Controle van Hippo signalering Pathway activiteit met behulp van een Biosensor Luciferase gebaseerde grote Tumor Suppressor (LATS)

Summary

Hier presenteren we een luciferase gebaseerde biosensor om te kwantificeren van het kinaseactiviteit van grote tumor suppressor (LATS)-een centrale kinase in de Hippo signalering traject. Deze biosensor heeft diverse toepassingen bij fundamenteel en translationeel onderzoek gericht op het onderzoeken van Hippo traject regelgevers in vitro en in vivo.

Abstract

Het nijlpaard signalering traject is een geconserveerde regulator van orgel grootte en heeft een belangrijke rol in de ontwikkeling en kanker biologie. Als gevolg van technische uitdagingen blijft het moeilijk de activiteiten beoordelen van dit signalering traject en interpreteren in een biologische kader. De bestaande literatuur over grote tumor suppressor (LATS) is afhankelijk van de methoden die zijn kwalitatieve en kunnen niet gemakkelijk worden geschaald-up voor screening. Onlangs hebben we een bioluminescentie gebaseerde biosensor voor het controleren van het kinaseactiviteit van LATS-een kernonderdeel van de Hippo kinase cascade ontwikkeld. We beschrijven hier, procedures voor hoe deze LATS biosensor (LATS-BS) kan worden gebruikt voor het karakteriseren van Hippo traject regelgevers. Ten eerste bieden wij een gedetailleerd protocol voor het onderzoeken van het effect van een overexpressie eiwit kandidaat (bijvoorbeeldVEGFR2) op LATS activiteit met behulp van de LATS-BS. Vervolgens laten we zien hoe de LATS-BS kan worden gebruikt voor een kleinschalige kinase inhibitor van de omwenteling-scherm. Dit protocol kan redelijkerwijs worden geschaald uit te voeren van de grotere schermen, die ongetwijfeld roman regelgevers van de Hippo-pathway identificeren zal.

Introduction

Het nijlpaard signalering traject was voor het eerst geïdentificeerd in Drosophila als een nieuwe regulator van celgroei en dierlijke grootte^1,2. Sinds de eerste ontdekking, montage bewijs heeft overtuigend aangetoond dat de Hippo-traject speelt belangrijke rol in de ontwikkeling (b.v., vroege embryonale ontwikkeling, orgel grootte controle en driedimensionale [3D] morfologie), tumorigenesis () bijvoorbeeld, tumor ontwikkeling metastase, angiogenese, immuun belastingontduiking, instabiliteit van het genoom, stressrespons en resistentie), en de weefsel homeostase (b.v., stamc....

Protocol

1. onderzoek van een vermeende Regulator van Hippo signalering met behulp van de LATS-BS

1. Beplating en transfectie van cellen
   1. Voorbereiding van celkweek
      1. 1 x PBS, DMEM met 10% FBS en 1% penicilline/streptomycine en 0,25% trypsine-EDTA tot 37 ° C in een waterbad gedurende ongeveer 30 minuten warm.
      2. Grondig schoon een bioveiligheid kast met 70% ethanol.
      3. Plaats weefselkweek gerechten, Pasteur pipetten, serologische pipetten en tips van de pipet in de weefselkweek kap zoals vereist.
      4. Neem 1 x PBS, de media en de trypsine-EDTA uit het waterbad, maak ze schoon met 70% ethanol, en plaats hen in de ....

Results

De LATS-BS was cotransfected met verschillende genen te evalueren van hun effect op de LATS activiteit (Figuur 3). In dit experiment, werd Renilla gebruikt als een interne controle. De voorbijgaande uitdrukking van YAP-5SA, een constitutief actieve vorm van YAP, oorzaken toenemende YAP transcriptionele doelstellingen en een verdere verhoging in LATS kinaseactiviteit via een gevestigde feedback traject²⁵. MST, de upstream activ.......

Discussion

Terwijl de Hippo traject belangrijke rol in verschillende biologische processen speelt, en de disregulatie van de Hippo pathway tot kanker^{6 leidt}, is hoe de Hippo-traject is geregeld in reactie op verschillende stimuli niet volledig begrepen. Bovendien is er geen kwantitatieve en real-time systeem te beoordelen van de activiteit van de kernonderdelen van de Hippo. Onlangs, we ontwikkeld en gevalideerd van een roman biosensor voor het meten van de LATS kinaseactiviteit in de Hippo traject

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Trypsin-EDTA	Life Technologies	2520056	0.25%
Fetal Bovine Serum (FBS)	Sigma	F1051
DMEM	Sigma	D6429-500ml	DMEM with high glucose
Penicillin Streptomycin	Life Technologies	15140122
PolyJet In Vitro DNA Transfection Reagent	Signagen	SL100688.5
5x Passive lysis buffer	Promega	E194A	30 ml
Dual-Glo® Luciferase Assay System	Promega	E2940	100 ml kit
20/20 luminometer	Turner Biosystems	998-2036	Single tube reader luminometer
GloMax®Navigator with dual injectors	Promega	GM2010	96-well plates reader luminometer