Hier presenteren we een protocol voor de ontwikkeling van een dominant-negatieve afleidbare systeem, waarin elk eiwit kan voorwaardelijk worden geïnactiveerd door omkeerbaar overexpressing een dominant-negatieve mutant versie van het.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Afleidbare en omkeerbare Dominant-negatief (DN) eiwit remming
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Dominant-negatief (DN) eiwit inhibitie is een krachtige methode om te manipuleren eiwitfunctie en biedt diverse voordelen ten opzichte van andere genoom gebaseerde benaderingen. Bijvoorbeeld, hoewel chimeer en Cre-LoxP gerichte strategieën hebben op grote schaal gebruikt, de intrinsieke beperkingen van deze strategieën (dat wil zeggen, lekke promotor activiteit, mozaïek Cre expressie, enz.) zijn aanmerkelijk beperkt hun toepassing. Bovendien is een volledige schrapping van vele endogene genen embryonically dodelijk, waardoor het onmogelijk is om te studeren genfunctie in postnatale leven. Om deze uitdagingen, we hebben aanzienlijke wijzigingen aangebracht in een vroege gentechnologie-protocol en een korte (transgene) versie van het gen Rb1 gecombineerd met een lysosomale protease procathepsin B (CB), voor het genereren van een DN-muismodel van Rb1 (CBRb). Als gevolg van de aanwezigheid van een lysosomale protease, worden het gehele CB-RB1 fusieproteïne en haar interactie complex gerouteerd voor proteasoom-gemedieerde afbraak. Bovendien kan de aanwezigheid van een tetracycline inductor (rtTA)-element in de transgene constructie een afleidbare en omkeerbare regulering van de RB1 proteïne. De aanwezigheid van een alomtegenwoordige ROSA-CAG-promotor in de muismodel CBRb maakt het een nuttig instrument om te verrichten van voorbijgaande aard en omkeerbaar Rb1 gene ablatie en onderzoekers een resource voor het begrijpen van haar activiteiten in vrijwel elk celtype waar RB1 wordt uitgedrukt.
Inleiding
Meeste benaderingen die gericht zijn op de gen- en eiwit ablations is afhankelijk van permanente processen, die over het algemeen tot de volledige uitbanning of afkappen van het gen, RNA opeenvolgingen of proteïne van belang (POI leiden). Het algemene doel van deze methode is om ingenieur een recombinant eiwit te schaffen van de functie van endogene, wild-type eiwit. Wij hebben revisited en vernieuwde een alternatieve strategie1,2, dat voorziet in de tijdelijke ablatie van een POI via DN remming. Deze methode werkt voor zowel multimeric als monomeer peptiden, maar is het meest geschikt voor de eiwitten die in een vergadering van de multimeric functioneren.
De methode bestaat uit het smelten van de lysosomale protease CB aan een subeenheid van een multimeric POI (CB smelting complexe). De resulterende CB fusie complexe kan communiceren met en proteolytically de endogene eiwit verteren of afleiden van het gehele complex van het CB-POI op het lysosoom als aangetaste3. Een combinatie van de complexe CB-fusie met de afleidbare aard van het tetracycline-gecontroleerde transcriptionele (TetO) activeringssysteem voorziet bovendien in een afleidbare en beheerste expressie van de transgenic in een omkeerbare mode2. Hoewel het nuttig in veel gevallen, kan de volledige schrapping van genen of eiwitten in vivo resulteren in letaliteit4,5,6. Ook weefsel-specifieke, voorwaardelijke schrapping van sommige genen of eiwitten met behulp van de Cre/Lox systeem mogelijk niet eenvoudig, zoals het uiteindelijk tot permanent verlies van kritieke genomic elements7 leiden zal. Daarom, afhankelijk van het gen of POI, zal geen van deze benaderingen zijn efficiënt in het verstrekken van een nuttig model voor latere studies, met name genen of eiwitten functionele studies in late postnatale en volwassen muizen.
Te omzeilen van de problemen in verband met een dergelijke aanpak en verstrekken bewijs-van-beginsel op de effectiviteit van de voorgestelde methode, die wij hebben gekozen voor het testen van de methode die hier wordt gepresenteerd door het genereren van een voorwaardelijke DN-versie van de proteïne Retinoblastoom 1 (RB1). Verschillende opties zijn voorgestelde8,9,10 tot afschaffing van de functie van endogene RB1; echter allemaal geconfronteerd enkele van dezelfde beperkingen hierboven besproken: permanente germline schrapping van RB1 is embryonically dodelijk en, conform haar tumor suppressor rol, permanente RB1 voorwaardelijke schrapping leidt tot een verscheidenheid van tumoren11. Hoewel een DN versie van RB1 niet van nature lijkt, een beter alternatief voor de momenteel beschikbare strategieën moet voorzien in een stoffelijk gecontroleerde inactivatie van de endogene RB1 en bieden een alternatief mechanisme te herstellen uiteindelijk haar functie. De basis voor een dergelijke constructie werd meer dan twee decennia geleden beschreven1. Echter, als gevolg van technologische beperkingen het ontbrak een mechanisme voor controle transgenic activering, reactie en weefsel specificiteit. Deze studie is de eerste te combineren de elegantie van de doxycycline (Dox)-afhankelijke transcriptionele systeem met een gemanipuleerde transgene constructie van lysosomale protease CB en Rb1 eiwitten. De resulterende CBRb muismodel zorgt voor een tijdelijk gereglementeerde Dox-gemedieerde RB1 voorschrift2. Het voordeel van het gebruik van een dergelijke Proteoom gebaseerde aanpak om te studeren van genfuncties is dat het voor elke gen van belang, met minimale informatie over haar activiteiten kan worden aangenomen.
De voorgestelde DN transgenic strategie biedt vele voordelen ten opzichte van de traditionele benaderingen. Eerst, DN eiwit remming leidt tot slechts een gedeeltelijke ablatie eiwit activiteit, dus het behoud van een residuele endogene expressie. Zo'n resultaat is zeer wenselijk in situaties waar een volledige eliminatie van eiwit activiteit tot embryonale letaliteit leidt, een onderzoek om te bestuderen van de genfunctie in een levende muis sterk te beperken. Ten tweede, de aanwezigheid van het TetO systeem kunt transgenic activering alleen in aanwezigheid van een antibioticum, dat voor een efficiënte en omkeerbare controle van de transgenic activiteit zorgt. Dus, door op te houden de antibiotica administratie, de transgene systeem kan worden gedeactiveerd, en een normale RB1 expressie is terug op zijn plaats. Ten derde, de specificiteit van de transgenic expressie kan variëren naargelang de promotor van keuze. Terwijl wij hebben besloten de alomtegenwoordige ROSA-CAG-promotor voor bewijs-van-principe, is plaatsen de transgenic onder een weefsel-specifieke promotor waarschijnlijk tot beperking van ongewenste transgenic expressie en vergemakkelijken van studies over de therapeutische toepassing van deze transgenic methodologie.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Generatie van de transgene CBRb muis en alle dierenverzorgers en experimenten die is gekoppeld aan de studie werden goedgekeurd door de Creighton University dier zorginstellingen en gebruik Comité (IACUC) en uitgevoerd door hun richtlijnen.
1. transgene CB-Myc6-Rb1 Construct
Opmerking: Het klonen van CBRb in een vector pTet_Splice werd gedaan in een proces van meerdere stappen (figuur 1A en 1B).
-
Voeren de eerste fase klonen in de pCS2 + CB-Myc6 vector.
- Maken van de constructie van de transgenic CBRb, een 1583-bp-long Rb1 cDNA fragment (528 aminozuren overeenkomt met de aminozuur-regio 369-896) versterken van het eiwit van de RB1 met behulp van de volgende primer instellen: gebruik voor EcoRI +RB 1243F, GGGGAATTCA TTAAATTCAGCAAGTGATCAACCTTC, en XbaI + EcoRV +RB 2826R, gebruik CCCTCTAGATATCTATTTGGACTCTCCTGGGAGATGTTTACTTCC.
- Kloon het fragment gegenereerd (1546 bp) tussen de EcoR1 en XbaI sites van de beperking van de pCS2 + CB-Myc6 vector als eerder beschreven1,12.
Opmerking: De 1012-bp-long CB-Myc6 constructie (337 aminozuren) gesmolten naar het fragment Rb1 resulteerde in een proteïne van ongeveer 865 aminozuren (ongeveer 108 kDa), die iets kleiner is dan de endogene RB1 proteïne (~ 110 kDa) (Figuur 1 Een), met een CB-Myc6 tag op de N-terminus en Rb1 in het C-terminus.
-
De tweede fase subcloning in de pTet-Splice vector uitvoeren
- Om de CB-RB-Myc6 fusion fragment te vergroten en zo de Tet-promotor, versterken de cassette, bestaande uit de CB-myc6-Rb1 gebruikend inleidingen met de EcoRV (XbaI + EcoRV + RB 2826R) en SalI sites: voor SalI +CBF, gebruik CCAGTCGACAGGATGTGGTGGTCCTTGATCCTTC.
- Subclone het fragment gegenereerd (2567 bp) in de pTet-Splice vector, tussen de beperkingsplaatsen SalI en EcoRV , zodanig dat de gehele TetO-DN-CB-myc6-Rb1 transgenic, met inbegrip van de SV40 intron en de PolyA signaal, kunnen worden geïsoleerd door middel van een enkele spijsvertering met kennisgevingen (Figuur 1B).
Opmerking: De kennisgevingen fragment werd gebruikt voor het genereren van de transgene financiers.
2. in Vitro testen van de TetO-DN-CB-myc6-Rb1 transgenic
-
Dox-verordening: NIH3T3 cellijn
Opmerking: Tenzij anders vermeld, zijn alle volumes voor een 6-well-plaat aangepast.- Het groeien van cellen van de NIH3T3 van de leverancier specificaties, met behulp van de aanbevolen cel voedingsbodems met 10% foetale runderserum bij 37 ° C met 10% CO2na.
- De cellen met pTet-Splice cotransfect en pCMV-Tet3G-vectoren (uit stap 1) voor 24 h. de stappen hieronder vermelde voor cotransfection.
- Meng 2 – 4 µL van de lipide gebaseerde transfectie reagens/put en 1 mL van onvolledig (zonder serum) Dulbecco van bewerkt Eagle Medium (DMEM) gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. Gebruik van 250 of 500 µL van voedingsbodems, respectievelijk voor een 12 - of 24-well plaat, en de volume van de reagens van de transfectie dienovereenkomstig aanpassen.
- 2 – 3 µg plasmide DNA/putje toevoegen aan de transfectie reagens-DMEM en incubeer gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur.
- Voeg de mix met DNA en het transfectiereagens in DMEM aan elk putje. Na 3-4 uur incubatie, voeg 1 mL volledige media (zodat het eindvolume 2 mL per putje is). Houd aliquots van Dox voorraad (1 mg/mL) en voeg 2 µL in elk van de putten (+ Dox). Incubeer de cellen bij 37 ° C met 5% CO2.
Opmerking: Controlemonsters moeten bestaan uit cotransfected cellen niet behandeld met Dox (-Dox), evenals NIH3T3 cellen transfected alleen met de transactivator pCMV-Tet3G-vector en gedurende een periode van 24 uur behandeld met Dox. Voor pCMV-Tet3G, concentraties van 0,1-1 µg/mL Dox zou voldoende moeten zijn voor het opwekken van de transgenic expressie.
-
Test de omkeerbaarheid van de constructie die met behulp van de cellijn van HEK293.
- Om te testen de omkeerbaarheid van de TetO-DN-CB-myc6-Rb1 transgenic, cultuur HEK293 cellen in Eagle's Minimum essentiële Medium (EMEM) na specificaties van de leverancier en cotransfect met pTet-Splice én pCMV-Tet3G vectoren voor 24u, zoals beschreven boven (stap 2.1.2).
- Voor de inactivering van transgenic, verwijder het medium van Dox-bevattende na 24 h en wassen van de cellen 2 x-3 x met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) broeden ze in Dox-vrije media voor een aanvullende 24 h.
Opmerking: Na Dox-verwijdering, moeten de transgenic inactivering en regelmatige eiwit expressie binnen die periode van 24 uur worden hervat.
-
Uitvoeren om te beoordelen van de functionaliteit van de constructie van de TetO-DN-CB-myc6-Rb1 biij ongeplande celproliferatie, de functionele analyses met behulp van een cellijn HEI-OC1, zoals hieronder beschreven.
- Cultuur HEI-OC1 cellen in 10% DMEM onder tolerante omstandigheden (33 ° C met 10% CO2). Voor cel proliferatie studies, met behulp van een cel teller en plaat 10.000 HEI-OC1 cellen op een 96-wells-plaat in een volume van 200 µL cellen te tellen. Incubeer de cellen 's nachts.
- Voer op de volgende dag, een voorbijgaande cotransfection van pTet-Splice en pCMV-Tet3G vectoren met behulp van een lipide gebaseerde transfectiereagens (Zie stappen 2.1.2). In een aparte goed, pmR-ZsGreen1 transfectie at2-µg met behulp van het lipide gebaseerde transfectiereagens (stappen 2.1.2) voor het berekenen van het tarief van de transfectie worden uitgevoerd. Niet-transfected cellen als besturingselementen gebruiken.
- Detecteren van de aanwezigheid van groene fluorescentie onder een fluorescentie Microscoop (excitatie = 485 nm, emissie = 530 nm) voor de transfected cellen 24u na transfectie. Neem de aanwezigheid of afwezigheid van groene fluorescentie en bereken het percentage van de transfectie als het totale aantal GFP-positieve cellen (transfected cellen) over de cellen die zijn gemarkeerd met de DAPI (totaal aantal cellen).
Opmerking: Wij een tarief van de transfectie van ~ 70% geschat. - Om te induceren transgenic expressie, 1 µg/mL Dox aan een subset van transfected cellen toevoegen tijdens het gebruik van de andere subset als besturingselement (-Dox). Onbehandelde HEI-OC1 cellen worden gebruikt als extra besturingselementen.
- Om te beoordelen celproliferatie, door een cel proliferatie kit volgens protocol van de fabrikant te gebruiken.
- Kortom, 48 h na transfectie, verwijder het kweekmedium cel en voeg 100 µL van 1 x kleurstof-bindoplossing aan elk putje van de microplate. Incubeer gedurende 1 uur bij 37 ° C.
- Daarna meet de intensiteit van de fluorescentie van elk monster met behulp van een fluorescentie microplate reader (excitatie = 485 nm, emissie = 530 nm).
- Verder beoordelen celproliferatie met immunocytochemie, de cellen van de HEI-OC1 op een glas van de cover in een 12-well plaat plaat en na een nacht bebroeden bij 37 ° C.
- De volgende dag, cotransfect met de pTet-Splice en pCMV-Tet3G en het uitvoeren van de behandeling van Dox (+ Dox). Untransfected cellen als besturingselementen gebruiken. Proces HEI-OC1 cellen voor het labelen van Ki-67.
- Het herstellen van de cellen met de 4% paraformaldehyde (PFA) in PBS, pH 7.4, gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur. Wassen van de cellen 3 x met ijskoude PBS en Incubeer de cellen in de niet-ionogene wasmiddel van de 0,25% in PBS gedurende 10 minuten.
- Wassen van de cellen opnieuw, 3 x in PBS voor 5 min, en blok 10% serum met een bevochtigde kamer gedurende 1 uur bij kamertemperatuur.
- Incubeer de cellen in 500 µL van Ki-67 primair antilichaam (1:200 verdunning) gedurende 3 uur bij kamertemperatuur of overnacht bij 4 ° C.
- Wassen van de cellen 3 x voor 5 min met PBS. Incubeer de cellen met het secundaire antilichaam gedurende 1 uur bij kamertemperatuur in het donker na dat.
- Verwijder de secundair antilichaam-oplossing en wassen van de cellen 3 x met PBS voor 5 minuten, elk in het donker.
- Incubeer de cellen van de HEI-OC1 in 1:200 phalloidin voor 30 min voor phalloidin labeling. Als u het label van de kernen van cellen, Incubeer de cellen met 5 µg/mL DAPI gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur.
Opmerking: Zorg ervoor dat de geconjugeerde van de kleurstof phalloidin anders dan de geconjugeerde van secundair antilichaam is.
3. productie van CBRb+/ROSA-CAG-rtTA+ (CBRb) transgene muizen en In Vivo tests van de DN-CBRb-aanpak
- Na bevestiging wordt door de effectieve Dox regulering van de TetO-DN-CB-myc6-Rb1 transgenic zuiveren het fragment van de kennisgevingen en microinject hen in muis zygoten, die later naar pseudo-zwangere vrouwen overgebracht worden.
Opmerking: Deze procedures werden uitgevoerd bij de Universiteit van Nebraska Medical Center (UNMC) muis genoom Engineering Core faciliteit. - Na de levering, de pups met behulp van een primer specifieke regio ingesteld op de CB-Rb1 fusion genotype: CBRb F, 5' CTGTGGCATTGAATCAGAAATTGTGGCTGG 3 ' gebruiken, en voor CBRB R, gebruiken voor 3 5 ' GTACTTCTGCTATATGTGGCCATTACAACC '.
Opmerking: De grootte van het PCR product waargenomen op agarose gel is 401 bp (60-bp CB regio + 341-bp Rb1 regio (tabel 1). Tien onafhankelijke oprichter regels werden vastgesteld, gebaseerd op de aanwezigheid van de TetO-DN-CB-myc6-Rb1 transgenic. In vijf van deze lijnen erfde nakomelingen de transgenic, die de overdracht van de kiemcellen van de transgenic bevestigd. Een van de transgene lijnen werd uiteindelijk gebruikt voor het vaststellen en handhaven van de lijn en genereren van proefdieren TetO-DN-CB-myc6-Rb1 voor verdere studies. - Volwassen TetO-DN-CB-myc6-Rb1 muizen naar de ROSA-CAG-rtTA tetracycline inductor regel (voorraad #006965) (als alternatief, breed aan een tTA inductor lijn) voor het genereren van experimentele DN-CBRb muizen fokken. Genotype van de nakomelingen van dit kruis met behulp van de volgende set van de primer: gebruik voor rtTA-WT R, GGAGCGGGAGAAATGGATATG; gebruik voor rtTA Mutant R, GCGAGGAGTTTGTCCTCAACC; en voor rtTA Common, gebruik AAAGTCGCTCTGAGTTGTTAT. De PCR product maten zijn 340 bp (mutant), 340 bp en 650 bp (heterozygote) en 650 bp (wild-type).
- Een dosis-responscurve van het eiwit van de RB1 na de Dox behandeling om de tijd en de duur van de Dox behandeling nodig te verduidelijken met een transgenic-expressie te genereren.
Opmerking: In dit experiment, werden westelijke vlek en qRT-PCR gebruikt om weefsel-specifieke transgenic activering en RB1 expressie te evalueren. - Fluorescentie in situ hybridisatie (FISH) te bevestigen de genomic invoeging van de transgenic uitvoeren
Opmerking: Dit werd uitgevoerd op het centrum voor toegepast genomica van het ziekenhuis voor zieke kinderen (Toronto, Canada). ELISA of het westelijke bevlekken (met eiwit-specifieke antilichaam) kan worden gebruikt ter beoordeling van transgenic activering, weefsel-specificiteit en veranderingen in de niveaus van de endogene POI. Voor de constructie van de DN-CB-myc6-Rb1 gebruikten we een anti-RB1 antilichaam.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
In het algemeen, ontwerpen van een mutatie DN vereist een aanzienlijke hoeveelheid informatie over de structuur en functie van het POI. In tegenstelling, is de DN-strategie die hier gepresenteerd vooral handig wanneer de structurele en functionele informatie voor het POI beperkt is. Als het POI een multimeric eiwit is, een fusie van een subeenheid aan een lysosomale protease dominant kan remmen de geassembleerde multimer en mogelijk andere liganden door een combinatie van proteolyse van d...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Wij willen om te omzeilen van de beperkingen die zijn gekoppeld aan de traditionele transgene strategieën, genereren een muismodel waarin een endogene POI kan voorwaardelijk worden geïnactiveerd door overexpressing een DN gemuteerde vorm van het Spatio wijze. Afschaffing van de functie van endogene POI's, zijn verschillende opties voorgestelde15,16,17. We hebben een eerdere genetische strategie1 bewerkt d...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben niets te onthullen.
Dankbetuigingen
De pCS2 + CB-Myc6 vector was een geschenk van Marshall Horwitz (Universiteit van Washington, Seattle, WA, Verenigde Staten). De HEI-OC1 cellen werden beschikbaar gesteld door Fedrico Kalinec (David Geffen School of Medicine, UCLA, Los Angeles, CA, USA). Technische ondersteuning werd verstrekt door de UNMC muis genoom Engineering kern (C.B. Gurumurthy, Don Harms, Rolen Quadros) en de Creighton University geïntegreerde Biomedical Imaging faciliteit (Richard Hallworth, John Billheimer). De UNMC Mouse genoom Engineering werd ondersteund door een institutioneel Development Award (idee) van de NIH/NIGMS, verlenen nummer P20 GM103471. De geïntegreerde Biomedical Imaging faciliteit werd gesteund door de Creighton University School of Medicine en subsidies, GM103427 en GM110768 van de NIH/NIGMS. De faciliteit is gebouwd met steun van subsidies uit het National Center for onderzoeksmiddelen (RR016469) en de NIGMS (GM103427). De lijnen van de muis gegenereerd in deze studie werden onderhouden bij Creighton University's dier Resource faciliteit, waarvan infrastructuur werd verbeterd door middel van een subsidie door de NIH/NCRR G20RR024001. Dit werk ontvangen verleden ondersteuning via een NIH/NCRR 5P20RR018788-/ NIH/NIGMS 8P20GM103471 COBRE toekennen (Shelley D. Smith), NIH/ORIP R21OD019745-01A1 (S.M.R.-S.) en een opkomende subsidie van het onderzoek van de Hearing Health Foundation (naar S. Tarang). De inhoud van dit onderzoek is uitsluitend de verantwoordelijkheid van de auteurs en vertegenwoordigt niet noodzakelijk de officiële standpunten van de National Institutes of Health.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium, DMEM | GIBCO-BRL | 11965-084 | |
| Minimum Essential Medium Eagle, MEME | Sigma | M8042 | |
| Fetaal bovien serum | Sigma | F2442 | |
| Lipofectamine | DharmaFECT | T-2010-03 | |
| Sal I | Roche | 11745622 | |
| EcoRV-HF | New England BioLabs | R3195S | |
| NotI | Roche | 13090730 | |
| CaspaTag | Millipore | APT523 | |
| DAPI | Sigma | D9542 | |
| Staurosporine | Sigma | S4400 | |
| CyQuant NF cell proliferatiekit | Invitrogen | C35007 | |
| Retinoblasoom 1 antilichaam | Abcam | Ab6075 | |
| c-Myc antilichaam | Sigma | M5546 | |
| b-actin | Sigma | A5316 | |
| Ki-67 | Thermofisher scientific | MA5-14520 | |
| Fallodie | Thermofisher scientific | A12379 | |
| Fluorescentie microplaatlezer | FLUOstar OPTIMA, BMG Labtech | ||
| Epifluorescentie microscoop | NikonEclipse80i | ||
| De TetO-DN-CB-myc6-Rb1 (DN-CBRb) muislijn is verkrijgbaar bij het Jackson Laboratory als JAX#032011. |
Referenties
- Li, F. Q., et al. Preferential MyoD homodimer formation demonstrated by a general method of dominant negative mutation employing fusion with a lysosomal protease. Journal of Cell Biology. 135 (4), 1043-1057 (1996).
- Tarang, S., et al. Generation of a retinoblastoma (rb)1-inducible dominant-negative (DN) mouse model. Frontiers Cellular Neuroscience. 9 (52), (2015).
- Kominami, E., et al. The selective role of cathepsins B and D in the lysosomal degradation of endogenous and exogenous proteins. FEBS Letters. 287 (1-2), 189-192 (1991).
- Cortellino, S., et al. Defective ciliogenesis, embryonic lethality and severe impairment of the sonic hedgehog pathway caused by inactivation of the mouse complex A intraflagellar transport gene Ift122/Wdr10, partially overlapping with the DNA repair gene Med1/Mbd4. Developmental Biology. 325 (1), 225-237 (2009).
- Ferreira, C., et al. Early embryonic lethality of H ferritin gene deletion in mice. Journal of Biological Chemistry. 275 (5), 3021-3024 (2000).
- Lee, E. Y., et al. Mice deficient for rb are nonviable and show defects in neurogenesis and haematopoiesis. Nature. 359 (6393), 288-294 (1992).
- Turlo, K. A., et al. When cre-mediated recombination in mice does not result in protein loss. Genetics. 186 (3), 959-967 (2010).
- Weber, T., et al. Rapid cell-cycle reentry and cell death after acute inactivation of the retinoblastoma gene product in postnatal cochlear hair cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (2), 781-785 (2008).
- Zhang, J., et al. The first knockout mouse model of retinoblastoma. Cell Cycle. 3 (7), 952-959 (2004).
- Zhao, H., et al. Deletions of retinoblastoma 1 (Rb1) and its repressing target S phase kinase-associated protein 2 (Skp2) are synthetic lethal in mouse embryogenesis. Journal of Biological Chemistry. 291 (19), 10201-10209 (2016).
- Yamasaki, L., et al. Loss of E2F-1 reduces tumorigenesis and extends the lifespan of Rb1(+/-) mice. Nature Genetics. 18 (4), 360-364 (1998).
- Li, F. Q., et al. Selection of a dominant negative retinoblastoma protein (RB) inhibiting satellite myoblast differentiation implies an indirect interaction between MyoD and RB. Molecular and Cellular Biology. 20 (14), 5129-5139 (2000).
- Pitkanen, K., et al. Expression of the human retinoblastoma gene product in mouse fibroblasts: Effects on cell proliferation and susceptibility to transformation. Experimental Cell Research. 207 (1), 99-106 (1993).
- Chano, T., et al. Neuromuscular abundance of RB1CC1 contributes to the non-proliferating enlarged cell phenotype through both RB1 maintenance and TSC1 degradation. International Journal of Molecular Medicine. 18 (3), 425-432 (2006).
- Kole, R., et al. RNA therapeutics: Beyond RNA interference and antisense oligonucleotides. Nature Reviews Drug Discovery. 11 (2), 125-140 (2012).
- Yamamoto, A., et al. The ons and offs of inducible transgenic technology: A review. Neurobiology of Disease. 8 (6), 923-932 (2001).
- Houdebine, L. M., et al. Transgenic animal models in biomedical research. Methods in Molecular Biology. 360, 163-202 (2007).
- Brehm, A., et al. Retinoblastoma protein recruits histone deacetylase to repress transcription. Nature. 391 (6667), 597-601 (1998).
- Lu, Z., et al. E2F-HDAC complexes negatively regulate the tumor suppressor gene ARHI in breast cancer. Oncogene. 25 (2), 230-239 (2006).
- Magnaghi-Jaulin, L., et al. Retinoblastoma protein represses transcription by recruiting a histone deacetylase. Nature. 391 (6667), 601-605 (1998).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
