Eiwit invoer in chloroplasten met behulp van protoplasten studeren

Samenvatting

Hier beschrijven we een protocol om het uiten van eiwitten in protoplasten met behulp van PEG-gemedieerde transformatie methode. De methode biedt eenvoudige uitdrukking van proteïnen van belang, en efficiënte opsporing van eiwit lokalisatie en het importproces voor verschillende experimentele omstandigheden in vivo.

Samenvatting

De chloroplast is een essentiële organel dat verantwoordelijk is voor diverse cellulaire processen in planten, zoals fotosynthese en de productie van veel secundaire metabolieten en lipiden. Chloroplasten vereist een groot aantal proteïnen voor deze verschillende fysiologische processen. Meer dan zijn 95% van chloroplast eiwitten kern-gecodeerd en geïmporteerd in de chloroplasten van het cytosol na vertaling op cytosolische ribosomen. De juiste invoer of richten van deze kern-gecodeerde chloroplast proteïnen tot chloroplasten is dus essentieel voor de goede werking van chloroplasten, alsmede de plant cel. Nucleus-gecodeerde chloroplast eiwitten bevatten signaal reeksen voor specifieke targeting tot chloroplasten. Moleculaire machines gelokaliseerd op de chloroplast of cytosol deze signalen herkennen en uitvoeren van het importproces. Voor het onderzoek naar de mechanismen van eiwitten importeren of het gericht op chloroplasten in vivo, ontwikkelden we een snelle, efficiënte protoplast gebaseerde methode voor het analyseren van eiwitten invoer in chloroplasten of Arabidopsis. In deze methode gebruiken we geïsoleerd van blad weefsels van Arabidopsisprotoplasten. Hier bieden we een gedetailleerd protocol voor het gebruik van protoplasten te onderzoeken het mechanisme waardoor eiwitten worden geïmporteerd in chloroplasten.

Inleiding

De chloroplast is een van de belangrijkste organellen in planten. Een van de belangrijkste functies van chloroplasten is fotosynthese¹uitvoeren. Chloroplasten zijn ook uitvoeren van vele andere biochemische reacties voor de productie van vetzuren, aminozuren en nucleotiden tal secundaire metabolieten^1,2. Voor al deze reacties vereist chloroplasten een groot aantal verschillende soorten eiwitten. Het genoom chloroplast bevat echter slechts ongeveer 100 genen^3,4. Daarom moeten de chloroplasten de meerderheid van hun eiwitten uit het cytosol importeren. In feite, werden meeste chloroplast eiwitten aangetoond te worden geïmporteerd uit het cytosol na vertaling^4,5,6. Plantaardige cellen vereisen specifieke mechanismen eiwitten importeren van het cytosol naar chloroplasten. Echter, hoewel deze eiwitten importeren mechanismen zijn onderzocht voor de afgelopen decennia, wij nog steeds volledig begrijpen niet hen op moleculair niveau. Hier, voorzien wij een gedetailleerde methode voor de voorbereiding van protoplasten en exogenously uiten van genen in protoplasten. Deze methode zou kunnen zijn waardevol voor het ophelderen van de moleculaire mechanismen die ten grondslag liggen aan eiwit invoer in chloroplasten in detail.

Eiwit importeren kan worden bestudeerd met behulp van veel verschillende benaderingen. Een van deze methoden impliceert het gebruik van een in vitro eiwit invoer systeem^7,8. Met behulp van deze aanpak, in vitro-vertaalde proteïne-precursors worden geïncubeerd met gezuiverde chloroplasten in vitroen eiwitten importeren wordt geanalyseerd door SDS-PAGE gevolgd door westelijke vlekkenanalyse. Het voordeel van deze aanpak is dat elke stap van eiwitten importeren in chloroplasten in detail bestudeerd kan worden. Dus, deze methode heeft wijd gebruikt te bepalen van de componenten van de import van de moleculaire machine van eiwit en te ontleden opeenvolgingsinformatie voor doorvoer peptides. Meer recentelijk, een andere benadering met betrekking tot het gebruik van protoplasten uit blad weefsels werd ontwikkeld en het is geworden wijd gebruikt om te studeren eiwit invoer in chloroplasten^9,10. Het voordeel van deze aanpak is dat protoplasten een cellulaire omgeving die dichter bij die van de onbeschadigde cellen dan de in vitro -systeem. Dus, de protoplast-systeem stelt ons in staat om aan te pakken veel extra aspecten van dit proces, zoals de bijbehorende cytosolische gebeurtenissen en hoe de specificiteit van targeting signalen wordt bepaald. Hier presenteren we een gedetailleerd protocol voor het gebruik van protoplasten aan studie eiwit invoer in chloroplasten.

Protocol

1. groei van Arabidopsis planten

1. Bereiden 1 L Gamborg B5 (B5) medium door het toevoegen van 3,2 g van B5 medium zoals vitaminen, 20 g van sacharose, 0,5 g 2-(N-morpholino) ethaan sulfonzuur (MES) tot ca. 800 mL gedeïoniseerd water en breng de pH op 5.7 met kaliumhydroxide (KOH). Toevoegen meer gedeïoniseerd water zodat het totale volume 1 L. toevoegen 8 g phytoagar en autoclaaf gedurende 15 minuten staan bij 121 ° C.
2. Toestaan dat het medium tot 55 ° C afkoelen en giet van 20-25 mL B5 voedingsbodem in een petrischaal (diameter 9 cm, 1.5 cm in hoogte) op een schone bankje. Droge platen voor 2-3 dagen, pak ze met schone wrap, en houd ze in de koelkast tot gebruik.
3. Steriliseren van Arabidopsis thaliana zaden met 1 mL ethanol van de 70% (v/v) in een centrifugebuis (e-buis) door voortdurend schudden voor 2 – 3 min. de bovendrijvende vloeistof verwijderen, voeg 1 mL van 1% (v/v) natriumhypochloriet-oplossing, en schud continu voor 2 – 3 min. bereiden 100 – 150 zaden per petrischaal.
   1. Verwijder het supernatant en wassen van de zaden met 1 mL gedestilleerd water. Herhaal deze stap 4 x. Plaats de gesteriliseerde zaden bij 4 ° C voor 3 dagen om te synchroniseren van kieming van het zaad.
4. 100 – 150 zaaien naar B5 platen met behulp van een micropipet en verzegel de plaat met chirurgische tape.
5. Planten groeien in een kamer van de groei met een 16/8 uur licht/donker cyclus bij 100 µmol·m^-2·s^-1 lichtintensiteit, 70% relatieve vochtigheid en temperatuur van 20 ° C voor 2 weken.

2. voorbereiding van de plasmide

Opmerking: High-purity plasmiden moeten worden gebruikt voor transformatie; het gebruik van een commerciële plasmide zuivering kit wordt aanbevolen.

1. Zuiveren van de plasmide (RBC-nt:GFP) met behulp van een DNA isolatie kit. Te concentreren DNA, uitvoeren van ethanol neerslag in een tube van 1,5 mL en los van de DNA-pellet in 100 µL van gedistilleerd water. Bepaal de concentratie van de plasmide met behulp van een spectrofotometer op 260 nm. Verdun de plasmide om een eindconcentratie van ~ 2 µg / µL. Houd het plasmide bij-20 ° C tot gebruik.

3. isolatie van protoplasten

1. De volgende oplossingen voor te bereiden.
   1. Bereid de enzym-oplossing bevatten macerozyme van 0,25% (m/v) 1,0% (m/v) cellulase, 400 mM D-mannitol, 8 mM calciumchloride (CaCl₂), 0,1% (g/v) bovien serumalbumine (BSA), en 5 mM MES. Breng de pH op 5.6 met KOH.
      1. Filtreer de oplossing van de enzym een celluloseacetaat filter eenheid met een poriegrootte van 0,45 micrometer. Aliquoot 25 mL van de oplossing van het enzym in 50 mL conische buizen en houd bij-20 ° C. Ontdooi de enzym-oplossing bij kamertemperatuur (RT) en meng goed vlak voor gebruik.
   2. Bereid een sacharoseoplossing 21% (m/v) door het oplossen van 21 g van sacharose in 100 mL gedeïoniseerd water en autoclaaf de oplossing.
   3. Bereid W5-oplossing bevatten 154 mM natriumchloride (NaCl), 125 mM CaCl₂, 5 mM kaliumchloride (KCl), glucose 5 mM en 1.5 mM MES. Breng de pH op 5.6 met KOH en autoclaaf de oplossing.
   4. Bereid MaMg-oplossing bevat 400 mM D-mannitol, 15 mM magnesiumchloride (MgCl₂), en 5 mM MES. Breng de pH op 5.6 met KOH en autoclaaf de oplossing.
   5. Bereiden 1 M D-mannitol en 1 M calciumnitraat stamoplossingen om de PEG-oplossing te maken. Autoclaaf deze oplossingen.
2. Oogst intact blad weefsels van 2 weken oude planten uit ~ 1 – 2 B5 platen met een chirurgisch mes en plaats de geoogste bladeren in een 50 mL conische buis met 25 mL van enzym oplossing. Plaats de conische buis met het enzym oplossing en blad weefsels horizontaal op een rondschudapparaat met zachte agitatie in het donker. Duurt het 8-12 h voor volledige spijsvertering van blad weefsels.
3. 8 – 12 uur na incubatie, giet u de enzym-oplossing (met protoplasten vrijgelaten uit blad weefsels) in een verse petrischaal via een gaas met 140 µm poriegrootte. Zorgvuldig laag van de protoplast-bevattende enzym oplossing op de top van de sacharoseoplossing 21% (m/v) 15 mL en Centrifugeer het bij 98 x g gedurende 10 minuten met de laagste versnelling en vertraging instellingen in een swingende-emmer rotor.
4. Met behulp van een pipet van Pasteur, zorgvuldig overbrengen in de protoplasten uit de meest bovenste laag (enzym oplossing) en op het raakvlak tussen het enzym oplossing en een sacharoseoplossing een conische tube van 50 mL met 30 mL W5 oplossing. Deze buis 51 x g gedurende 6 minuten centrifugeren. In dit stadium zullen protoplasten in de pellet aan de onderkant van de conische buis.
5. Verwijder het supernatant zorgvuldig met behulp van een precisiepipet zonder verstoring van de pellet protoplasten. Voeg 25 mL W5 oplossing, en zachtjes resuspendeer de protoplasten. Incubeer de protoplast-oplossing in een koelkast 4 ° C gedurende ten minste 1 uur voor stabilisatie.

4. protoplast transformatie met polyethyleenglycol

1. Bereiden van een 40% oplossing PEG door 4 g van PEG 8000, 4 mL 1 M mannitol oplossing, 1 mL van de 1 M Ca (₃)₂en 1.8 mL gedestilleerd water toe te voegen in een conische buis van 50 mL en meng goed. PEG ontbinden door verhitting in de magnetron gedurende 20 – 30 s. plaats de 40% oplossing van de PEG bij RT voor afkoeling.
   Opmerking: De 40% PEG oplossing moet vers worden bereid elke keer. Als protoplasten zijn niet Ingehuld volledig tijdens de incubatie van de 4 ° C in de koelkast, Centrifugeer het materiaal bij 46 x g gedurende 2 minuten.
2. Verwijder het supernatant zorgvuldig maar volledig en MaMg oplossing aan de protoplast-pellet opleveren van de concentratie van 5 x 10⁶/mL toevoegen.
   Opmerking: Het aantal protoplast kan worden bepaald door een hemocytometer onder een Microscoop bekeken.
3. Plaats 10 µg van de plasmide DNA elke lege 13 mL ronde onderkant buis en voeg 300 µL van protoplast oplossing met behulp van een precisiepipet.
   Opmerking: Het einde van het uiteinde van de pipet moet worden afgesneden. Wanneer protoplasten worden bemonsterd, moet de protoplast-bevattende oplossing vlak voor pipetteren zodat hetzelfde aantal protoplasten wordt toegevoegd aan elke buis worden resuspended.
4. Meng de plasmide DNA met protoplasten door rustig ronddraaiende de buizen en onmiddellijk Voeg 300 µL van 40% PEG oplossing met behulp van een precisiepipet. Meng voorzichtig maar volledig door het draaien van buizen en incubeer gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur; de buis bijna horizontaal kantelen en draai het meerdere malen.
5. Voeg 1 mL W5 oplossing en meng voorzichtig maar volledig door de draaiing van de buis met de hand op een vergelijkbare manier. Incubeer het monster gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur.
6. Herhaal deze stap twee keer meer met behulp van 1,5 mL en 2 mL W5 oplossing, respectievelijk. Incubeer gedurende 30 min na de laatste toevoeging van W5 oplossing.
7. Centrifugeer bij 46 x g gedurende 4 min. negeren het supernatant en voeg toe 2 mL W5 oplossing. Meng voorzichtig maar volledig. Incubeer bij 22 ° C in een donkere kamer.

5. analyse van de invoer van de eiwitten in chloroplasten

Opmerking: Na PEG-gemedieerde transformatie van protoplasten, incubatietijd varieert van 8 tot 24 h.

1. Fluorescentie microscopie
   1. Plaats 10 µL van de protoplast-oplossing op een glas van de dia met behulp van een precisiepipet met een bijgesneden tip en zorgvuldig dek af met een dekglaasje aan om te voorkomen beschadiging van de protoplasten.
   2. Plaats de dia op het podium van een fluorescentie Microscoop voorzien van excitatie/emissie filter wordt ingesteld voor de observatie van de groen fluorescente proteïne (GFP) en chlorofyl auto-fluorescentie.
   3. Opnamen met een gekoelde charge - coupled apparaat (CCD) camera en proces beelden met behulp van een software voor beeldbewerking om pseudo-kleurenbeelden te produceren.
2. Totaal eiwit extractie en Immunoblotting
   1. Denaturatie buffer met 2,5% (m/v) natrium dodecylsulfate (SDS) en 2% (v/v) 2-mercaptoethanol voor te bereiden.
      Opmerking: Eiwit invoer in chloroplasten kan worden gekwantificeerd door het meten van de mate van transit peptide verwerking via immunoblot analyse met behulp van anti-GFP antilichaam.
   2. Pipetteer protoplasten in een centrifugebuis en centrifuge op 46 x g voor 4 min.
   3. Verwijder het supernatant en voeg 80 µL van denaturatie buffer. Krachtig vortex voor 5 s en voeg 5 x SDS monster buffer (250 mM Tris-Cl (pH 6.8), 0.5 M DTT, 10% (m/v) SDS, 0.05% (m/v) Bromophenol blauw en 50% (v/v) glycerol). Meng goed en kook gedurende 10 minuten.
   4. Deze eiwitSteekproef onderworpen aan standaard SDS-pagina en immunoblotting met anti-GFP antilichaam.

Resultaten

De invoer van proteïnen in chloroplasten kan worden onderzocht met behulp van twee benaderingen: fluorescentie microscopie en immunoblot analyse na SDS-pagina-gemedieerde scheiding. Hier, we gebruikten RBC-nt:GFP, een fusie bouwen de 79 N-terminale aminozuurresidu's van RBC met de transit peptide gesmolten tot GFP-codering. Wanneer eiwitten zijn geïmporteerd in chloroplasten, groene fluorescentie signalen van het doel eiwit RBC-nt:GFP moeten samenvoegen met de rode fluorescerende signalen...

Discussie

Wij voorzien een gedetailleerd protocol in het gebruik van protoplasten van Arabidopsis aan studie eiwit invoer in chloroplasten. Deze methode is krachtig voor het onderzoeken van het importproces eiwit. Deze eenvoudige, veelzijdige techniek is nuttig voor de behandeling van de gerichtheid van de beoogde lading eiwitten tot chloroplasten. Met deze methode worden protoplasten bereid met blad weefsels van Arabidopsis^11,12 , die kan worden verkrege...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
GAMBORG B5 MEDIUM INCLUDING VITAMINS	Duchefa Biochemie	G0210.0050
SUCROSE	Duchefa Biochemie	S0809.5000
MES MONOHYDRATE	Duchefa Biochemie	M1503.0250
Agar, poeder	JUNSEI	24440S1201
Micropore chirurgisch tape	3M	1530-0
Chirurgisch mes roestvrij No.10	FEATHER	Niet beschikbaar
Conische buis, 50ml	SPL LIFE SCIENCES	50050
Macerozyme R-10	YAKULT PHARMACEUTICAL IND.	Niet beschikbaar
Cellulase ONOZUKA R-10	YAKULT PHARMACEUTICAL IND.	Niet beschikbaar
ALBUMIN, RUND (BSA)	VWR	0332-100G
D-Mannitol	SIGMA	M1902-1KG
CALCIUM CHLORIDE, DIHYDRATE	MP BIOMEDICALS	0219463505-5KG
Twister	VISION SCIENTIFIC	VS-96TW
Screen cup voor CD-1	SIGMA	S1145
Schermen voor CD-1	SIGMA	S3895
Petrischaal	SPL LIFE SCIENCES	10090
Pasteurpipet	HILGENBERG	3150102
LABORATORIUM CENTRIFUGE / BENCH-TOP	VISION SCIENTIFIC	VS-5500N
Natriumchloride	JUNSEI	19015S0350
Kaliumchloride	SIGMA	P3911-1KG
D-GLUCOSE, ANHYDROUS	BIO BASIC	GB0219
Kaliumhydroxide	DUKSAN	40
Calciumnitraat tetrahydraat	SIGMA	C2786-500G
Poly(ethyleenglycol)	SIGMA	P2139-2KG
Magnesiumchloride hexahydraat	SIGMA	M2393-500G
Buis 13ml, 100x16mm, PP	SARSTEDT	55.515
Microscoopglaasjes	MARIENFELD	1000412
Microscoopdekglaasjes	MARIENFELD	101030
Tellkamer	MARIENFELD	650030
Axioplan 2 Imaging Microscoop	Carl Zeiss	Niet beschikbaar
Microbuis 1.5ml	SARSTEDT	72.690.001
2-Mercaptoethanol	SIGMA	M3148-250ML
Sodium Dodecyl Sulfate (SDS), Proteomics Grade	VWR	M107-500G
TRIS, Ultra Pure Grade	VWR	0497-5KG
DTT (DL-Dithiothreitol), Biotechnology Grade	VWR	0281-25G
Broomfenolblauw natriumzout ACS	VWR	0312-50G
Glycerol	JUNSEI	27210S0350
Living Colors A.v. Monoklonaal Antilichaam (JL-8)	TAKARA	632381