Hier presenteren wij ons protocol voor produceren geïnduceerde erythroid progenitoren (iEPs) van volwassen fibroblasten muis met behulp van transcriptie factor-gedreven directe bloedlijn herprogrammering (DLR).
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Directe bloedlijn herprogrammering van volwassen muis Fibroblast te Erythroid voorlopercellen
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Erythroid cel inzet en differentiatie doorlopen activering van een bloedlijn-beperkte transcriptionele netwerk georkestreerd door een groep van het lot van de cel bepalen en factoren rijpen. We eerder uiteengezet te definiëren de minimale benodigde factoren voor het instrueren van de rode bloedcellen ontwikkelen met behulp van directe bloedlijn herprogrammering van fibroblasten in geïnduceerde erythroid progenitoren/precursoren (iEPs). We toonden dat overexpressie van Gata1, Tal1, Lmo2en c-Myc (GTLM) kunnen snel converteren lymfkliertest en humane fibroblasten rechtstreeks aan iEPs die lijken op de bona fide erythroid cellen in termen van morfologie, fenotype, en genexpressie. Wij zijn van plan dat iEPs een instrument van onschatbare waarde om te studeren Erytropoëse en cel lot verordening zal bieden. Hier beschrijven we de stapsgewijze proces van het omzetten van lymfkliertest staart tip fibroblasten in iEPs via transcriptie factor-gedreven directe bloedlijn herprogrammering (DLR). In dit voorbeeld voeren wij de herprogrammering in fibroblasten van erythroid afkomst-tracing muizen die uitdrukking geven aan de gele fluorescerende proteïne (YFP) onder de controle van de Erytropoëtine receptor gen (EpoR) promotor, visualisatie van erythroid cel inschakelen lot inductie op herprogrammering. Naar aanleiding van dit protocol, fibroblasten kunnen worden geherprogrammeerd in iEPs binnen vijf tot acht dagen.
Terwijl verbeteringen kunnen nog steeds worden gemaakt aan het proces, laten we zien dat GTLM-gemedieerde herprogrammering is een snelle en directe proces, opbrengst van cellen met eigenschappen van bona fide erythroid voorlopercellen en voorloper cellen.
Inleiding
Rode bloedcellen (RBC) zijn essentieel in alle gewervelden en make-up 84% van alle cellen van het menselijk lichaam1. Van embryonale tot volwassen leven is onze gezondheid sterk afhankelijk van de exacte regeling van RBC homeostase. De voortdurende productie van rijpe RBC in de gehele ontwikkeling naar volwassenheid staat bekend als de Erytropoëse. Een belangrijke uitdaging in de Erytropoëse onderzoek is vast te stellen van de master toezichthouders dat ontwikkeling van de RBC en de switch tussen primitieve en definitieve Erytropoëse orkestreren. Directe bloedlijn herprogrammering van erythroid voorlopercellen biedt een kans om verder te begrijpen erythroid ontwikkeling in vivo.
Directe bloedlijn herprogrammering (DLR), ook bekend als transdifferentiatie, is het proces van herprogrammering één celtype rechtstreeks naar de andere, het omzeilen van pluripotente en multipotente voorlopercellen stadia. DLR heeft tot nu toe is gebruikt voor de productie van vele celtypes, met inbegrip van neurale2, hematopoietische3,4,5, hepatische6 en nefrotisch7, voorlopercellen. Voor ontwikkelingsstoornissen biologen, DLR uitgegroeid tot een belangrijk instrument voor Larive aspecten van lineage inzet en terminal differentiatie processen8,9. DLR kan aanvullen en gedeeltelijk vervangen in vivo studies voor het begrijpen van mechanismen van het lot van de cel bepalende factoren tijdens de ontwikkeling. De DLR-protocol voor de herprogrammering te erythroid progenitoren beschreven in dit document levert het veld een gratis methode voor bestudering van de ontwikkelings van de Erytropoëse.
Wij hebben eerder aangetoond dat overexpressie van een vier-factor-cocktail, GATA1, TAL1, LMO2, en c-MYC (GTLM), voldoende om te herprogrammeren van zowel menselijke als lymfkliertest fibroblasten rechtstreeks naar geïnduceerde erythroid voorlopercellen (iEPs) 10. the GTLM-geherprogrammeerd erythroid cellen lijken sterk op bona fide primitieve erythroid progenitoren in termen van morfologie, fenotype en gen expressie10. Dus iEPs hebben beperkte capaciteit van de proliferatie en vervallen en genucleëerde vergelijkbaar zijn met die Transient geproduceerd in het vroege embryo vóór aanvang van de definitieve Erytropoëse erythrocyten. Door wijzigingen in de herprogrammering voorwaarden (bijvoorbeeld puntmutaties in herprogrammering factoren of toevoeging van andere factoren), kan men begrijpen hoe dit leidt tot veranderingen in de erythroid ontwikkeling en differentiatie. We hebben bijvoorbeeld aangetoond dat toevoeging van Klf1 of Myb aan de cocktail GTLM het globine-expressiepatroon van overwegend embryonale (primitieve verandert) vooral volwassen (definitieve). Deze bevinding bevestigt de geldigheid van het gebruik van DLR als een instrument voor het definiëren van ontwikkelingsstoornissen factoren in de Erytropoëse.
We schetsen hier, het proces van het genereren van iEPs van muis staart tip fibroblasten (TTF). In onze representatieve resultaten, we uitgevoerd de herprogrammering op fibroblasten van de erythroid afstamming-tracing muizen (Epor- Cre R26- eYFP) die express de gele fluorescerende proteïne (eYFP) van de Rosa26 locus in alle cellen die geuit de Erytropoëtine-receptor, waardoor eenvoudige visualisatie van betrokkenheid bij de erythroid afkomst. Met behulp van deze methode, zijn positieve YFP (EpoR +) cellen aanwezig zo spoedig vijf dagen na transductie. Dit protocol, daarom biedt een snelle en robuuste techniek voor de generatie van erythroid voorlopercellen in vitro.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
1. oprichting en onderhoud van primaire muis staart Tip Fibroblast culturen
- Bereid gelatine beklede gerechten (adviseren een 10 cm schotel voor één staart) door die betrekking hebben op het oppervlak met 0,1% gelatine en het broeden van de gerechten gedurende ongeveer 20 minuten bij 37 ° C. Gecombineerd de oplossing van de gelatine van de schotel en laat ze drogen voor ten minste 2 uur.
- De muizen door cervicale dislocatie euthanaseren. Verwijder de staart met een schaar, snijden aan de voet van de staart. Zet de staart in de Dulbecco-fosfaatgebufferde zoutoplossing (DPBS) met 2% foetale runderserum (FBS) tot klaar voor gebruik.
Opmerking: Voor de beste resultaten, staarten moet worden genomen van muizen ongeveer 6 tot 8 weken oud. Staarten kunnen muizen ouder dan 8 weken leeftijd, echter, als de leeftijd van de muizen, het vermogen van de proliferatie van de fibroblasten en de efficiëntie van herprogrammering afname11worden onttrokken. - Voer alle volgende stappen van dit protocol in de kap van een weefselkweek onder steriele omstandigheden. Bereid een verdunde trypsine-oplossing van 0,02% trypsine-EDTA in DPBS en voeg 5 mL in een ongecoate 10 cm schotel.
- Wassen van de staart, eerst in 70% ethanol en vervolgens in DPBS. Plaats de staart plat in een schotel, en pincet gebruiken tot het op zijn plaats houden. Maak een incisie op de staart langs de longitudinale as van de basis tot aan de vingertop.
- Pak de staart met een paar pincet en houd het verticaal. Met behulp van een tweede paar pincet, greep de huid naast de incisie aan de voet van de staart en schil het terug. Doe dit aan beide zijden van de incisie totdat de huid kan worden geschild af door te trekken naar beneden naar het puntje van de staart.
- Houd de gepelde staart met een tang boven de schotel met de oplossing van de trypsine en snijd de staart in ongeveer 1 cm lange stukken. Met de staart stukken in de oplossing van de trypsine, kunt schaar fragment van de stukken in kleinere stukken. Incubeer de staart stukken in de oplossing van de trypsine bij 37 ° C gedurende 10 minuten.
Opmerking: Hoe kleiner de stukken zijn voorkeur zodat elk stuk een hoge oppervlak volumeverhouding. - Doven van de trypsine 2 volumes van fibroblast expansie (FEX) medium gebruiken (hoge-glucose Dulbecco bewerkt Eagle Medium (DMEM) met 15% FBS, 2 mM L-glutamine, niet-essentiële aminozuren (NEAA) en 100 U/mL penicilline/streptomycine).
- Verzamelen van de gehele inhoud van de schotel in een tube 50 mL en centrifugeer bij 350 × g gedurende 5 min bij 4 ° C. Gecombineerd het supernatant en resuspendeer de staart fragmenten in 10 mL verse FEX voedingsbodem.
- Staart fragmenten in medium overbrengen in een gelatine beklede schotel en Incubeer bij 37 ° C in 5% CO2 en 4% O2, het toevoegen van verse FEX medium om de 2 dagen.
Opmerking: Na vijf tot zeven dagen, staart fragmenten hebt gekoppeld aan de onderkant van de schotel en fibroblasten gezien kunnen worden afgestapt van hen. - Zodra de clusters van fibroblasten zijn bevlekt, schud zachtjes de schotel te verjagen staart stukken en gecombineerd het medium en alle de botfragmenten verlaten van de fibroblasten die is gekoppeld aan de plaat. Voeg nieuwe FEX medium en cultuur van de fibroblasten tot heuvels.
- Om ervoor te zorgen geen besmetting van fibroblasten door hematopoietische progenitorcellen, distantiëren van de cellen van de plaat met behulp van 1 x trypsine-EDTA voor 5 minuten en het verzamelen van cellen. Afbreken voor cellen uiten van hematopoietische markeringen (CD117, CD5, CD45R (B220), CD11b, Anti-Gr-1 (Ly-6G/C), 7-4, en Ter-119) met behulp van een magnetische scheiding systeem10.
2. retrovirus productie
- Zaad retrovirale verpakking cellen op ongeveer 2,5 × 104 cellen/cm2 (2.0 × 106 cellen voor een 10 cm schotel) op een schotel Weefselkweek behandeld (door vacuüm-gasplasma) en cultuur overnachting in hoge-glucose DMEM met 10% FBS, 10 mM natrium Pyruvaat en 100 U/mL penicilline/streptomycine bij 37 ° C en 5% CO2.
- De volgende ochtend, Wijzig op het medium DMEM met geen additieven met behulp van halve het volume dat wordt gebruikt om 's nachts cultuur (5 mL voor een 10 cm schotel). Controleer of de cellen 70-80% heuvels zijn en de transfectie beginnen in de middag.
- Voor elke herprogrammering factor bereiden Gata1, Tal1, Lmo2, en c-Myc, een mengsel 2:1 van de expressie vector (pMX) en helper vector (met gag en pol genen). Voor een 10 cm schotel van fibroblasten, door 6 µg expressie vector en 3 µg helper vector in een eindvolume van 100 µL in DMEM medium te gebruiken.
- Voor elke herprogrammering factor, bereiden van 300 µL van kamertemperatuur (RT) DMEM in een steriele polystyreen buis en voeg voorzichtig 27 µL van commerciële transfectiereagens.
Opmerking: Het transfectiereagens moet worden voorgelegd aan RT gebruik en rechtstreeks in het medium moet worden toegevoegd als de elektrostatische eigenschappen van de stof kunnen maken het vasthouden aan de kunststof wand van de buis. - Toevoegen van de plasmide mix in de transfectie reagens-bevattende buis, vortex kort en Incubeer de transfectie reagens-DNA mengsel gedurende 15 minuten op RT. kort vortex het mengsel en ontkleuring toevoegen aan de cellen retrovirale verpakking zodat de Transfectie reagens-DNA mix is gelijkmatig verspreid over de cultuur en Incubeer bij 37 ° C's nachts.
- 24 uur na de transfectie, omzetten in het medium DMEM met 20% FBS en 100 U/mL penicilline/streptomycine. 48 uur na de transfectie, verzamelen het supernatant en filtreer het door een 0,22 µm poriegrootte spuit filter.
Opmerking: Virale supernatant kunnen worden bevroren tot-80 ° C en bewaard totdat vereist, hoewel transductie efficiënter is als verse virale supernatant wordt gebruikt.
3. GTLM transductie en iEP oogst
- De staart tip fibroblasten op 1 × 10-4 -cellen/cm2 op 0,1% gelatine vooraf gecoat zaad gerechten in FEX medium en Incubeer bij 37 ° C gedurende 24 uur.
- De volgende dag, bereiden een mengsel van signaaltransductie als volgt.
- Voeg 1 volume van virale supernatans dat voor elke herprogrammering factor aangevuld met 4 µg/mL retrovirale infectie reagens (40%) tot 6 volumes van FEX medium (60%).
- Voor een 10 cm schotel van fibroblasten, voeg 1 mL van elk virale supernatans (4 × virussen = 4 mL) aangevuld met 4 µg/mL retrovirale infectie reagens tot 6 mL van FEX medium, gevend een totaal van 10 mL transductie mengsel.
- FEX medium uit de fibroblast cultuur gecombineerd en te vervangen door het mengsel transductie. Incubeer de signaaltransductie gedurende 4 uur bij 37 ° C in hypoxische voorwaarden (5% CO2 en 4% O2).
- Het mengsel transductie gecombineerd en vervangen door verse herprogrammering medium (serumvrij uitbreiding medium (SFEM), 100 U/mLPenicillin/streptomycine, 100 ng/mL lymfkliertest stamcel Factor (mSCF), 10 ng/mL lymfkliertest interleukine-3 (IL3), 2 U/mL menselijke recombinant Erytropoëtine (hrEPO), en 100 nM dexamethason).
- Incubeer gedurende 8 daysat 37 ° C in hypoxische voorwaarden, het toevoegen van verse herprogrammering medium om de 2 dagen. Na vijf tot acht dagen, het succesvolle herprogrammering zal opleveren clusters van cellen die hebben losgemaakt van de plaat.
- Het verzamelen van geherprogrammeerde cellen voor analyse, zachtjes Pipetteer omhoog en omlaag om te oogsten hen rechtstreeks vanaf de schotel. Om te oogsten untransduced fibroblasten voor vergelijking, distantiëren van de cellen van de plaat met 1 x trypsine-EDTA en verzamelen.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Hier presenteren we een reproduceerbare protocol voor de productie van iEPs van volwassen fibroblasten met behulp van transcriptie factor gestuurde DLR. We evalueren de cel herprogrammering met stroom cytometry, kolonie-vormende testen en gen expressie analyse. Om te helpen bij de visualisatie van de conversie naar erythroid cel lot, we uitgevoerd de herprogrammering op fibroblasten van de erythroid afstamming-tracing muizen (Epor- Cre R26- eYFP) die express de gele fluo...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Overexpressie van een vier-factor-cocktail, GATA1, TAL1, LMO2, en c-MYC (GTLM), is voldoende om te herprogrammeren lymfkliertest en humane fibroblasten rechtstreeks naar iEPs10. De cellen geherprogrammeerde erythroid leek sterk op bona fide erythroid progenitoren in termen van morfologie, fenotype, genuitdrukking en kolonievormend vermogen. Deze bevinding bevestigt de grondgedachte van...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben geen conflicten van belang verslag.
Dankbetuigingen
Wij danken Evelyn Wang en Gregory Hyde (Instituut Whitehead, Cambridge, MA) voor klonen en Harvey Lodish (Instituut Whitehead) voor het verstrekken van veel van de plasmiden gebruikt voor het genereren van de retrovirale bibliotheek. Wij danken Kavitha Siva en Sofie Singbrant (afdeling van moleculaire geneeskunde en Gene Therapy, Lund University), Göran Karlsson en Shamit Soneji (departement voor moleculaire hematologie, Lund University) voor hun rollen in beschrijving van iEP productie. Wij willen ook te erkennen en dank Julian Pulecio (centrum voor regeneratieve geneeskunde, Barcelona Biomedical Research Park), Violeta Rayon-Estrada (The Rockefeller University, New York), Carl Walkley (St. Vincent's Instituut voor medisch onderzoek en Vakgroep Geneeskunde, St Vincent's Hospital, Universiteit van Melbourne), Ángel Raya (Catalaanse instelling voor onderzoek en geavanceerde Studies, Barcelona) en Vijay G. Sankaran (Broad Instituut van het Massachusetts Institute of Technology en Harvard, Cambridge ) voor hun vorige bijdrage aan dit werk. Dit werk werd gesteund door de Ragnar Söderberg Stichting (JF); het Zweedse onderzoek Raad (aan J.F.); Stichting Olle Engkvist Byggmästare (aan J.F.); de Zweedse Stichting voor strategisch onderzoek (JF); Åke Wiberg van Stichting (JF); een toekenning van de integratie Marie Curie (aan J.F.).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| DMEM zonder natriumpyruvaat | GE Life Sciences | SH30022.01 | Kweekmedium voor PhGP-cellen |
| DMEM met natriumpyruvaat | GE Life Sciences | SH30243.01 | Kweekmedium voor staartpuntfibroblasten |
| StemSpan Serum Free Expansion Media (SFEM) | Stem Cell Technologies | 9650 | Reprogrammeringsmedium |
| Fetaal runderserum HyClone | GE Life Sciences | SH30071.03HI | Groeifactor |
| Penicilline/Streptomycine HyClone (100x) | Ge Life Sciences | SV30010 | Antibioticum |
| Niet-essentiële aminozuren (100x) | Thermo Fisher | 11140050 | SNL-medium wordt hiermee aangevuld |
| Trypsine HyClone (1x) | GE Life Sciences | SH30042.01 | Celdissociatie-agens |
| Murine stamcelfactor (mSCF) | Peprotech | 250-03 | Toegevoegd aan het reprogrammeringsmedium |
| Recombinant muur-Il-3 | Peprotech | 213-13 | Toegevoegd aan het reprogrammeringsmedium |
| Humaan recombinant erytropoiëtine (hrEPO) | Peprotech | 100-64 | Toegevoegd aan het reprogrammeringsmedium |
| Dexamethason | Sigma | 50-02-2 | Toegevoegd aan het reprogrammeringsmedium |
| Gelatine uit varkenshuid | Sigma | 9000-70-8 | Opgelost in dH2O en gebruikt voor het coaten van platen. Zorg voor steriliteit voor gebruik. |
| Blasticidin S hydrochloride | Sigma | 3/9/3513 | Selectie-antibioticum. Beïnvloedt zowel pro- als eukaryotische cellen |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS) | Ge Life Sciences | SH30850.03 | Gebaat voor wasstappen |
| Polybrene | Merck | TR-1003-G | Besmetting / Transfectiereagent |
| FuGENE HD Transfectiereagent | Promega | E2311 | Transfectiereagent voor PhGP-cellijn |
| Millex-GP-seringspompfiltereenheid 0,22 µm | Merck | SLGP033RS | Gebaat voor het filteren van virussupernatant |
| BD Emerald Hypodermic-sering | Becton Dickinson | SKU: 307736 | Gebaat voor het filteren van virussupernatant |
| 100 mm kweekschaal | Corning | 430167 | Cellenkweek |
| 6-well plate | Falcon | 10799541 | Cellenkweek |
| Juwelierstang #5 | Sklar | 66-7642 | Gebaat voor het hanteren van kleine staartfragmenten |
| Sklarlite Iris-schaar | Sklar | 23-1149 | Gebaat voor het snijden van de staart in kleine stukken |
| Lineage Cell Depletion Kit, muis | Miltenyi Biotec | 130-090-858 | Voor de verwijdering van hematopoëtische cellen in fibroblastenculturen |
| CD117 Microbeads, muis | Miltenyi Biotec | 130-091-224 | Voor de verwijdering van hematopoëtische cellen in fibroblastenculturen |
| PheonixGP-cellen | ATCC | CRL-3215 | retrovirale pakketcellijn |
| EcoPAC-vector (pCL-Eco) | Novus Biologicals | NBP2-29540 | retrovirale helpervector met gag- en pol-genen |
| pMX-Gata1 | In lab gekloond | ||
| pMX-Tal1 | In lab gekloond | ||
| pMX-Lmo2 | In lab gekloond | ||
| pMX-cMyc | In lab gekloond | ||
| CellSens Standard 1.6-software | Cytospinanalysesoftware |
Referenties
- Sender, R., Fuchs, S., Milo, R. Are We Really Vastly Outnumbered? Revisiting the Ratio of Bacterial to Host Cells in Humans. Cell. 164 (3), 337-340 (2016).
- Lujan, E., Chanda, S., Ahlenius, H., Sudhof, T. C., Wernig, M. Direct conversion of mouse fibroblasts to self-renewing, tripotent neural precursor cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (7), 2527-2532 (2012).
- Szabo, E., et al. Direct conversion of human fibroblasts to multilineage blood progenitors. Nature. 468 (7323), 521-526 (2010).
- Pereira, C. F., et al. Induction of a hemogenic program in mouse fibroblasts. Cell Stem Cell. 13 (2), 205-218 (2013).
- Batta, K., Florkowska, M., Kouskoff, V., Lacaud, G. Direct reprogramming of murine fibroblasts to hematopoietic progenitor cells. Cell Reports. 9 (5), 1871-1884 (2014).
- Yu, B., et al. Reprogramming fibroblasts into bipotential hepatic stem cells by defined factors. Cell Stem Cell. 13 (3), 328-340 (2013).
- Hendry, C. E., et al. Direct transcriptional reprogramming of adult cells to embryonic nephron progenitors. Journal of the American Society of Nephrology. 24 (9), 1424-1434 (2013).
- Vierbuchen, T., Wernig, M. Direct lineage conversions: unnatural but useful. Nature Biotechnology. 29 (10), 892-907 (2011).
- Capellera-Garcia, S., Flygare, J. Direct lineage reprogramming: a useful addition to the blood cell research toolbox. Expert Review of Hematology. 10 (2), 107-109 (2017).
- Capellera-Garcia, S., et al. Defining the Minimal Factors Required for Erythropoiesis through Direct Lineage Conversion. Cell Reports. 15 (11), 2550-2562 (2016).
- Mahmoudi, S., Brunet, A. Aging and reprogramming: a two-way street. Current Opinions in Cellular Biology. 24 (6), 744-756 (2012).
- Singbrant, S., et al. Erythropoietin couples erythropoiesis, B-lymphopoiesis, and bone homeostasis within the bone marrow microenvironment. Blood. 117 (21), 5631-5642 (2011).
- Heinrich, A. C., Pelanda, R., Klingmuller, U. A mouse model for visualization and conditional mutations in the erythroid lineage. Blood. 104 (3), 659-666 (2004).
- Gautier, E. L., et al. Gene-expression profiles and transcriptional regulatory pathways that underlie the identity and diversity of mouse tissue macrophages. Nature Immunology. 13 (11), 1118-1128 (2012).
- Psaila, B., et al. Single-cell profiling of human megakaryocyte-erythroid progenitors identifies distinct megakaryocyte and erythroid differentiation pathways. Genome Biology. 17 (1), 83(2016).
- Pulecio, J., et al. Direct Conversion of Fibroblasts to Megakaryocyte Progenitors. Cell Reports. 17 (3), 671-683 (2016).
- Kurita, R., et al. Establishment of immortalized human erythroid progenitor cell lines able to produce enucleated red blood cells. PLoS One. 8 (3), 59890(2013).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
