Methodenartikel

De grootschalige productie van recombinante RNAs op een circulaire steiger met behulp van een systeem van Viroïde afkomstige in Escherichia coli

DOI:

10.3791/58472

⸱

30 november 2018

 ,  , 
1Instituto de Biología Molecular y Celular de Plantas, Consejo Superior de Investigaciones Científicas-Universitat Politècnica de València, Spain

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hier presenteren we een protocol voor de productie van grote hoeveelheden van recombinante RNA in Escherichia coli mede uitspreken een chimeer RNA waarin het RNA van belang in een Viroïde steiger en een plant tRNA ligase. Het hoofdproduct is een circulaire molecuul dat zuivering aan homogeniteit wordt vergemakkelijkt.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Met de toenemende belangstelling voor RNA biologie en het gebruik van de molecules van RNA in geavanceerde biotechnologische toepassingen, zijn de methoden voor de productie van grote hoeveelheden van recombinante RNAs beperkt. Hier beschrijven we een protocol voor de productie van grote hoeveelheden van recombinante RNA in Escherichia coli gebaseerd op co expressie van een chimeer molecuul waarin het RNA van belang in een Viroïde steiger en een plant tRNA ligase. Viroïden zijn relatief kleine, niet-coderende, zeer base-gepaarde circulaire RNAs die besmettelijk tot hogere planten zijn. De host plant tRNA ligase is een enzym gerekruteerd door viroïden die tot de familie Avsunviroidae, zoals aubergine latente Viroïde (ELVd), behoren om te bemiddelen RNA circularization tijdens Viroïde replicatie. Hoewel ELVd niet gerepliceerd in E. coli, een voorloper van de ELVd is efficiënt getranscribeerd door de E. coli RNA polymerase en verwerkt door de ribozymes van de ingesloten hammerhead in bacteriële cellen, en de resulterende monomeren zijn circularized door de Co uitgedrukt tRNA ligase een opmerkelijke concentratie bereiken. Het inbrengen van een RNA van belang in de ELVd steiger kan de productie van tientallen milligram van de recombinant RNA per liter bacteriecultuur in normale laboratoriumomstandigheden. Een belangrijke fractie van het RNA-product is circulaire, een functie die de reiniging van de recombinante RNA naar virtuele homogeniteit vergemakkelijkt. In dit protocol, wordt een complementaire DNA (cDNA) dat overeenkomt met het RNA van belang ingevoegd in een bepaalde stand van de ELVd cDNA in een plasmide expressie die wordt gebruikt, langs de plasmide uitspreken aubergine tRNA ligase, mede om te transformeren van E. coli. Co expressie van beide moleculen onder de controle van sterke constitutieve initiatiefnemers leidt tot de productie van grote hoeveelheden van de recombinante RNA. De recombinante RNA kan worden geëxtraheerd uit de bacteriële cellen en gescheiden van het merendeel van de bacteriële RNAs profiteren van haar cirkelvormigheid.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

In tegenstelling tot DNA en proteïnen zijn protocollen voor eenvoudige, efficiënte en rendabele productie van grote hoeveelheden van RNA niet overvloedig. Echter, onderzoek en industrie vraag steeds grotere hoeveelheden van deze biomoleculen te onderzoeken hun unieke biologische eigenschappen1, of om te worden gebruikt geavanceerde biotechnologische toepassingen, waaronder hun gebruik als zeer specifieke aptamers 2, therapeutische agenten3of selectieve pesticiden4. In vitro transcriptie en chemische synthese worden vaak gebruikt in onderzoek voor de productie van RNA. Deze methoden leiden echter tot belangrijke beperkingen wanneer grote hoeveelheden van de producten nodig zijn. De logische alternatief is het gebruik van de machines van de endogene transcriptie van levende cellen, gevolgd door een zuiveringsproces te scheiden van de RNAs van belang van de cellulaire metgezellen. Naar aanleiding van deze strategie, zijn methoden ontwikkeld voor de productie van recombinante RNAs in bacteriële cellen, zoals de lab-vriendelijke Escherichia coli5 of de marine paarse fototrofe alpha-proteobacterium Rhodovolum sulfidophilum 6. de meeste methoden voor de productie van recombinante RNA bij bacteriën is afhankelijk van de expressie van een inheemse zeer stabiele RNA steiger, zoals een tRNA of een rRNA, waarin RNA van belang is ingevoegd7. Dit legt de noodzaak van het vrijgeven van het RNA van belang uit het chimeer molecuul, als de aanwezigheid van extra RNA een probleem voor de downstream toepassingen8 is. Een ander concept in recombinant RNA biotechnologie is de productie van recombinante ribonucleoprotein complexen die mogelijk het gewenste product per se of gebruikt als een beschermende strategie om te verhogen de stabiliteit van het RNA van belang9, 10. Ook is de productie van circulaire RNAs ook voorgesteld als een strategie voor het genereren van meer stabiele producten11.

We hebben onlangs een nieuwe methode voor de productie van grote hoeveelheden van recombinante RNA in E. coli die deelneemt aan drie van de bovenstaande concepten ontwikkeld: de invoeging van het RNA van belang in een zeer stabiele cirkelvormige RNA steiger en de co uitdrukking van de recombinante RNA met een interactie eiwit waarschijnlijk tot een stabiele ribonucleoprotein complex dat zich in opmerkelijke bedragen in bacteriële ophoopt cellen12. In tegenstelling tot eerdere ontwikkelingen gebruikten we een volkomen vreemd is aan E. coli, namelijk een Viroïde RNA-steiger. Viroïden zijn een bijzonder soort infectieuze agentia van hogere planten die zijn uitsluitend gevormd door een relatief klein (246-401 nt) zeer base-gepaarde circulaire RNA13. Interessant, viroïden zijn niet-coderende RNAs en met geen hulp van hun eigen eiwitten, ze zijn in staat om het volledige complex besmettelijke cycli in de geïnfecteerde hosts14. Deze cycli opnemen de replicatie van RNA-RNA-in de kernen of chloroplasten, afhankelijk van de familie Viroïde —Pospiviroidae of Avsunviroidae, respectievelijk — verkeer via de besmette plant en -ontduiking van de defensieve reactie van de gastheer. Viroïden moeten worden gerangschikt onder de meest stabiele RNAs in de natuur, als gevolg van een naakte circulaire RNA en om te overleven in de vijandige omgeving van plantencellen besmet. Deze eigenschap kan maken viroïden bijzonder geschikt als steigers te stabiliseren recombinant RNA in biotechnologische benaderingen. Bovendien is de nieuwe methode gebaseerd op co uitdrukking van de Viroïde steiger met een interactie plantaardige eiwitten. Viroïden gerepliceerd via een mechanisme van de rolling-circle in welke host enzymen zijn gerekruteerd om te katalyseren van de verschillende stappen van het proces. Met name sommige viroïden, meer in het bijzonder degenen die tot de familie Avsunviroidae15 behoren, bevatten ribozymes die ook bij de replicatie zijn betrokken. Afhankelijk van de soort Viroïde, is transcriptie van Viroïde RNAs gemedieerd door de host RNA polymerase II of de chloroplastic nucleaire-gecodeerd RNA polymerase (NEP). Viroïde RNA verwerking lijkt te worden gekatalyseerd door een host type III RNase, hoewel in viroïden met ribozymes oligomere RNA tussenproducten zelf tijdens de replicatie klieven. Tot slot, de resulterende Viroïde monomeren zijn circularized, afhankelijk van de familie Viroïde door de host DNA ligase 1 of de chloroplastic isovorm van tRNA ligase16,17. Dit laatste enzym is betrokken bij Afbinding van de monomere vormen van de viroïden in de familie Avsunviroidae, zoals aubergine latente Viroïde (ELVd)18.

In de loop van een werk voor het analyseren van de volgorde en de structurele eisen van ELVd die bepalen van erkenning door de aubergine (Solanum melongena L.) tRNA ligase, wij stellen een experimenteel systeem gebaseerd op co expressie van beide moleculen in E. coli 19. Wij merkten dat langer-dan-unit ELVd afschriften zelf efficiënt in E. coli cellen via de ingesloten hammerhead ribozymes klieven en dat de resulterende Viroïde monomeren met 5'-hydroxyl en 2', 3'-phosphodiester termini efficiënt circularized door de mede uitgedrukt aubergine tRNA ligase. Sterker nog, bereikt de resulterende circulaire Viroïde RNA een onverwachte hoge concentraties in E. coli, dan die van de endogene rRNAs12. Afwezigheid van replicatie tussenproducten aangegeven gebrek ELVd RNA-RNA-amplificatie in deze bacteriële cellen. Interessant, had invoeging van heterologe RNAs in een bepaalde stand van het molecuul Viroïde een matig effect op de accumulatie van de circulaire Viroïde afkomstige RNAs12. Deze opmerkingen maakte ons voorzien van een methode om grote hoeveelheden recombinant RNAs in bacteriën produceren. Bij deze methode wordt de cDNAs overeenkomt met de RNAs van belang worden ingevoegd in de cDNA ELVd en de resulterende chimeer RNA wordt uitgedrukt in E. coli via een sterke constitutieve promotor. Voor het systeem te werken, moet de E. coli samen met een plasmide wil de aubergine tRNA ligase worden omgevormd. Het langer-dan-unit ELVd-afgeleide transcript is verwerkt door de ingesloten hammerhead ribozymes en de resulterende monomeren met de juiste termini zijn erkend en circularized door de mede uitgedrukt tRNA ligase. Op deze manier is de RNA van belang een zeer stabiele cirkelvormige steiger bestaande uit het Viroïde circulaire molecuul ingevoegd. Deze recombinante chimeer RNA is waarschijnlijk verder gestabiliseerd in de cellen van E. coli door vorming van een complexe door interactie met tRNA ligase ribonucleoprotein. Met behulp van deze methode (zie protocol hieronder), RNA aptamers, haarspeld RNAs en andere gestructureerde RNAs zijn gemakkelijk geproduceerd in hoeveelheden van tientallen milligram per liter voor E. coli cultuur in normale laboratoriumomstandigheden en gezuiverd tot homogeniteit nemen voordeel van cirkelvormigheid12.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. plasmide bouw

  1. Versterken door PCR (of omgekeerde transcriptie PCR als vanaf een sjabloon van RNA) overeenkomt met de RNA van belang gebruikend inleidingen met 5' extensie toe vergadering in de expressie plasmide cDNA. Om te voorkomen dat ongewenste mutaties, gebruikt u een hifi-polymerase van DNA.
    1. Als u wilt invoegen de cDNA in het plasmide expressie door Gibson vergadering20, de volgende 5' extensies toevoegen aan de PCR inleidingen: forward, 5'-tctccccctcccaggtactatccccttXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX-3'; omgekeerde, 5'-ccctcctagggaacacatccttgaXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX-3'; X vertegenwoordigt nucleotiden homoloog aan de terminal uiteinden van het RNA van belang.
    2. Incubeer gedurende 30 s bij 98 ° C, gevolgd door 30 cycli van 10 bij 98 ° C, 30 s s bij 55 ° C en 30 s bij 72 ° C, en een definitieve verlenging van 10 minuten bij 72 ° C.
  2. Digest 100 ng van plasmide pLELVd-BZB met 10 U van de type-IIS restrictie-enzym Bpi ik gedurende 1 uur bij 37 ° C in een 20 µL reactie in een 0,5 mL tube in buffer G (10 mM Tris-HCl, pH 7.5, 10 mM MgCl2, 50 mM NaCl BSA 0,1 mg/mL).
    Opmerking: Alle plasmiden zijn beschikbaar op verzoek aan de bijbehorende auteur. BPI Ik neerkomt op Bbs ik.
  3. De PCR en de spijsvertering producten van elkaar gescheiden door elektroforese in een 1% agarose gel in TAE-buffer (40 mM Tris, 20 mM azijnzuur, 1 mM EDTA, pH 7,2). Vlek de gel gedurende 15 minuten door het schudden in 200 mL van 0,5 µg/mL ethidiumbromide. Visualiseren van het DNA met behulp van een UV-transilluminator en de bands die overeenkomt met de versterkte cDNA en de Bpi ik-verteerd plasmide (2046 bp) met behulp van een scalpel mes snijd.
    Opmerking: BPI Ik vertering van pLELVd-BZB brengt ook een 528 bp product overeenkomt met de verslaggever van de blauw-wit LacZ.
  4. Elueer de ANI van de fragmenten van de gel met behulp van silica gel kolommen (gel DNA herstel kit in Tabel van materialen) en kwantificeren van de DNA-concentratie door spectrofotometrische analyse.
  5. Instellen van een Gibson vergadering reactie versterkte cDNA met het verteerd plasmide. Gebruik een 3-voudig molaire overmaat van invoegen versus vector20. Incubeer gedurende 1 uur bij 50 ° C en te zuiveren van de reactieproducten met behulp van een kolom silicagel (DNA schoon & concentrator kit in de Tabel van de materialen).
  6. Gebruik van de gezuiverde producten van de Gibson vergadering reactie op electroporate bevoegde E. coli DH5α cellen. Met behulp van 1-mm electroporation cuvettes, gelden de volgende instellingen: 1.500 V en 5 ms. Incubate gedurende 1 uur bij 37 ° C in super geoptimaliseerde bouillon met onderdrukking van de omzettingsproducten (SOC; 20 g/L trypton, 5 g/L gistextract, 0,5 g/L NaCl, 2,5 mM KCl, 10 mM MgCl2 20 mM glucose, pH 7,0) vloeistof en vervolgens verspreiding op Luria Bertani (LB; 10 g/L trypton, 5 g/L gistextract, 10 g/L NaCl) agar (1,5%) platen met 50 µg Mo/mL ampicilline.
    1. Om te screenen op kolonies overeenkomt met getransformeerde E. coli verspreid klonen die waarschijnlijk het invoegen, 15 min voordat de electroporated cellen, plating 30 µL van 50 mg/mL 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside (X-gal) in dimethylformamide. Incubeer de platen 's nachts bij 37 ° C.
  7. Kies verschillende witte kolonies en 's nachts groeien bij 37 ° C in vloeibare LB-media. Zuiveren plasmiden met behulp van een miniprep kit (Zie Tabel van materialen) en analyseren van hun maten door elektroforese in een 1% agarose gel in TAE-buffer.
  8. De meest waarschijnlijke recombinante plasmide gebaseerd op elektroforetische migratie ten opzichte van het pLELVd-BZB-besturingselement selecteren De volgorde van de geselecteerde plasmide bevestigen door sequentiebepaling met behulp van primers 5'-CCTTTTTCAATATTATTGAAGC-3' en 5'-GATGCTCGTCAGGGGGGCGGAG-3' dat de gehele expressie cassette in pLELVd-BZB flank.
    Opmerking: Vergeet niet dat deze plasmide bevat een 528 bp polylinker met de markering van de LacZ, die is vervangen door de cDNA van belang. Beperking toewijzing kan helpen om te kiezen van de juiste recombinante plasmiden.

2. RNA expressie

  1. Co-electroporate (zie voorwaarden in 1.6) de geselecteerde E. coli stam (E. coli BL21 of een BL21-derivaat) met de pLELVd-BZB-derivaat, dat overeenkomt met het RNA van belang en plasmide p15LtRnlSm mede uitspreken cDNA bevat de aubergine tRNA ligase. Gebruik de E. coli HT115(DE3), die RNase III21 mist, uitspreken RNAs met lange double-stranded regio's.
    Opmerking: Zowel de RNA van belang en het tRNA ligase mRNA worden getranscribeerd door de RNA-polymerase van E. coli . Geen DE3 lysogen aan uitdrukkelijke T7 RNA-polymerase is vereist in de E. coli -stam, hoewel de aanwezigheid van deze lysogen geen schadelijke effecten heeft.
  2. Na 1 uur incubatie bij 37 ° C in SOC opgietvloeistof, plaat electroporated bacteriën op stevige middellange LB met 50 µg Mo/mL ampicilline en 34 µg/mL chlooramfenicol. Na een nacht bebroeden bij 37 ° C.
  3. Kies een kolonie en enten van een 1 L verbijsterd erlenmeyerkolf met 250 mL van vloeibare geweldig Bouillon (TB)-medium (12 g/L trypton, 24 g/L gist extract, 0,4% glycerol, 0,17 M KH2PO4en 0,72 M K2HPO4), met 50 µg Mo/mL ampicilline en 34 µg/mL chlooramfenicol. Incubeer bij 37 ° C met krachtig schudden 180 omwentelingen per minuut (rpm). Oogst bacteriën tussen 12 en 16 h na inoculatie van de cultuur.

3. RNA extractie en zuivering

  1. Voor analytische doeleinden, nemen 2 mL aliquots van de cultuur op de gewenste tijdstippen en centrifugeer bij 14.000 x g gedurende 2 min. negeren het supernatant en resuspendeer de cellen in 50 µL van TE buffer (10 mM Tris-HCl, pH 8,0 en 1 mM EDTA) door vortexing.
    1. Toevoegen van één volume (50 µL) van een 1:1 (v/v) mix van fenol (verzadigd met water en geëquilibreerd op pH 8,0 met Tris-HCl, pH 8,0) en chloroform. Breek de cellen door krachtige vortexing en scheiden de waterige en biologische fasen door centrifugeren voor 5 min op 14.000 x g.
    2. Zorgvuldig herstellen de waterige fase (bovenste) waarin de totale bacteriële RNA.
      Opmerking: Voorbereidingen kunnen worden opgeslagen bij-20 ° C voor latere analyse.
  2. Voor de doeleinden van het voorbereidende, giet u cultuur in een centrifuge-flacon 250 mL en spin down cellen bij 14.000 x g gedurende 10 min. Discard supernatant. Het wassen van de cellen door resuspending in 30 mL water. Overbrengen in een centrifugebuis en spin down cellen opnieuw onder dezelfde voorwaarden.
  3. Verwijder het supernatant en resuspendeer de cellen in 10 mL chromatografie buffer (50 mM Tris-HCl, pH 6,5, 150 mM NaCl, 0,2 mM EDTA) door vortexing.
    Opmerking: Op dit moment kunnen de cellen worden bevroren bij-20 ° C om door te gaan met de zuivering op elk andere moment.
  4. Cellen met behulp van een verse of ontdooide bacteriële voorbereiding, breken door toevoeging van 1 deel (10 mL) van fenol: chloroform (zie stap 3.2) en vortexing krachtig.
  5. Centrifugeer gedurende 10 min op 12.000 x g, de waterfase te herstellen en opnieuw uitpakken met 1 volume (10 mL) van chloroform onder dezelfde voorwaarden.
    Opmerking: De voorbereiding van het RNA kan worden achtergelaten bij-20 ° C op dit punt.
  6. Verder zuiveren totale bacteriële RNA door anion-uitwisseling chromatografie. De voorbereiding van het RNA door een 45 µm spuit filter en belasting op een 1 mL diethylethanolamine (DEAE) kolom te filteren.
    1. Voor de zuivering van de chromatografie, gebruik van een vloeibare chromatografie-systeem op een debiet van 1 mL/min. Equilibreer voordat monster laden, de kolom met 10 mL van chromatografie buffer (zie stap 3.3 voor samenstelling).
    2. Laden van het monster en was de kolom met 10 mL van chromatografie buffer. RNA Elueer met 20 mL elutie buffer (50 mM Tris-HCl, pH 6,5, 1 M NaCl, 0,2 mM EDTA) en verzamelen van 1 mL aliquots.
      Opmerking: RNA GC snel in de eerste breuken. De kolom kan opnieuw worden gebruikt voor verdere zuivering. Daarvoor was de kolom met 10 mL water en bewaren bij 4 ° C in de 20% ethanol.
  7. Aangezien een groot deel van de recombinant die RNA in E. coli in een ronde vorm accumuleert, kan deze eigenschap voor zuivering aan homogeniteit12worden geprofiteerd. Circulaire RNAs van de lineaire tegenhangers scheiden door twee-dimensionale polyacrylamide-gelelektroforese (2D pagina) combinatie van niet-denaturering en denaturering (8 M ureum) voorwaarden12,22.

4. RNA analyse

  1. Bereiden van een 5% polyacrylamide-gel (37.5:1 acrylamyde:N, N'- methylenebisacrylamide, massaverhouding) in TBE buffer (89 mM Tris, boorzuur 89 mM, 2 mM EDTA) met 8 M ureum.
  2. Mix 20 µL van RNA-preparaten met 1 deel (20 µL) van het laden van de buffer (98% formamide, 10 mM Tris-HCl, pH 8,0, 1 mM EDTA, 0.0025% bromophenol blauw en 0.0025% xyleen cyanol), Incubeer gedurende 1,5 min bij 95 ° C in een blok van Verwarming, en snap cool op ijs.
  3. De monsters in het polyacrylamidegel laden en draaien de elektroforese op passende voorwaarden afhankelijk van de afmetingen van de gel (bijvoorbeelduitvoeren van 140 x 130 x 2 mm gels voor 2,5 h bij 200 V). Vlekken van de gel gedurende 15 min. in 0,5 µg/mL ethidiumbromide, wassen met water en visualiseren van RNA onder UV-licht.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het RNA van belang is voor de productie van recombinant RNA in E. coli met behulp van de ELVd-afgeleide systeem12, een steiger ELVd RNA geënt. Deze chimeer RNA is mede uitgedrukt langs de aubergine tRNA ligase in E. coli. Zodra verwerkt, gekloofd en circularized, vormt het chimeer circulaire RNA, waaruit de RNA van belang steekt, waarschijnlijk een complex met de mede uitgedrukt aubergine enzym dat opmerkelijke concentratie in de bacteriële cellen...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hoewel het onderzoek naar de ELVd volgorde en structuur eisen die betrokken zijn bij de erkenning door de aubergine tRNA ligase, merkten we dat mede expressie van beide moleculen in de niet-host E. coli leidde tot een onverwachte grote opeenstapeling van Viroïde circulaire formulieren in bacteriecellen19. We begrepen dat de grote opeenstapeling van Viroïde RNA in E. coli waarschijnlijk het gevolg was van mede uiting van een zeer stabiele RNA-molecuul, zoals de relatief kleine (33...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs verklaren dat de technologie die wordt beschreven in dit protocol is gepatenteerd (ons Patent Nr. EP14382177.5, PCT/EP2015/060912).

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit werk werd gesteund door subsidies BIO2017-83184-R en BIO2017-91865-EXP uit de Spaanse Ministerio de Ciencia, Innovación y Universidades (medegefinancierd FEDER-fondsen).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Phusion High-Fidelity DNA polymeraseThermo ScientificF530S
Bpi IThermo ScientificER1011
AgaroseConda8010D1 low EEO
TrisPanReac AppliChemA1086,1000
Acetic acidPanReac AppliChem131008.1214
EDTASigma-AldrichE5134-500G
Ethidium bromidePanReac AppliChemA1152,00251%
Zymoclean Gel DNA RecoveryZymo ResearchD4001
NanoDropThermoFisher ScientificND-3300
NEBuilder HiFi DNA Assembly Master MixNew England BioLabsE2621S
DNA Clean & ConcentratorZymo ResearchD4003
EporatorEppendorf4309000019
Escherichia coli DH5αInvitrogen18265-017
TryptoneIntron BiotechnologyBa2014
Yeast extractIntron Biotechnology48045
NaClPanReac AppliChem131659.1211
AgarIntron Biotechnology25999
AmpicillinPanReac AppliChemA0839,0010
X-galDuchefaX1402.1000
N,N-DimethylformamidePanReac AppliChem131785.1611
NucloSpin PlasmidMacherey-Nagel22740588.250
Escherichia coli BL21(DE3)Novagen69387-3
Escherichia coli HT115(DE3)Ref. Timmons et al., 2001
ChloramphenicolDuchefaC 0113.0025
GlycerolPanReac AppliChem122329.121187%
KH2PO4PanReac AppliChem131509.1210
K2HPO4PanReac AppliChem122333.1211
HClPanReac AppliChem131020.1211
PhenolScharlauFE0479100090%
ChloroformPanReac AppliChemA3691,1000
Filtropur S 0.2Sarstedt83.1826.001
HiTrap DEAE Sepharose FF columnGE Healthcare Life Sciences17-5055-01
ÄKTAprime plus liquid chromatography systemGE Healthcare Life Sciences11001313
AcrylamydePanReac AppliChemA1089,10002K
N,N’-methylenebisacrylamideSigma-AldrichM7279-100G
UreaPanReac AppliChem146392.1211
Boric acidPanReac AppliChemA2940,1000
FormamidePanReac AppliChemA0937,2500
Bromophenol blueSigma-AldrichB8026-5G
Xylene cyanolSigma-AldrichX4126-10G
N,N′-Bis(acryloyl)cystamineSigma-AldrichA4929-5G

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Wang, J., et al. Current Research on Non-Coding Ribonucleic Acid (RNA). Genes. 8 (12), (2017).
  2. Hamada, M. In silico approaches to RNA aptamer design. Biochimie. 145, 8-14 (2018).
  3. Bobbin, M. L., Rossi, J. J. RNA Interference (RNAi)-Based Therapeutics: Delivering on the Promise? Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 56, 103-122 (2016).
  4. Airs, P. M., Bartholomay, L. C. RNA Interference for Mosquito and Mosquito-Borne Disease Control. Insects. 8 (1), 4(2017).
  5. Ponchon, L., Dardel, F. Large scale expression and purification of recombinant RNA in Escherichia coli. Methods. 54 (2), 267-273 (2011).
  6. Kikuchi, Y., Umekage, S. Extracellular nucleic acids of the marine bacterium Rhodovulum sulfidophilum and recombinant RNA production technology using bacteria. FEMS Microbiology Letters. 365 (3), fnx268(2018).
  7. Ponchon, L., Dardel, F. Recombinant RNA technology: the tRNA scaffold. Nature Methods. 4 (7), 571-576 (2007).
  8. Batey, R. T. Advances in methods for native expression and purification of RNA for structural studies. Current Opinion in Structural Biology. 26, 1-8 (2014).
  9. El Khouri, M., et al. Expression and Purification of RNA-Protein Complexes in Escherichia coli. Methods in Molecular Biology. 1316, 25-31 (2015).
  10. Ponchon, L., et al. Co-expression of RNA-protein complexes in Escherichia coli and applications to RNA biology. Nucleic Acids Research. 41 (15), e150(2013).
  11. Umekage, S., Kikuchi, Y. In vitro and in vivo production and purification of circular RNA aptamer. Journal of Biotechnology. 139 (4), 265-272 (2009).
  12. Daròs, J. -A., Aragonés, V., Cordero, T. A viroid-derived system to produce large amounts of recombinant RNA in Escherichia coli. Scientific Reports. 8 (1), 1904(1904).
  13. Daròs, J. A. Viroids: small noncoding infectious RNAs with the remakable ability of autonomous replication. Current Research Topics in Plant Virology. , Springer International Publishing Switzerland. 295-322 (2016).
  14. Flores, R., Hernández, C., Martínez de Alba, A. E., Daròs, J. A., Di Serio, F. Viroids and viroid-host interactions. Annual Review of Phytopathology. 43, 117-139 (2005).
  15. Di Serio, F., et al. ICTV Virus Taxonomy Profile: Avsunviroidae. The Journal of General Virology. 99 (5), 611-612 (2018).
  16. Nohales, M. A., Flores, R., Daròs, J. A. Viroid RNA redirects host DNA ligase 1 to act as an RNA ligase. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (34), 13805-13810 (2012).
  17. Nohales, M. A., Molina-Serrano, D., Flores, R., Daròs, J. A. Involvement of the chloroplastic isoform of tRNA ligase in the replication of viroids belonging to the family Avsunviroidae. Journal of Virology. 86 (15), 8269-8276 (2012).
  18. Daròs, J. A. Eggplant latent viroid: a friendly experimental system in the family Avsunviroidae. Molecular Plant Pathology. 17 (8), 1170-1177 (2016).
  19. Cordero, T., Ortolà, B., Daròs, J. A. Mutational Analysis of Eggplant Latent Viroid RNA Circularization by the Eggplant tRNA Ligase in Escherichia coli. Frontiers in Microbiology. 9 (635), (2018).
  20. Gibson, D. G., et al. Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases. Nature Methods. 6 (5), 343-345 (2009).
  21. Timmons, L., Court, D. L., Fire, A. Ingestion of bacterially expressed dsRNAs can produce specific and potent genetic interference in Caenorhabditis elegans. Gene. 263 (1-2), 103-112 (2001).
  22. Schumacher, J., Randles, J. W., Riesner, D. A two-dimensional electrophoretic technique for the detection of circular viroids and virusoids. Analytical Biochemistry. 135 (2), 288-295 (1983).
  23. Hansen, J. N., Pheiffer, B. H., Boehnert, J. A. Chemical and electrophoretic properties of solubilizable disulfide gels. Analytical Biochemistry. 105 (1), 192-201 (1980).
  24. Giguère, T., Adkar-Purushothama, C. R., Bolduc, F., Perreault, J. P. Elucidation of the structures of all members of the Avsunviroidae family. Molecular Plant Pathology. 15 (8), 767-779 (2014).
  25. López-Carrasco, A., et al. The transcription initiation sites of eggplant latent viroid strands map within distinct motifs in their in vivo RNA conformations. RNA Biology. 13 (1), 83-97 (2016).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Productie van recombinant RNAexpressie in Escherichia coliviro d scaffold systeemzuivering van circulair RNAco expressie van tRNA ligaseplasmidconstructiegelelektroforesechromatografische zuiveringtweedimensionale PAGEanionenuitwisselingschromatografie

Gerelateerde artikelen