Method Article

Eiwit invoer in chloroplasten met behulp van protoplasten studeren

DOI:

10.3791/58441

⸱

December 10th, 2018

 ,  , 
1Division of Integrative Biosciences and Biotechnology, Pohang University of Science and Technology, 2Department of Life Sciences, Pohang University of Science and Technology

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hier beschrijven we een protocol om het uiten van eiwitten in protoplasten met behulp van PEG-gemedieerde transformatie methode. De methode biedt eenvoudige uitdrukking van proteïnen van belang, en efficiënte opsporing van eiwit lokalisatie en het importproces voor verschillende experimentele omstandigheden in vivo.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De chloroplast is een essentiële organel dat verantwoordelijk is voor diverse cellulaire processen in planten, zoals fotosynthese en de productie van veel secundaire metabolieten en lipiden. Chloroplasten vereist een groot aantal proteïnen voor deze verschillende fysiologische processen. Meer dan zijn 95% van chloroplast eiwitten kern-gecodeerd en geïmporteerd in de chloroplasten van het cytosol na vertaling op cytosolische ribosomen. De juiste invoer of richten van deze kern-gecodeerde chloroplast proteïnen tot chloroplasten is dus essentieel voor de goede werking van chloroplasten, alsmede de plant cel. Nucleus-gecodeerde chloroplast eiwitten bevatten signaal reeksen voor specifieke targeting tot chloroplasten. Moleculaire machines gelokaliseerd op de chloroplast of cytosol deze signalen herkennen en uitvoeren van het importproces. Voor het onderzoek naar de mechanismen van eiwitten importeren of het gericht op chloroplasten in vivo, ontwikkelden we een snelle, efficiënte protoplast gebaseerde methode voor het analyseren van eiwitten invoer in chloroplasten of Arabidopsis. In deze methode gebruiken we geïsoleerd van blad weefsels van Arabidopsisprotoplasten. Hier bieden we een gedetailleerd protocol voor het gebruik van protoplasten te onderzoeken het mechanisme waardoor eiwitten worden geïmporteerd in chloroplasten.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De chloroplast is een van de belangrijkste organellen in planten. Een van de belangrijkste functies van chloroplasten is fotosynthese1uitvoeren. Chloroplasten zijn ook uitvoeren van vele andere biochemische reacties voor de productie van vetzuren, aminozuren en nucleotiden tal secundaire metabolieten1,2. Voor al deze reacties vereist chloroplasten een groot aantal verschillende soorten eiwitten. Het genoom chloroplast bevat echter slechts ongeveer 100 genen3,4. Daarom moeten de chloroplasten de meerderheid van hun eiwitten uit h....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. groei van Arabidopsis planten

  1. Bereiden 1 L Gamborg B5 (B5) medium door het toevoegen van 3,2 g van B5 medium zoals vitaminen, 20 g van sacharose, 0,5 g 2-(N-morpholino) ethaan sulfonzuur (MES) tot ca. 800 mL gedeïoniseerd water en breng de pH op 5.7 met kaliumhydroxide (KOH). Toevoegen meer gedeïoniseerd water zodat het totale volume 1 L. toevoegen 8 g phytoagar en autoclaaf gedurende 15 minuten staan bij 121 ° C.
  2. Toestaan dat het medium tot 55 ° C afkoelen en giet van 20-25 mL B5 voedingsbodem in een petrischaal (diameter 9 cm, 1.5 cm in hoogte) op een schone bankje. Droge platen voor 2-3 dagen, pak ze met schone wrap, en houd ze in de koelkast....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De invoer van proteïnen in chloroplasten kan worden onderzocht met behulp van twee benaderingen: fluorescentie microscopie en immunoblot analyse na SDS-pagina-gemedieerde scheiding. Hier, we gebruikten RBC-nt:GFP, een fusie bouwen de 79 N-terminale aminozuurresidu's van RBC met de transit peptide gesmolten tot GFP-codering. Wanneer eiwitten zijn geïmporteerd in chloroplasten, groene fluorescentie signalen van het doel eiwit RBC-nt:GFP moeten samenvoegen met de rode fluorescerende signalen.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wij voorzien een gedetailleerd protocol in het gebruik van protoplasten van Arabidopsis aan studie eiwit invoer in chloroplasten. Deze methode is krachtig voor het onderzoeken van het importproces eiwit. Deze eenvoudige, veelzijdige techniek is nuttig voor de behandeling van de gerichtheid van de beoogde lading eiwitten tot chloroplasten. Met deze methode worden protoplasten bereid met blad weefsels van Arabidopsis11,12 , die kan worden verkrege.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben niets te onthullen.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit werk werd uitgevoerd met de ondersteuning van het coöperatieve onderzoeksprogramma voor landbouw wetenschap en technologische ontwikkeling (Project nr. PJ010953012018), Rural Development Administration en de subsidie van de National Research Foundation (Korea) gefinancierd door het ministerie van wetenschap en ICT (nr. 2016R1E1A1A02922014), Republiek Korea.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
GAMBORG B5 MEDIUM INCLUDING VITAMINSDuchefa BiochemieG0210.0050
SUCROSEDuchefa BiochemieS0809.5000
MES MONOHYDRATEDuchefa BiochemieM1503.0250
Agar, powderJUNSEI24440S1201
Micropore Surgical tape3M1530-0
Surgical blade stainless No.10FEATHERUnavailable
Conical Tube, 50mlSPL LIFE SCIENCES50050
Macerozyme R-10YAKULT PHARMACEUTICAL IND.Unavailable
Cellulase ONOZUKA R-10YAKULT PHARMACEUTICAL IND.Unavailable
ALBUMIN, BOVINE (BSA)VWR0332-100G
D-MannitolSIGMAM1902-1KG
CALCIUM CHLORIDE, DIHYDRATEMP BIOMEDICALS0219463505-5KG
TwisterVISION SCIENTIFICVS-96TW
Screen cup for CD-1SIGMAS1145
Screens for CD-1SIGMAS3895
Petri DishSPL LIFE SCIENCES10090
Pasteur pipetteHILGENBERG3150102
LABORATORY CENTRIFUGE / BENCH-TOPVISION SCIENTIFICVS-5500N
Sodium chlorideJUNSEI19015S0350
Potassium chlorideSIGMAP3911-1KG
D-GLUCOSE, ANHYDROUSBIO BASICGB0219
Potassium HydroxideDUKSAN40
Calcium nitrate tetrahydrateSIGMAC2786-500G
Poly(ethylene glycol)SIGMAP2139-2KG
Magnesium chloride hexahydrateSIGMAM2393-500G
Tube 13ml, 100x16mm, PPSARSTEDT55.515
Microscope slidesMARIENFELD1000412
Microscope Cover GlassesMARIENFELD101030
Counting ChamberMARIENFELD650030
Axioplan 2 Imaging MicroscopeCarl ZeissUnavailable
Micro tube 1.5mlSARSTEDT72.690.001
2-MercaptoethanolSIGMAM3148-250ML
Sodium Dodecyl Sulfate (SDS), Proteomics GradeVWRM107-500G
TRIS, Ultra Pure GradeVWR0497-5KG
DTT (DL-Dithiothreitol), Biotechnology GradeVWR0281-25G
Bromophenol blue sodium salt ACSVWR0312-50G
GlycerolJUNSEI27210S0350
Living Colors A.v. Monoclonal Antibody (JL-8)TAKARA632381

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Jarvis, P., Lopez-Juez, E. Biogenesis and homeostasis of chloroplasts and other plastids. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 14 (12), 787-802 (2013).
  2. Neuhaus, H. E., Emes, M. J. Nonphotosynthetic Metabolism in Plastids. Annual Review of Plant Physiology and Plant Molecular Biology. 51, 111-140 (2000).
  3. Rolland, N., et al.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Protein Import ChloroplastsProtoplast IsolationFluorescence MicroscopyImmunoblotting AnalysisChloroplast Protein TargetingArabidopsis ProtoplastsProtein Import AssayGFP Fusion ProteinCentrifugation ProtocolsSucrose Gradient

Related Articles