Methodenartikel

Gebruik van Electron paramagnetisch resonantie in biologische monsters bij kamertemperatuur en 77 K

DOI:

10.3791/58461

⸱

11 januari 2019

 ,  ,  ,  , 
1Cardiovascular Pulmonary Research Laboratories and Pediatric Critical Care Medicine, Department of Pediatrics, University of Colorado Anschutz Medical Campus, 2Bruker BioSpin Corp, 3Department of Medicine, Division of Clinical Pharmacology, Vanderbilt University Medical Center

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Elektron paramagnetisch resonantie (EPR) spectroscopie is een eenduidige methode voor het meten van vrije radicalen. Het gebruik van selectieve spin sondes zorgt voor detectie van vrije radicalen in andere cellulaire compartimenten. Presenteren we een praktische, efficiënte methode voor het verzamelen van biologische monsters die behandeling, opslaan en overzetten van monsters voor EPR metingen te vergemakkelijken.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De nauwkeurige en specifieke detectie van reactieve zuurstof soorten (ROS) in verschillende compartimenten voor cellulaire en weefsel is essentieel voor de studie van redox-gereglementeerde signalering in biologische instellingen. Elektron paramagnetisch resonantie spectroscopie (EPR) is de enige directe methode te beoordelen van vrije radicalen ondubbelzinnig. Het voordeel is dat fysiologische niveaus van specifieke soorten met een hoge specificiteit wordt gedetecteerd, maar het vereist gespecialiseerde technologie, zorgvuldige monstervoorbereiding en passende controles om ervoor te zorgen nauwkeurige interpretatie van de gegevens. Cyclische hydroxylamine spin sondes reageren selectief met superoxide of andere radicalen voor het genereren van een nitroxide-signaal dat kan worden gekwantificeerd door EPR spectroscopie. Cel-permeabele spin sondes en spin sondes ontworpen snel ophopen in de mitochondriën toestaan voor de bepaling van superoxide concentratie in andere cellulaire compartimenten.

In gekweekte cellen, het gebruik van cel permeabele 1-hydroxy-3-methoxycarbonyl-2,2,5,5-tetramethylpyrrolidine (CMH) samen met en zonder cel-ondoordringbare superoxide dismutase (SOD) voorbehandeling of gebruik van cel-permeabele PEG-SOD, voorziet in de differentiatie van extracellulaire van cytosolische superoxide. De mitochondriale 1-hydroxy-4-[2-triphenylphosphonio)-acetamido]-2,2,6,6-tetramethyl-piperidine,1-hydroxy-2,2,6,6-tetramethyl-4-[2-(triphenylphosphonio)acetamido] piperidinium dichloride (mito-TEMPO-H) zorgt voor de meting van mitochondriale ROS (overwegend superoxide).

Spin sondes en EPR spectroscopie kunnen ook worden toegepast op de in vivo modellen. Superoxide kan worden opgespoord in extracellulaire vloeistoffen zoals bloed en alveolaire vloeistof, evenals weefsels zoals longweefsel. Verschillende methoden worden gepresenteerd voor het verwerken en opslaan van weefsel voor EPR metingen en leveren van intraveneuze 1-hydroxy-3-carboxy-2,2,5,5-tetramethylpyrrolidine (CPH) spin sonde in vivo. Terwijl metingen kunnen worden uitgevoerd bij kamertemperatuur, kunnen monsters verkregen van in vitro en in vivo modellen ook worden opgeslagen bij-80 ° C en geanalyseerd door EPR op 77 K. De monsters kunnen worden opgeslagen in gespecialiseerde buis stal bij-80 ° C en op 77 K om een praktische, efficiënte, en reproduceerbare methode die vergemakkelijkt opslaan en overdragen monsters worden uitgevoerd.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Terwijl maatregelen van oxidatieve stress en reactieve zuurstof soorten belangrijk voor de studie van diverse ziekten over alle orgaansystemen zijn, is de detectie van reactieve zuurstof soorten (ROS) uitdagend als gevolg van een korte halfwaardetijd en hoge reactiviteit. Een elektron paramagnetisch resonantie (EPR) techniek is de meest duidelijke methode voor het opsporen van vrije radicalen. Spin sondes hebben voordelen ten opzichte van de meer gangbare TL sondes. Hoewel fluorescerende sondes zijn relatief goedkoop en gemakkelijk te gebruiken en bieden snelle, gevoelige detectie van ROS, hebben ze ernstige beperkingen als gevolg van artefactuele signalen, een onvermogen om ROS concentraties, en een algemeen gebrek aan specificiteit1 te berekenen .

Ter vergemakkelijking van het gebruik van EPR voor biologische studies, een aantal spin sondes hebben al gesynthetiseerd die een aantal biologisch relevante vrije radicalen soorten, alsmede pO2, pH en redox meten kan staat2,3, 4,5,6,7. Spin traps zijn ook ontwikkeld om te vangen kortstondige radicalen en vorm lang-leven adducten, die detectie door EPR8vergemakkelijkt. Beide klassen (spin sondes en spin traps) hebben voordelen en beperkingen. Een veelgebruikte klasse van spin sondes zijn cyclische hydroxylamines, die zijn EPR-stille en reageren met kortstondige radicalen vormen een stabiele nitroxide. Cyclische hydroxylamines reageren met superoxide 100 keer sneller dan spin traps, inschakelen van hen om te concurreren met cellulaire antioxidanten, maar zij gebrek aan specificiteit en vereisen het gebruik van de passende controles en remmers radicale soorten of bron te identificeren verantwoordelijk voor het nitroxide signaal. Terwijl de spin traps tentoonstelling specificiteit, met verschillende spectrale dat patronen is afhankelijk van de gevangen soorten, ze hebben langzame kinetiek superoxide spin overlapping en zijn gevoelig voor biologische afbraak van de radicale adducten. Toepassingen voor overvulling van de spin zijn geweest goed gedocumenteerd in biomedisch onderzoek9,10,11,12,13.

Het doel van dit project is om aan te tonen van praktische EPR methoden voor het ontwerpen van experimenten en voorbereiding van monsters te detecteren superoxide met behulp van spin sondes in andere cellulaire compartimenten in vitro en in verschillende weefsels compartimenten in vivo. Verschillende manuscripten hebt protocollen die relevant zijn voor deze doelstellingen, met behulp van cel-permeabele, cel-ondoordringbaar en mitochondriale gerichte spin sondes naar andere cellulaire compartimenten in vitro en proces doelweefsel p.a. in muismodellen gepubliceerd 14 , 15. we voortbouwen op dit lichaam van literatuur door het valideren van een aanpak voor het meten van superoxide met behulp van een 1-hydroxy-3-methoxycarbonyl-2,2,5,5-tetramethylpyrrolidine (CMH) spin sonde in het andere cellulaire compartimenten in vitro om ervoor te zorgen nauwkeurige metingen, benadrukken de mogelijke technische problemen kunnen vertekenen resultaten. Wij bieden ook methoden voor het uitvoeren van metingen van de EPR in bloed, bronchoalveolar lavage vloeistof en longweefsel met behulp van de CMH spin sonde. Deze studies vergelijken verschillende methoden voor het verwerken van de weefsels, alsmede het presenteren van een methode om een andere spin sonde, CPH, injecteren muizen vóór de oogst van weefsel. Ten slotte, ontwikkelen wij een praktische methode voor het opslaan van monsters in polytetrafluorethyleen (PTFE) buizen te maken voor de opslag en overslag van monsters vóór EPR metingen op 77 K.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Alle dierlijke studies werden goedgekeurd door de Universiteit van Colorado Denver institutionele Animal Care en gebruik Comité.

1. bereiding van reagentia

  1. Diethylenetriaminepentaacetic zuur (DTPA) voorraad (150 mM)
    1. Voeg 2,95 g DTPA (393.35 g/mol) tot 10 mL gedeïoniseerd water.
    2. Te ontbinden DTPA, voeg 1 M NaOH ontkleuring en breng aan een pH van 7.0.
    3. Breng het volume aan 50 mL met water voor een eindconcentratie van DTPA van 150 mM, en bewaren bij 4 ° C.
  2. Fosfaat buffer zoutoplossing (PBS) (50 mM, pH 7.4)
    1. 5 M van natriumchloride (NaCl) (58.44 g/mol; 29.22 g/100 mL) voor te bereiden.
    2. Bereiden van 1 M van kalium fosfaat dibasische HK2PO4 (174.18 g/mol; 17.42 g/100 mL)
    3. Bereiden 1 M van kalium fosfaat monobasisch KH2PO4 (136.1 g/mol; 13.61 g/100 mL). Meng 3 mL 5 M NaCl met 4.24 mL 1 M kalium fosfaat dibasische en 0.760 mL 1 M kalium fosfaat monobasisch. Controleer de pH.
    4. Breng het volume met gedeïoniseerd water tot 100 mL.
    5. Bewaren bij kamertemperatuur (RT) voor korte termijn (dagen) en bij 4 ° C voor opslag op lange termijn (weken).
  3. Krebs-Henseleit buffer (KHB) met 100 µM DTPA
    1. Voeg 33.3 µL van 150 mM DTPA stockoplossing in 50 mL conische centrifugebuis.
    2. Een volume van 50 mL met Krebs-Henseleit buffer (KHB) brengen.
    3. Bereiden van verse buffer met DTPA elke dag en houd het op RT.
  4. Tris-EDTA-buffer met sacharose
    1. 0.5 M Tris voorraad bereiden: Los 15.14 g voor Tris base (121.14 g/mol) in 150 mL gedeïoniseerd water. Met behulp van HCl, breng de pH op 7,8 en breng aan een eindvolume van 250 mL.
    2. Los 21.4 g van sacharose (342.29 g/mol; eindconcentratie = 0,25 mM) in 150 mL gedeïoniseerd water.
    3. Voeg 5 mL van Tris voorraad aan sacharose te bereiken van een 10 mM definitieve concentratie van Tris.
    4. Voeg toe 0,5 mL 0,5 M EDTA voorraad aan Tris-sacharose om een eindconcentratie van 1 mM.
    5. Controleer de pH en pas het aan 7.4.
    6. Breng aan een eindvolume van 250 mL met gedeïoniseerd water en bewaren bij 4 ° C.
  5. Boviene erytrocyt Cu/Zn superoxide dismutase (SOD) voorraad (30.000 U/mL)
    1. Reconstrueren 30.000 U van SOD in 1 mL PBS (ongeveer 5,7 mg, afhankelijk van de activiteit van de ZODE veel).
    2. Meng goed, hoeveelheid, en opgeslagen bij-20 ° C voor korte termijn (6-12 maanden) en bij-80 ° C voor langdurige opslag.
  6. SOD werkoplossing (1000 U/mL)
    1. Pipetteer een aliquoot 30 µL van 30.000 U/mL SOD voorraad in een 870 µL van steriele PBS.
    2. Bewaar deze oplossing op ijs en vers gebruiken.
  7. Phorbol 12-myristaat 13-acetaat (PMA) voorraad (5 mM)
    1. Los 1 mg PMA (616.83 g/mol) in 325 µL van DMSO (eindconcentratie = 5 mM).
    2. Aliquot een PMA-oplossing van 5 mM en opslaan bij-20 ° C.
  8. PMA werkoplossing (125 µM)
    1. Verdun een hoeveelheid van 10 µL van 5 mM PMA voorraad in 390 µL van steriele PBS.
    2. Bewaar deze oplossing op ijs en vers gebruiken.
    3. Gebruiken voor de controle van een voertuig voor PMA, 10 µL van DMSO in 390 µL van PBS.
  9. Diphenyliodonium chloride (DIP) (2,5 mM)
    1. Los 3,2 mg (316.57 g/mol) duik in 4 mL tot het verkrijgen van een voorraad van 2.5 mM.
    2. Bereid de oplossing en gebruik het vers.
  10. Deferoxamine mesylaat zout (DFO) (20 mM)
    1. Los 4.5 mg voor DFO (656.79 g / mol) in 340 µL te verkrijgen van een voorraad van 20 mM.
    2. Bereid de oplossing en gebruik het vers.
  11. Voorbereiding van antimycin A (AA) voorraad (5 mM)
    1. Los 5.4 mg AA (532 g/mol) in 2 mL ethanol (eindconcentratie = 5 mM).
    2. Aliquot de voorraad in glazen flesjes en winkel bij-20 ° C.
  12. Voorbereiding van de spin sondes
    1. Bubble 50 mM fosfaat buffer met 100 µM DTPA met stikstof gedurende 30 minuten om het gehalte aan opgeloste zuurstof te verwijderen uit de buffer.
    2. De sonde van de spin verwijderen uit de diepvries van-20 ° C en laat de container om te komen tot RT (10-15 min).
    3. Weeg 2,4 mg 1-hydroxy-3-methoxycarbonyl-2,2,5,5-tetramethylpyrrolidine· HCl (CMH) (237.8 g/mol)
    4. Los CMH in 1 mL van de gedeoxygeneerd fosfaatbuffer voor een eindconcentratie van 10 mM.
    5. Weeg 5 mg 1-hydroxy-4-[2-triphenylphosphonio)-acetamido]-2,2,6,6-tetramethylpiperidine,1-hydroxy-2,2,6,6-tetramethyl-4-[2-(triphenylphosphonio)acetamido]piperidinium dichloride (mito-TEMPO-H) (529.1 g/mol).
    6. Los mito-TEMPO-H in 1 mL van de gedeoxygeneerd fosfaatbuffer voor een eindconcentratie van 9,5 mM.
    7. Weeg 4,9 mg 1-hydroxy-3-carboxy-2,2,5,5-tetramethylpyrrolidine· HCl (CPH) (223,7 g/mol).
    8. Los CPH in 1 mL van de gedeoxygeneerd fosfaatbuffer voor een eindconcentratie van 22 mM.
    9. Aliquot en winkel bij-80 ° C (bevriezen-ontdooien is niet aanbevolen).

2. opsporing van Superoxide in vitro

  1. Detectie van totale extracellulaire en intracellulaire superoxide in RAW 264.7 PMA-gestimuleerd cellen op RT
    1. Volgende juiste aseptische techniek, ontdooi RAW 264.7 cellen en hen in DMEM media aangevuld met 10% FBS (laag endotoxine-gratis) en 1% antimycotic/ampicilline bij 37 ° C in CO2 incubator passage.
    2. Zaad RAW 264.7 cellen op 1 x 106 cellen per putje in 6-Wells-platen een dag voorafgaand aan de behandeling.
    3. Zachtjes Verwijder media en wassen van de cellen een keer met 1 mL van KHB buffer.
    4. Voeg KHB met 100 µM DTPA aan elk putje en behandelen in een totaal volume van 500 µL met het volgende:
    5. Wells voorbehandeld met SOD, voeg 15 µL per putje van SOD werkoplossing (1000 U/mL; eindconcentratie van SOD = 30 U/mL) en incubeer gedurende 10 minuten bij 37 ° C vóór toevoeging van de CMH en PMA.
    6. Toevoegen van 12,5 µL per putje van 10 mM CMH voorraad (eindconcentratie = 0,25 mM).
    7. Voeg toe 40 µL per putje van 125 µM PMA werkoplossing (eindconcentratie = 10 µM) of 40 µL voertuig (voorraad 10 µL van DMSO in 390 µL van PBS).
    8. Incubeer gedurende 50 minuten bij 37 ° C in een broedstoof CO2 .
    9. Verwijderen van de platen uit de incubator en leg ze direct op ijs.
    10. Verzamelen buffer van elk putje in aparte, 1,5 mL, het label van buizen. Houd op ijs in de gehele.
    11. Voeg 100 µL van verse KHB buffer met 100 µM DTPA voorzichtig schrapen van de cellen en resuspendeer door pipetteren op en neer meerdere malen. Houd op ijs in de gehele cel resuspensie.
    12. Belasting het monster verzameld in stappen 2.1.10 en 2.1.11 (50 µL) in elk van de capillaire buisjes. Zegel van beide uiteinden en voer de EPR.
      Opmerking: Altijd testen van een buis of goed (zonder cellen) met de sonde in de buffer (dezelfde concentratie = 0,25 mM), behandelde onder dezelfde voorwaarden als de cellen (dezelfde incubatietijd en temperatuur) als een besturingselement, omdat de achtergrond intensiteit van de sonde is temperatuur - en tijd-afhankelijke.
    13. De EPR overname parameters ingesteld op de volgende: magnetron frequentie = 9.65 GHz; veld = 3432 G; modulatie amplitude = 2,0 G; vegen breedte = 80 G; Magnetron vermogen = 19,9 mW; Totaalaantal scans = 10; vegen tijd = 12.11 s; en tijdconstante = 20.48 ms.
  2. Detectie van mitochondriale superoxide in RAW 264.7 cellen
    1. Stappen 2.1.1 en 2.1.2 naar zaad RAW 264.7 cellen één dag voorafgaand aan het experiment.
    2. Verwijder media en wassen van de cellen een keer met 1 mL van KHB buffer.
    3. Voeg 200 µL van KHB met 100 µM DTPA aan elk putje.
    4. 5.3 µL per putje van 9,5 mM mito-TEMPO-H voorraad toevoegen (eindconcentratie = 0,25 mM)
    5. Incubeer gedurende 10 min op RT.
    6. Voeg 1 µL per putje van antimycin A (AA), 5 mM-stockoplossing in ethanol (eindconcentratie = 25 µM).
    7. Incubeer gedurende 50 minuten bij 37 ° C in een broedstoof CO2 .
    8. Verwijderen van de platen uit de incubator en leg ze direct op ijs.
    9. Voorzichtig schrapen van de cellen en resuspendeer door pipetteren omhoog en omlaag. Houd op ijs.
    10. Het laden van het monster in een capillaire buis. Beide uiteinden te verzegelen.
    11. Zie de vorige sectie voor EPR instelling.
  3. Detectie van superoxide in RAW 264.7 cellen bij 77 K
    1. Plaats de buffer verzameld in stap 1.1.10 in vooraf bereid PTFE slang van 1-2 duim in lengte (3/16" OD x 1/8"-ID). Zorg ervoor dat de PTFE-buis is eenvoudig, zodat het gemakkelijk kan worden ingevoegd en verwijderd uit de vinger dewar. Gebruik een rubberstop Sluit één uiteinde van de PTFE-buis, de buffer of celsuspensie (100 tot 150 µL) Pipetteer in de PTFE-buis en verzegelen van de buis met een tweede stop.
    2. Flash bevriezing van het monster in vloeibare stikstof. Het monster kan worden overgebracht naar een gelabelde cryopreservatie buis voor opslag bij-80 ° C of onmiddellijk uitvoeren.
    3. Vul de vinger dewar met vloeibare stikstof en invoegen de PTFE-buis met het monster in de vinger dewar. Zorg ervoor dat het monster is gecentreerd in een actief tijdsbestek van de resonator en EPR draaien op 77 K.
      Opmerking: Start de gasstroming stikstof aan uw spectrometer 15-30 min voordat de metingen, en blijven deze stroming in de metingen om te voorkomen dat de condensatie van het water in de resonator.
    4. EPR overname parameters ingesteld op de volgende: magnetron frequentie = 9.65 GHz; veld = 3438 G; modulatie amplitude = 4,0 G; vegen breedte = 150 G; Magnetron vermogen = 0.316 mW; Totaalaantal scans = 10; vegen tijd = 60 s; en tijdconstante = 1,28 ms.

3. EPR metingen in vloeistoffen

  1. Volbloed
    1. Muizen (8-12 weken oud) met een enkelvoudige dosis van intratracheale bleomycine (Bleo; 100 µL bij 1 U/mL) opgelost in PBS of PBS alleen als eerder beschreven16,17te behandelen.
    2. Euthanaseren muizen door het toedienen van geïnhaleerde Isofluraan (1.5-4%) gevolgd door exsanguination en cervicale dislocatie. Bloed via de rechterventrikel gecombineerd in een spuit bedekt met heparine (1000 USP/mL) met 100 µM DTPA en transfer naar een 1,5 mL-buis.
    3. In een aparte 1,5 mL-buis, voeg 15 µL van PBS met 100 µM DTPA en 3 µL van CMH (10 mM) tot 132 µL bloed voor een totaal volume van 150 µL en CMH eindconcentratie van 0,2 mM.
    4. Incubeer bloed gedurende 10 minuten bij 37 ° C in een waterbad.
    5. Verwijder de buizen uit het waterbad.
    6. Een aliquot deel te nemen door het bloed in een capillair laden en draaien EPR op RT met de volgende parameters van de EPR overname: magnetron frequentie = 9.65 GHz; veld = 3432 G; modulatie amplitude = 1,0 G; vegen breedte = 80 G; Magnetron vermogen = 19,9 mW; Totaalaantal scans = 3; vegen tijd = 12.11 s; en tijdconstante = 20.48 ms. ook monsters kan worden bevroren als beschreven in stap 2.3 flash voor metingen op 77 K. EPR overname parameters de volgende zijn: magnetron frequentie = 9.65 GHz; veld = 3438 G; modulatie amplitude = 4,0 G; vegen breedte = 150 G; Magnetron vermogen = 0.316 mW; Totaalaantal scans = 2; vegen tijd = 60 s; en tijdconstante = 1,28 ms.
  2. Bronchoalveolar lavage vloeistof (BALF)
    1. Na euthanasie (zie stap 3.1.2), verzamelen BALF door langzaam wekken of intrekking van de 1 mL PBS met 100 µM DTPA driemaal in een spuit via een canule in de luchtpijp geplaatst.
    2. Behandelen in een buis 1,5 mL, 200 µL van BALF met 4 µL van CMH (10 mM) te verkrijgen van een eindconcentratie van 0,2 mM.
    3. BALF Incubeer gedurende 50 minuten bij 37 ° C in een waterbad.
    4. Neem buizen uit het waterbad en plaats ze op het ijs.
    5. BALF lading in een capillair en stormloop EPR op RT met dezelfde EPR instellingen zoals gebruikt in stap 1.1.13 of flash bevriezen in vloeibare stikstof, zoals beschreven in stap 2.3.
  3. Metingen van de EPR in bloed en BALF op 77 K
    1. Volg het protocol hierboven om het verzamelen van bloed (stappen 3.1.1. aan 3.1.4) en BALF (stappen 3.2.1 tot en met 3.2.4).
    2. Plaats 150 µL van het behandelde bloed of BALF in PTFE slang (1-2 in). Gebruik een rubberstop Sluit één uiteinde van de PTFE-buis voorafgaand aan het monster en een andere stop te verzegelen de slang toe te voegen.
    3. Flash bevriezing van het monster in vloeibare stikstof.
    4. Zie sectie 2.3 voor meer informatie over het uitvoeren van de EPR in bevroren monsters in de PTFE-buis met de vinger die Dewar op 77 K. Run bevroren CMH bloedmonsters met behandeld in een week.

4. EPR metingen op longweefsel

  1. Flash bevroren longweefsel
    1. Na het verzamelen van de BALF in stap 3.2.1, de borst is geopend en longen gespoeld met 10 mL van koude PBS via de rechterventrikel Schakel bloed. Flash bevriezen de longweefsel in vloeibare stikstof. Bevroren longweefsel kan worden achtergelaten bij-80 ° C voor maximaal 6 maanden tot gebruik voor EPR metingen.
    2. Stabiliseren van het longweefsel op droog ijs met een pincet en meerdere kleine stukjes (5-15 mg) van het longweefsel met behulp van een single-edge mes gesneden.
    3. Wegen van het weefsel in een tube van 1,5 mL, plaats de buis op de schaal en tarra van de schaal, dan toevoegen van stukjes weefsel en het gewicht.
    4. Voeg aan het weefsel in de 1,5 mL-buis, 196 µL van KHB met DTPA en 4 µL van CMH (0.2 mM), zodat het bereiken van een 200 µL totaal volume.
    5. Incubeer gedurende 1 uur bij 37 ° C in een waterbad.
    6. Spin down (voor een paar seconden) in een microcentrifuge bij 3,884 x-g.
    7. Plaats op ijs en Pipetteer 150 µL van de bovendrijvende substantie in de PTFE-buis en bevriezen voor de 77 K metingen zoals beschreven in punt 2.3.
      Opmerking: Voor deze methode, de heterogeniteit van de schade moet worden beschouwd. Voor een blessure van bleomycine-geïnduceerde Long, gezien het feit dat het een zeer heterogene blessure, is het aanbevolen om het Knip verschillende weefsel stukken uit verschillende delen van de Long van elke muis. Anderzijds kan een groter stuk weefsel worden gehomogeniseerd in KHB buffer met 100 µM DTPA met een onderlinge verhouding van 1:6, gewicht-naar-volume (mg/µL) zoals hieronder beschreven.
  2. Verse longweefsel bewaard in sacharose buffer
    1. Spoel de lavaged longen met koude PBS bloed verwijderen, zoals gedaan in stap 3.1.2.
    2. Meng het verse longweefsel in Tris-EDTA-buffer met 0,25 M sacharose met een verhouding van 1:6 Long/buffer (mg/µL) Dounce weefsel grinder met een glas of PTFE stamper.
    3. 50 µL van de Long homogenaat aan 450 µL van KHB met 100 µM DTPA toevoegen.
    4. Voeg in een 1,5 mL buis (in een totaal volume van 100 µL), aan 98 µL van longkanker homogenaat in KHB, 2 µL van CMH van 10 mM materieel te verkrijgen van een eindconcentratie van 0,2 mM.
    5. Incubeer gedurende 20 minuten in een waterbad 37 ° C.
    6. Leg de monsters op ijs en ze laden in een capillaire buis. EPR op RT (instellingen gebruikt in stap 2.1.13) uitvoeren.
    7. Om te testen de bijdrage van bepaalde soorten en bronnen met behulp van verschillende remmers, vooraf 88 µL van longkanker homogenaat +/-remmer, aanpassen met KHB tot een eindvolume van 98 µL te behandelen. In dit experiment, inbegrepen de remmers 10 µL van SOD (100 U/mL), 4 µL van deferoxamine (DFO; eindconcentratie = 800 µM), of 4 µL van diphenyliodonium chloride (DIP; eindconcentratie = 100 µM). Incubeer gedurende 20 minuten bij 37 ° C in een waterbad.
    8. Voeg 2 µL van CMH en incubeer gedurende een ander 20 minuten bij 37 ° C, gevolgd door EPR metingen zoals hierboven beschreven. Omvatten een eenmalige gecompenseerde blancomonster met CMH KHB met sacharose buffer. U kunt ook opslaan aliquots van de overblijvende Long homogenates (stap 3.1.2) bij-80 ° C voor toekomstige metingen.
      Opmerking: Het totale volume kan worden aangepast zoals nodig.
  3. EPR metingen op longweefsel van muizen ingespoten met spin sondes in vivo (bij RT met weefsel-cel)
    1. CPH-stockoplossing voorbereiden door ontbinding van 4,9 mg CPH in 1 mL gefilterde en gedeoxygeneerd 50 mM fosfaatbuffer.
    2. Anesthetize muizen met geïnhaleerde Isofluraan (1.5-4%) voor 20-30 seconden totdat niet-reagerende tot teen snuifje. Injecteren van muizen via de route van de retroorbital met 100 µL van CPH spin sonde voor een lichaamsgewicht van 25 g muis (laatste dosis = 20 mg/kg), en laat de sonde te circuleren voor 1 h. onmiddellijk na retroorbital injectie, een daling van 0,5% proparacaine HCl op de oogcontour aan preve toevoegen NT oog pijn en droogte. Muizen voor 1 h controleren en ga naar het weefsel oogsten.
    3. Oogst van het longweefsel, zoals hierboven beschreven en flash bevriezen de longen.
    4. Knippen van 20-30 mg van bevroren weefsel op droog ijs en het exacte gewicht opnemen.
    5. Veeg voorzichtig het weefsel met schoonmaak doekjes om elk oppervlak water absorberen.
    6. Plaats het weefsel binnen het venster van de weefsel-cel (een accessoire maakt EPR metingen voor weefselsteekproeven) en EPR en controleer of totaal draaiingen worden uitgevoerd. De gegevens kan worden uitgedrukt als de totale draaiingen per mg van weefsel.

5. de gegevensanalyse

  1. De EPR spectra met behulp van de SpinFit module opgenomen in de software van de Xenon van de Bank-top EMXnano EPR spectrometer simuleren. Bepaal de concentratie van nitroxide door de SpinCount module. U kunt ook een ijkkromme van een stabiel nitroxide zoals 4-hydroxy-TEMPO of TEMPOL kan worden gemaakt, en de concentratie kan worden verkregen door het vergelijken van de intensiteit van het signaal met het monster en de standaard.
  2. Gebruiken voor de gegevens verzameld bij 77 K, dubbele integratie gevolgd door SpinCount.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Superoxide detectie met behulp van CMH werd gevalideerd met behulp van de X / XO superoxide genereren systeem om aan te tonen dat de nitroxide (CM.)-signaal was volledig geremd door SOD, terwijl katalase had geen effect (figuur 1A). De totale, extracellulaire superoxide was het vervolgens geëvalueerd in RAW 264.7 cellen door drachtige cellen met de cel-permeabele CMH spin sonde +/-SOD voorbehandeling. De concentratie van de nitroxide werd gemeten i...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De beoordeling van de productie van vrije radicalen in biologische instellingen is belangrijk in begrip redox geregeld signalering bij gezondheid en ziekte, maar de maatregel van deze soorten is zeer uitdagend vanwege de korte halfwaardetijd van vrije radicalen soorten en technische beperkingen met veelgebruikte methoden. EPR is een waardevolle en krachtige tool in de redox biologie, want het is de alleen ondubbelzinnig methode voor het opsporen van vrije radicalen. In dit project, tonen we praktische EPR methoden voor h...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit werk werd gesteund door de Universiteit van Colorado-School van geneeskunde Dean's strategische onderzoeksinfrastructuur award, R01 HL086680-09 en 1R35HL139726-01, E.N.G. en UCD CFReT fellowship Award (HE). De auteurs bedanken Dr. Sandra Eaton en Dr. Gareth Eaton (Universiteit van Denver), Dr. Gerald Rosen en Dr. Joseph P. Kao (Universiteit van Maryland), Dr. Sujatha Venkataraman (Universiteit van Colorado Denver) voor nuttige discussies en Joanne Maltzahn, Ashley Trumpie en Ivy McDermott (Universiteit van Colorado Denver) voor technische ondersteuning.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
DMEMLifeTech10566-016celcultuur media
Diethylenetriaminepentaacetic acid (DTPA)Sigma AldrichD6518-5G
sodium chloride (NaCl) Fisher Scientific  BP358-212gebruikt voor het bereiden van 50 mM fosfaatzoutoplossing volgens Sigma aldrish  
potassium phosphate dibasic (HK2PO4 )Fisher Scientific  BP363-500gebruikt voor het bereiden van 50 mM fosfaatzoutoplossing volgens Sigma aldrish  
potassium phosphate monobasic (KH2PO4 )Sigma AldrichP-5379gebruikt voor het bereiden van 50 mM fosfaatzoutoplossing volgens Sigma aldrish  
Krebs-Henseleit buffer (KHB) (Alfa Aesar, Hill)J67820
Bovine erythrocyte superoxide dismutase (SOD)Sigma Aldrich S7571-30KU
Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) Sigma AldrichP1585-1MGOplossen in DMSO
Antimycin A (AA)Sigma AldrichA8674-25MGOplossen in ethanol en bewaren in glazen flesjes(MW gebruikt is de gemiddelde molecuulgewichten voor vier lots)
1-Hydroxy-3-methoxycarbonyl-2,2,5,5-tetramethylpyrrolidine . HCl (CMH)Enzo Life SciencesALX-430-117-M050
1-Hydroxy-3-carboxy-2,2,5,5-tetramethylpyrrolidine. HCl (CPH)Enzo Life SciencesALX-430-078-M250
1-Hydroxy-4-[2-triphenylphosphonio)-acetamido]-2,2,6,6-tetramethylpiperidine, 1-Hydroxy-2,2,6,6-tetramethyl-4-[2-(triphenylphosphonio)acetamido]piperidinium dihydrochloride ( mito-TEMPO-H)Enzo Life SciencesALX-430-171-M005
1-Hydroxy-2,2,6,6-tetramethylpiperidin-4-yl-trimethylammonium chloride . HCl (CAT1H)Enzo Life SciencesALX-430-131-M250
Heparine Sagent PharmaceuticalsNDC 25021-400-10
Diphenyliodonium chloride Sigma Aldrich43088
Deferoxamin mesylaat zoutSigma AldrichD9533-1G
CritosealLeica39215003
BRAND wegwerp BLAUBRAND micropipetten, intraMarkSigma Aldrich708733Capillairen
PTFE FRACTIONAL FLUOROPOLYMER TUBING
3/16” OD x 1/8” ID		NORELL1598774ATeflon buisjes 
SILICONE RUBBER STOPPERS FOR NMR SAMPLE TUBES  FOR THIN WALL TUBES HAVING AN OD OF 4mm-5mm (3.2mm TO 4.2mm ID) TS-4-5-SRNORELL94987
EMXnano Bench-Top EPR spectrometer Bruker BioSpin GmbHE7004002
EMX NANO TISSUE CELLBruker BioSpin GmbHE7004542

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Kalyanaraman, B., et al. Measuring reactive oxygen and nitrogen species with fluorescent probes: challenges and limitations. Free Radical Biology and Medicine. 52 (1), 1-6 (2012).
  2. Bobko, A. A., et al. In vivo monitoring of pH, redox status, and glutathione using L-band EPR for assessment of therapeutic effectiveness in solid tumors. Magnetic Resonance in Medicine. 67 (6), 1827-1836 (2012).
  3. Elajaili, H. B., et al. Electron spin relaxation times and rapid scan EPR imaging of pH-sensitive amino-substituted trityl radicals. Magnetic Resonance in Chemistry. 53 (4), 280-284 (2015).
  4. Elajaili, H., et al. Imaging disulfide dinitroxides at 250 MHz to monitor thiol redox status. Journal of Magnetic Resonance. 260, 77-82 (2015).
  5. Halpern, H. J., et al. Oxymetry Deep in Tissues with Low-Frequency Electron-Paramagnetic-Resonance. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (26), 13047-13051 (1994).
  6. Epel, B., et al. Imaging thiol redox status in murine tumors in vivo with rapid-scan electron paramagnetic resonanc. Journal of Magnetic Resonance. 276, 31-36 (2017).
  7. Legenzov, E. A., Sims, S. J., Dirda, N. D. A., Rosen, G. M., Kao, J. P. Y. Disulfide-Linked Dinitroxides for Monitoring Cellular Thiol Redox Status through Electron Paramagnetic Resonance Spectroscopy. Biochemistry. 54 (47), 6973-6982 (2015).
  8. Abbas, K., et al. Medium-throughput ESR detection of superoxide production in undetached adherent cells using cyclic nitrone spin traps. Free Radical Research. 49 (9), 1122-1128 (2015).
  9. Dikalov, S. I., et al. Distinct roles of Nox1 and Nox4 in basal and angiotensin II-stimulated superoxide and hydrogen peroxide production. Free Radical Biology and Medicine. 45 (9), 1340-1351 (2008).
  10. Dikalov, S. I., Kirilyuk, I. A., Voinov, M., Grigor'ev, I. A. EPR detection of cellular and mitochondrial superoxide using cyclic hydroxylamines. Free Radical Research. 45 (4), 417-430 (2011).
  11. Dikalova, A. E., et al. Therapeutic Targeting of Mitochondrial Superoxide in Hypertension. Circulation Research. 107 (1), 106-116 (2010).
  12. Dikalov, S. I., Polienko, Y. F., Kirilyuk, I. Electron Paramagnetic Resonance Measurements of Reactive Oxygen Species by Cyclic Hydroxylamine Spin Probes. Antioxidants & Redox Signaling. , (2017).
  13. Sharma, S., et al. L-Carnitine preserves endothelial function in a lamb model of increased pulmonary blood flow. Pediatric Research. 74 (1), 39-47 (2013).
  14. Berg, K., Ericsson, M., Lindgren, M., Gustafsson, H. A High Precision Method for Quantitative Measurements of Reactive Oxygen Species in Frozen Biopsies. PloS One. 9 (3), (2014).
  15. Kozlov, A. V., et al. EPR analysis reveals three tissues responding to endotoxin by increased formation of reactive oxygen and nitrogen species. Free Radical Biology and Medicine. 34 (12), 1555-1562 (2003).
  16. Van Rheen, Z., et al. Lung Extracellular Superoxide Dismutase Overexpression Lessens Bleomycin-Induced Pulmonary Hypertension and Vascular Remodeling. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 44 (4), 500-508 (2011).
  17. Mouradian, G. C., et al. Superoxide Dismutase 3 R213G Single-Nucleotide Polymorphism Blocks Murine Bleomycin-Induced Fibrosis and Promotes Resolution of Inflammation. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 56 (3), 362-371 (2017).
  18. Dikalov, S. I., Li, W., Mehranpour, P., Wang, S. S., Zafari, A. M. Production of extracellular superoxide by human lymphoblast cell lines: comparison of electron spin resonance techniques and cytochrome C reduction assay. Biochem Pharmacol. 73 (7), 972-980 (2007).
  19. Kozuleva, M., et al. Quantification of superoxide radical production in thylakoid membrane using cyclic hydroxylamines. Free Radical Biology and Medicine. 89, 1014-1023 (2015).
  20. Chen, K., Swartz, H. M. Oxidation of Hydroxylamines to Nitroxide Spin Labels in Living Cells. Biochimica Et Biophysica Acta. 970 (3), 270-277 (1988).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Reactieve ZuurstofsoortenSuperoxide detectieSpinprobesEPR spectroscopieKamertemperatuur77 KelvinMonsterbewaringLongweefselCelkultur

Gerelateerde artikelen