacharose dichtheid centrifugeren (Figuur 1). Binnen seconden leverde het wasmiddel-mechanische lysis een ruwe kernen preparaat met een groot aantal kernen, alsmede op cellulair en weefsel puin (figuur 2A...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Het uiteindelijke doel van dit protocol is te isoleren van de kernen met kwalitatief hoogwaardige RNA voor downstream transcriptionele analyse. We snRNA-Seq methoden aangepast om alle van de celtypes in het ruggenmerg profile. Aanvankelijk vonden we dat typische cel dissociatie methoden ineffectief voor eencellige RNA sequencing, waren zoals ruggenmerg neuronen bijzonder kwetsbaar voor de dood van de cel zijn. Bovendien veroorzaken cel dissociatie methoden expressie van genen die diverse activiteiten - en stressrespons d...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

We hebben geen conflicten van belang om te vermelden.

Dankbetuigingen

Dit werk werd gesteund door de intramurale programma van NINDS (1 ZIA NS003153 02) en NIDCD (1 ZIA DC000059 18). Wij danken L. Li en C.I. Dobrott voor hun technische ondersteuning en nuttige discussies en C. Kathe voor de herziening van het manuscript.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
SucroseInvitrogen15503-022
1 M HEPES (pH = 8.0)Gibco15630-080
CaCl2Sigma AldrichC1016-100G
MgAcSigma AldrichM5661-50G
0.5 M EDTA (pH = 8.0)CorningMT-46034CI
Dithiothreitol (DTT)Sigma Aldrich10197777001Add DTT just prior to use
Triton-XSigma AldrichT8787
Nuclease-free waterCrystalgen221-238-10
1 M Tris-HCl (pH = 7.4)Sigma AldrichT2194
5 M NaClSigma Aldrich59222C
1 M MgCl2Sigma AldrichM1028
Nonidet P40Sigma Aldrich74385
Hibernate-AGibcoA12475-01
Glutamax (100x)Gibco35050-061
B27 (50x)Gibco17504-044
1x PBSCrystalgen221-133-10
0.04% BSANew England BiolabsB9000S
0.2 U/μL RNAse InhibitorLucigen30281-1
Oak Ridge Centrifuge TubeThermo Scientific3118-0050
Disposable Cotton-Plugged Borosilicate-Glass Pasteur PipetsFisher Scientific13-678-8B
Glass Tissue Dounce (2 mL)Kimble885303-002
Glass large clearance pestleKimble885301-0002
Glass small clearance pestleKimble885302-002
T 10 Basic Ultra Turrax HomogenizerIKA3737001
Dispersing tool (S 10 N – 5G)IKA3304000
Trypan Blue Stain (0.4%)Thermo Fisher ScientificT10282
40 μm cell strainerFalcon352340
MACS SmartStrainers, 30 μmMiltenyi Biotec130-098-458
Conical tubesDenville Scientific1000799
Sorvall Legend XTR CentrifugeThermo Fisher Scientific75004505
Fiberlite F15-6 x 100y Fixed-Angle RotorThermo Fisher Scientific75003698
Sterological Pipettes: 5 mL, 10 mLDenville ScientificP7127
HemocytometerDaigger ScientificEF16034F
Chemgenes Barcoding BeadsChemgenesMacosko-2011-10
RNaseZap RNase Decontamination SolutionInvitrogenAM9780
Falcon Test Tube with Cell Strainer Cap (35 μm)Corning352235
MoFlo Astrios Cell SorterBeckman CoulterB25982
Chromium i7 Multiplex Kit, 96 rxns10X Genomics120262
Chromium Single Cell 3’’ Library and Gel Bead Kit v2, 4 rxns10X Genomics120267
Chromium Single Cell A Chip Kit, 16 rxns10X Genomics
Tissue Culture Dish (60 mm x 15 mm)Corning353002

Referenties

  1. Hrvatin, S., et al. Single-cell analysis of experience-dependent transcriptomic states in the mouse visual cortex. Nature Neuroscience. 21 (1), 120-129 (2018).
  2. Hu, P., et al. Dissecting Cell-Type Composition and Activity-Dependent Transcriptional State in Mammalian Brains by Massively Parallel Single-Nucleus RNA-Seq. Molecular Cell. 68 (5), 1006-1015 (2017).
  3. Wu, Y. E., Pan, L., Zuo, Y., Li, X., Hong, W. Detecting Activated Cell Populations Using Single-Cell RNA-Seq. Neuron. 96 (2), 313-329 (2017).
  4. Sathyamurthy, A., et al. Massively Parallel Single Nucleus Transcriptional Profiling Defines Spinal Cord Neurons and Their Activity during Behavior. Cell Reports. 22 (8), 2216-2225 (2018).
  5. Tang, F., et al. mRNA-Seq whole-transcriptome analysis of a single cell. Nature Methods. 6 (5), 377-382 (2009).
  6. Campbell, J. N., et al. A molecular census of arcuate hypothalamus and median eminence cell types. Nature Neuroscience. 20 (3), 484-496 (2017).
  7. Macosko, E. Z., et al. Highly Parallel Genome-wide Expression Profiling of Individual Cells Using Nanoliter Droplets. Cell. 161 (5), 1202-1214 (2015).
  8. Chen, R., Wu, X., Jiang, L., Zhang, Y. Single-Cell RNA-Seq Reveals Hypothalamic Cell Diversity. Cell Reports. 18 (13), 3227-3241 (2017).
  9. Jaitin, D. A., et al. Massively parallel single-cell RNA-seq for marker-free decomposition of tissues into cell types. Science. 343 (6172), 776-779 (2014).
  10. Li, C. L., et al. Somatosensory neuron types identified by high-coverage single-cell RNA-sequencing and functional heterogeneity. Cell Research. 26 (8), 967(2016).
  11. Shin, J., et al. Single-Cell RNA-Seq with Waterfall Reveals Molecular Cascades underlying Adult Neurogenesis. Cell Stem Cell. 17 (3), 360-372 (2015).
  12. Tasic, B., et al. Adult mouse cortical cell taxonomy revealed by single cell transcriptomics. Nature Neuroscience. 19 (2), 335-346 (2016).
  13. Usoskin, D., et al. Unbiased classification of sensory neuron types by large-scale single-cell RNA sequencing. Nature Neuroscience. 18 (1), 145-153 (2015).
  14. Villani, A. C., et al. Single-cell RNA-seq reveals new types of human blood dendritic cells, monocytes, and progenitors. Science. 356 (6335), (2017).
  15. Zeisel, A., et al. Brain structure. Cell types in the mouse cortex and hippocampus revealed by single-cell RNA-seq. Science. 347 (6226), 1138-1142 (2015).
  16. Lacar, B., et al. Nuclear RNA-seq of single neurons reveals molecular signatures of activation. Nature Communications. 7, 11022(2016).
  17. Lake, B. B., et al. Neuronal subtypes and diversity revealed by single-nucleus RNA sequencing of the human brain. Science. 352 (6293), 1586-1590 (2016).
  18. Grindberg, R. V., et al. RNA-sequencing from single nuclei. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (49), 19802-19807 (2013).
  19. Krishnaswami, S. R., et al. Using single nuclei for RNA-seq to capture the transcriptome of postmortem neurons. Nature Protocols. 11 (3), 499-524 (2016).
  20. Matevossian, A., Akbarian, S. Neuronal nuclei isolation from human postmortem brain tissue. Journal of Visualized Experiments. (20), (2008).
  21. Bergmann, O., Jovinge, S. Isolation of cardiomyocyte nuclei from post-mortem tissue. Journal of Visualized Experiments. (65), (2012).
  22. Nohara, K., Chen, Z., Yoo, S. H. A Filtration-based Method of Preparing High-quality Nuclei from Cross-linked Skeletal Muscle for Chromatin Immunoprecipitation. Journal of Visualized Experiments. (125), (2017).
  23. Halder, R., et al. DNA methylation changes in plasticity genes accompany the formation and maintenance of memory. Nature Neuroscience. 19 (1), 102-110 (2016).
  24. Habib, N., et al. Massively parallel single-nucleus RNA-seq with DroNc-seq. Nature Methods. 14 (10), 955-958 (2017).
  25. 10X Genomics. Sample Preparation Demonstrated Protocols: Isolation of Nuclei for Single Cell RNA Sequencing. , Available from: https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/sample-prep/doc/demonstrated-protocol-isolation-of-nuclei-for-single-cell-rna-sequencing (2018).
  26. 10X Genomics. Single Cell 3' Reagent Kits v2 User Guide. , (2018).
  27. Fu, Y., Rusznak, Z., Herculano-Houzel, S., Watson, C., Paxinos, G. Cellular composition characterizing postnatal development and maturation of the mouse brain and spinal cord. Brain Structure and Function. 218 (5), 1337-1354 (2013).
  28. Lake, B. B., et al. A comparative strategy for single-nucleus and single-cell transcriptomes confirms accuracy in predicted cell-type expression from nuclear RNA. Scientific Reports. 7 (1), 6031(2017).
  29. Bakken, T. E. Equivalent high-resolution identification of neuronal cell types with single-nucleus and single-cell RNA-sequencing. bioRxiv. , (2018).
  30. Habib, N., et al. Div-Seq: Single-nucleus RNA-Seq reveals dynamics of rare adult newborn neurons. Science. 353 (6302), 925-928 (2016).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Erratum


Formal Correction: Erratum: Isolation of Adult Spinal Cord Nuclei for Massively Parallel Single-nucleus RNA Sequencing
Posted by JoVE Editors on 11/20/2018. Citeable Link.

An erratum was issued for: Isolation of Adult Spinal Cord Nuclei for Massively Parallel Single-nucleus RNA Sequencing. The Protocol section was updated.

Step 3.1 was updated from:

Place the lumbar spinal cord in a pre-chilled Dounce homogenizer and add 500 mL pre-chilled detergent lysis buffer.

to:

Place the lumbar spinal cord in a pre-chilled Dounce homogenizer and add 500 μL pre-chilled detergent lysis buffer.

Step 3.6 was updated from:

Pass an additional 1 mL low sucrose buffer over the 40 mm strainer, bringing the final volume to 3 mL of the low sucrose buffer and 500 mL of the lysis buffer.

to:

Pass an additional 1 mL low sucrose buffer over the 40 mm strainer, bringing the final volume to 3 mL of the low sucrose buffer and 500 μL of the lysis buffer.

Step 5.5 was updated from:

Once the centrifugation is complete, immediately decant the supernatant in a flicking motion.
NOTE: A residual volume (less than 400 mL) of sucrose buffer can be discarded if desired to produce a lower volume and cleaner final sample, but this residual volume does contain nuclei and can be preserved to maximize nuclei yield

to:

Once the centrifugation is complete, immediately decant the supernatant in a flicking motion.
NOTE: A residual volume (less than 400 μL) of sucrose buffer can be discarded if desired to produce a lower volume and cleaner final sample, but this residual volume does contain nuclei and can be preserved to maximize nuclei yield

Step 5.6 was updated from:

Using 100 mL - 1 mL of resuspension solution, resuspend the nuclei remaining on the wall. Avoid the myelin ‘frown’ that remains with the detergent-based preparation.

to:

Using 100 μL - 1 mL of resuspension solution, resuspend the nuclei remaining on the wall. Avoid the myelin ‘frown’ that remains with the detergent-based preparation.

Steps 6.1.1 - 6.1.4 were updated from:

  1. Adjust nuclei to a final concentration of 225 nuclei per mL.
  2. Prepare barcoded beads at a concentration of 250 beads per mL.
  3. Prepare the lysis buffer with 0.7% sarkosyl.
  4. Adjust the flow rates to 35 mL per min for beads, 35 mL per min for nuclei, and 200 mL per min for oil.

to:

  1. Adjust nuclei to a final concentration of 225 nuclei per μL.
  2. Prepare barcoded beads at a concentration of 250 beads per μL.
  3. Prepare the lysis buffer with 0.7% sarkosyl.
  4. Adjust the flow rates to 35 μL per min for beads, 35 μL per min for nuclei, and 200 μL per min for oil.

Trefwoorden

Isolatie van het ruggenmergisolatie van kernenDounce homogenisatordichtheidsgradi ntcentrifugatietellen met hemocytometerdruppelencapsulatieplatformanalyse van bevroren weefselmoeilijk te dissoci ren weefseltranscriptionele profilering
Isolatie van volwassen ruggenmerg kernen voor Massively Parallel Single-nucleus RNA Sequencing
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleid

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.