Isolatie van CD4+ T-cellen en analyse van de circulerende T-folliculaire Helper (cTfh) cel Subsets van 6-kleur met behulp van perifere bloed stroom Cytometry

Samenvatting

Hier, een protocol voor de isolatie en de karakterisering van CD4⁺ T-cel subsets van menselijke perifeer bloed wordt beschreven. CD4 gezuiverd⁺ T-cellen worden geanalyseerd door stroom cytometry om te bepalen van de verhoudingen van T-folliculaire helper cel subsets.

Samenvatting

Aberrant T-folliculaire helper (Tfh) cel activiteit kan worden opgespoord in auto-immune omstandigheden en hun aanwezigheid wordt geassocieerd met klinische resultaten wanneer de communicatie van de lymfeklier in de B-cel non-Hodgkin-lymfoom is geanalyseerd. Deelverzamelingen van circulerende folliculaire T helper cellen (cTfh), de circulerende geheugencompartiment van Tfh cellen in het bloed, ook bij ziekte worden verstoord en daarom vertegenwoordigen potentiële nieuwe voorspellende biomarkers. Perifere bloed gebaseerde testen is gunstig, want het is relatief niet-invasieve en zorgt voor de eenvoudige seriële opvolging. Dit artikel beschrijft een methode voor het isoleren van CD4 T-cellen⁺ van menselijk bloed, en verdere analyse door stroom-cytometry bij het inventariseren van cTfh cellen en moet de mengverhouding van hun verschillende deelverzamelingen (cTfhPD-1^{-/ +/ hi}, cTfh1, 2, 17 en cTfh1/17). Het niveau van deze deelverzamelingen werd vervolgens vergeleken tussen normale onderwerpen en patiënten met lymfoom. We vonden dat de methode robuust genoeg zijn was om betrouwbare resultaten te verkrijgen van routinematig verzamelde materiaal van de patiënt. De techniek die we voor de analyse beschrijven kan gemakkelijk worden aangepast aan de cel Sorteren en downstream toepassingen zoals RT-PCR.

Inleiding

Folliculaire T helper cellen (Tfh) zijn een CD4⁺ T-cel-deelverzameling die aanvankelijk in¹van de lymfoïde weefsels gekenmerkt werd. Deze cellen express PD-1 en CXCR5 oppervlak receptoren, afscheiden van IL-21 en IL-4 en Toon van nucleaire uitdrukking van de transcriptiefactor, BCL-6^2,3. Zoals hun naam al suggereert, ze zijn te vinden in germinal centra en essentieel zijn voor de hoge affiniteit antilichaam productie¹.

Dysregulated Tfh reacties zijn betrokken bij de pathogenese van de ziekte, vooral auto-immuunziekte, waar z....

Protocol

Bloedmonsters werden verkregen uit de normale onderwerpen (NS) (n = 12) en patiënten met marginaal zone lymfoom (MZL) (n = 7) en andere soorten B-cel non-Hodgkin lymfoom (BNHL) (6 FL patiënten, 2 lymphoplasmacytic lymfoom patiënten en 1 low-grade B-cel non-Hodgkin lymfoom niet elders genoemde patiënt). Patiënten werden gerekruteerd uit de hematologie klinieken op Leicester Royal Infirmary nadat hebben geïnformeerd, schriftelijke toestemming, met ethische goedkeuring voor alle studies. Ethische goedkeuring was verkregen door Leicestershire, Northamptonshire en Rutland onderzoek ethiek Commissie 1, referentie 06/Q2501/122 voor monsters van de patiënt en de gezondheid on....

Resultaten

Hoge CD4⁺ zuiverheid tot stand gekomen met behulp van de CD4⁺ isolatie-protocol, dat betrouwbaar over alle bloedmonsters was getest door ons (betekent: 96,6%, SD: 2.38, n = 31) (Figuur 3).

Identificatie van cTfh (CD4⁺ CXCR5⁺ cellen) in een representatieve normale onderwerp wordt gepresenteerd (Figuur 4A). Het .......

Discussie

Dit protocol vormt een eenvoudige en efficiënte manier om het analyseren van de cellen van de cTfh van het perifere bloed, waardoor de detectie van alle relevante deelverzamelingen geïdentificeerd in de literatuur tot nu toe. Eenvoudig en efficiënt kan bloedmonsters als onderdeel van de standaard poliklinieken en seriële monsters op parallel met klinische gegevens kan worden verzameld. Op zijn beurt, hierdoor prospectieve studies cTfh deelverzamelingen evaluatie als biomarkers voor ziekte progressie of reactie op behande.......

Materialen

```html

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
RosetteSep Human CD4+ T Cell Enrichment Cocktail	STEMCELL TECHNOLOGIES	15062
Ficoll-Paque PLUS	GE Healthcare Life Sciences	17144003
BUV395 Mouse Anti-Human CD183 Clone 1C6/CXCR3	BD Horizon	565223
BV711 Mouse Anti-Human CD196 (CCR6) Clone 11A9	BD Horizon	563923
BV421 Rat Anti-Human CXCR5 (CD185) Clone RF8B2	BD Horizon	562747
BB515 Mouse Anti-Human CD4 Clone  RPA-T4	BD Horizon	564419
PE Mouse Anti-Human CD279 Clone MIH4	BD Pharmingen	557946
APC-H7 Mouse Anti-Human CD45RA Clone  HI100	BD Pharmingen	560674
LIVE/DEAD Fixable Far Red Dead Cell Stain Kit, for 633 or 635 nm excitation	ThermoFisher Scientific	L34973
Brilliant Stain Buffer	BD Horizon	563794
Anti-Mouse Ig, κ/Negative Control Compensation Particles Set	BD CompBead	552843
FACS Aria II Flow Cytometer	BD Biosciences	644832
FACSDiva 6.1.3	BD Biosciences	643629	Flow Cytometer Acquisition Software
FlowJo 10.2	Treestar Inc.		Flow Cytometry Data Analysis Software
Anti-CXCR3 antibody	BD Horizon	565223
Anti-CCR6 antibody	BD Horizon	563923
Anti-CXCR5 antibody	BD Horizon	562747
Anti-CD4 antibody	BD Horizon	564419
Anti-PD-1 antibody	BD Pharmingen	557946
Anti-CD45RA antibody	BD Pharmingen	560674
Viability Marker	ThermoFisher Scientific	L34973

```