Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Gecombineerde genetische en chemische Eiwitmantel wijzigingen van genenoverdracht Adenovirus gebaseerde vectoren voor afscherming en Targeting

8.2K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/58480

⸱

26 oktober 2018

 ,  , 
1Center of Biomedical Education and Research, University Witten/Herdecke

In dit artikel

Samenvatting

Het protocol hier beschreven kan onderzoekers specifiek adenovirus capsids op geselecteerde locaties wijzigen door eenvoudige chemie. Afgeschermde adenovirus vectoren deeltjes retargeted gene transfer vectoren kunnen worden gegenereerd en vector-gastheer interacties kunnen worden bestudeerd.

Samenvatting

Adenovirus vectoren zijn krachtige hulpmiddelen voor genetische vaccinatie en oncolytische een. Nochtans, zijn zij gevoelig voor meerdere ongewenste vector-gastheer interacties, vooral na in vivo levering. Het is een consensus dat de beperkingen opgelegd door ongewenste vector-gastheer interacties kunnen alleen worden overwonnen als gedefinieerde wijzigingen van het oppervlak van de vector worden uitgevoerd. Deze wijzigingen omvatten afscherming van de deeltjes van ongewenste interacties en gericht op de invoering van nieuwe liganden. Het doel van het hier gepresenteerde protocol is om de lezer te genereren afgeschermd en, indien gewenst, retargeted menselijke adenovirus gene transfer vectoren of oncolytische virussen. Het protocol kunnen onderzoekers het wijzigen van het oppervlak van een adenovirus vector capsids door specifieke chemische bevestiging van synthetische polymeren, koolhydraten, lipiden of andere biologische of chemische wordt. Het beschrijft de cutting-edge technologie van wijzigingen van de gecombineerde genetische en chemische Eiwitmantel, die is gebleken om het begrip en het overwinnen van belemmeringen voor in vivo levering van adenovirus vectoren. Een gedetailleerde en becommentarieerde beschrijving van de essentiële stappen voor het uitvoeren van specifieke chemische reacties met biologisch actieve virussen of virus afkomstige vectoren is gegeven. De technologie wordt beschreven in het protocol is gebaseerd op de genetische invoering van (natuurlijk afwezig) cysteïne residuen in oplosmiddel-blootgesteld lusjes van adenovirus afkomstige vectoren. Deze residuen van cysteïne bieden een specifieke chemische reactiviteit die na de productie van de vectoren aan hoge titers voor zeer specifieke en efficiënte covalente chemische koppeling van moleculen van een breed scala aan stof klassen naar de vector kan worden benut deeltjes. Nog belangrijker is, kan dit protocol gemakkelijk worden aangepast voor het uitvoeren van een breed scala aan verschillende (niet thiol-gebaseerde) chemische wijzigingen van adenovirus vector capsids. Tot slot, het is waarschijnlijk dat niet-gehuld virus gebaseerde gene transfer vectoren andere dan adenovirus kan worden gewijzigd vanuit de basis van dit protocol.

Inleiding

Adenovirussen (Ad), leden van de familie adenovirussen, zijn niet-gehuld DNA-virussen die meer dan 70 soorten hebben tot dusver geïdentificeerd (http://hadvwg.gmu.edu). Afhankelijk van de hemaglutination eigenschappen, genoom structuur en volgorde resultaten, kunnen de 70 advertentietypen worden onderverdeeld in zeven soorten (menselijke adenovirussen A tot G)1,2. Het menselijk genoom van de advertentie is 38 kb in grootte en ingekapseld door een icosahedrale nucleocapside-3. Wegens hun overvloed, worden de Eiwitmantel eiwit hexon penton base en de vezels allemaal aangeduid als grote Eiwitmantel eiwitten. De meest overvloedige en grootste Eiwitmantel eiwit hexon vormt 20 Eiwitmantel facetten, elk bestaande uit 12 hexon homotrimers4,5. Penton, gelegen aan elke icosahedrale rand (vertex), bestaat uit pentamers voor een penton base en vertegenwoordigt de basis voor de Prikker hoekpunt dat is gebouwd van geglycosyleerde vezel trimeren5,6. De inheemse Ad cel invoeren bestaat in principe uit twee hoofdstappen. Eerst bindt de knop vezel aan de primaire receptor. In advertentietypen van soorten A, C, E en F is dit de coxsackie en adenovirus receptor (CAR). Deze interactie brengt het virion in ruimtelijke nabijheid van het celoppervlak, teneinde interacties tussen cellulaire verschijnsel en RGD-motief in de penton basis en bijgevolg inducerend cellulaire reacties. Ten tweede, veranderingen in het cytoskelet leiden tot internalisering van het virion en het transport naar de endosome7. Bij gedeeltelijke demontage in de endosome, het virion wordt vrijgegeven naar het cytoplasma und uiteindelijk reist naar de kern voor replicatie.

Terwijl Ad kan lokaal worden afgeleverd (bv., voor genetische vaccinatie), systemische levering via de bloedbaan zoals vereist voor het onco-een geconfronteerd met verschillende belemmeringen. Terwijl die in de bloedbaan circuleren, tegenkomen ingespoten virionen het verdedigingssysteem van immuunsysteem van de gastheer, leidt tot snelle neutralisatie van de vectoren virus gebaseerde en rendering van vectoren gebaseerde Ad uiterst inefficiënt in systemische toepassingen. Bovendien is de natuurlijke hepatotropism van Ad interfereert met systemische levering en Ad omleiden naar haar nieuwe doelcellen moet worden opgelost.

Germline-gecodeerde natuurlijke IgM antilichamen van het aangeboren immuunsysteem snel herkennen en zeer repetitieve structuren te binden op het oppervlak van het virion8,9. Deze immuuncomplexen activeren dan de klassieke en niet-klassieke routes van het complementsysteem, wat leidt tot snelle aanvulling-bemiddelde neutralisatie van een groot deel van de virionen8. Een tweede weg, wat resulteert in grote verwijdering van Ad virionen is bemiddeld door macrofagen,10 en gekoppeld aan acuut toxisch en hemodynamische bijwerkingen11,12. In het geval van Ad in het bijzonder elimineren Kupffer cellen die woonachtig zijn in de lever bindt aan en phagocytically nemen de Ad virionen via specifieke scavenger receptoren, waardoor hen uit het bloed13,14,15 . Specifieke scavenger receptoren zijn ook geïdentificeerd op sinusvormige endotheliale cellen van de lever (LSE cellen)16, en LSE cellen lijken ook om bij te dragen aan vector eliminatie17, maar aan in welke mate moet nog worden verduidelijkt. Bovendien, sommige advertentietypen en hun afgeleide vectoren zijn efficiënt afgezonderd door menselijke erytrocyten18 waarnaar zij via auto of de aanvulling receptor CR119 binden. Van de nota, dit sequestering mechanisme kan niet worden bestudeerd in de muis modelsysteem zoals contrast en menselijke erythrocyten, muis erytrocyten doen niet auto express.

Specifieke anti-Ad antilichamen gegenereerd door het adaptieve immuunsysteem na blootstelling aan Ad hetzij als gevolg van eerdere infecties met Ad of na de eerste levering in systemische toepassingen verhogen een verdere belemmering voor effectief gebruik van Ad vectoren, en zij moeten worden omzeild in efficiënte systemische levering.

Tot slot, de sterke hepatotropism van sommige advertentietypen (inclusief Ad5) ernstig belemmert toepassing van Ad in systemische therapie. Dit resulteert in hepatocyte transductie tropisme is te wijten aan de hoge affiniteit van het virion Ad aan bloed stollingsfactor X (FX), gemedieerd door de interactie van FX met de Ad hexon eiwit20,21,22. FX overbrugt het virion aan heparine sulfaat glycanen (HSPGs) op het oppervlak van hepatocyten20,23,24,25. Een cruciale factor voor deze interactie lijkt te zijn van de specifieke omvang van N - en O-sulfation van de HSPGs in cellen van de lever24, die verschilt van HSPGs op andere celtypes. Naast dit FX-gemedieerde traject suggereren recente studies verdere trajecten nog niet geïdentificeerd die resulteren in Ad transductie van hepatocyten26,27,28.

Onlangs, het heeft aangetoond dat FX niet alleen bij hepatocyte transductie van Ad betrokken is, maar ook door bindende, het virion het virus deeltje tegen neutralisatie beschermt door de aanvulling systeem26. Vermindering van de hepatocyte transductie doordat FX bindende, daarom zou maken het ongewenste neveneffect van toenemende Ad neutralisatie via het aangeboren immuunsysteem.

Een grondige kennis van de complexe interacties tussen vectoren en gastheerorganismen daarom moeten ontwikkelen van efficiëntere vectoren voor systemische toepassingen die het omzeilen van de belemmeringen van de host organisme oplegt.

Een strategie die oorspronkelijk werd gebruikt voor therapeutische proteïnen is aangepast voor Ad vectoren om op zijn minst gedeeltelijk de hierboven beschreven belemmeringen zijn. Antigenicity en immunogeniciteit van therapeutische eiwitten verbindingen kunnen worden verminderd door te koppelen aan polyethyleenglycol (PEG)29,30. Vandaar, de covalente koppeling van polymeren zoals PEG of poly [N-(2-hydroxypropyl) methacrylamid] (pHPMA) naar de Eiwitmantel oppervlak beschermt de vector van ongewenste vector-gastheer interacties. Algemeen, richt polymeer koppeling ε-amine groepen uit lysine kant residuen die zijn willekeurig verspreid op het oppervlak Eiwitmantel. Vector deeltjes in oplossing zijn, het hydrofiele karakter van de bijgevoegde polymeren, omringd door een stabiele water-shell die het risico van immuun cel erkenning of enzymatische degradatie vermindert. Bovendien bleken gepegyleerde Ad vectoren te onttrekken aan neutralisatie door anti-hexon antilichamen in vitro en in pre geïmmuniseerde muizen in vivo31. In tegenstelling tot genetische Eiwitmantel wijzigingen, wordt chemische koppeling van polymeren uitgevoerd na de productie en zuivering, waardoor niet alleen voor het gebruik van conventionele producent cellen en productie van hoge titer vector bestanden, maar ook voor gelijktijdige wijziging van duizenden aminozuren aan het oppervlak Eiwitmantel. Echter, amine geleide afscherming gebeurt willekeurig gedurende de hele Eiwitmantel oppervlakte, wat resulteert in hoge heterogeniteiten en niet toe te staan voor wijziging van specifieke capsomers. Bovendien schaden de grote polymeer wordt vereist voor gunstige effecten virus topicale32.

Het overwinnen van deze beperkingen, de Kreppel et al. 33 introduceerde het concept van een genetischgemodificeerdeorganismen-chemische voor vector re - en -targeting. Cysteines werden genetisch binnengebracht op het virus Eiwitmantel op oplosmiddel-blootgesteld zoals vezel HI-lus33, eiwit IX34en hexon35,36posities. Hoewel niet natuurlijk voorkomende, cysteïne-bevattende Ad vectoren kunnen worden geproduceerd op hoge titers in cellen van normale producent. Belangrijker, zorgt invoeging van cysteines in bepaalde capsomers en in verschillende posities binnen een enkele capsomer voor zeer specifieke wijzigingen van thiol groep-reactieve wordt. Deze aanpak van genetischgemodificeerdeorganismen-chemische heeft aangetoond dat overwonnen tal van obstakels in het ontwerp van de vector van Ad. De combinatie van amine gebaseerde PEGylation voor detargeting en thiol gebaseerde koppeling van transferrine aan de knop van de vezel die Hi-lus is bewezen om succesvol retarget gewijzigd Ad vectoren auto-deficiënte cellen33. Aangezien hexon betrokken is bij de meest ongewenste interacties (neutraliserende antilichamen, bloed stollingsfactor FX), werden thiol gebaseerde wijziging strategieën ook toegepast op hexon. Kleine PEG wordt koppelen aan HVR5 van hexon voorkomen Ad vector deeltjes te transduce SKOV-3 cellen in aanwezigheid van FX, overwegende dat grote PEG wordt verhoogd hepatocyte transductie14,35. AD vector deeltjes uitvoering van mutaties in de knop van de vezel remming van auto bindende en HVR7 remmende binding van FX (en lager ingevoegd cysteines in HVR1 voor positie-specifieke PEGylation) bleken te onttrekken aan antilichaam - en aanvulling-bemiddelde neutralisatie, evenals scavenger receptor-gemedieerde opname zonder verlies van infectiviteit. Interessant, ondanks een gebrek aan het natuurlijke FX-schild verbeterd PEGylation opnieuw transductie van hepatocyten als een functie van PEG size36. Echter werd aangetoond dat covalente afscherming een impact op intracellulaire mensenhandel processen heeft. Pril et al. ten opzichte van onomkeerbare versus bioresponsive shields op basis van pHPMA en aangetoond dat noch de modus afscherming noch co-polymeer kosteloos een impact gehad op cel invoeren maar beïnvloedde deeltje mensenhandel aan de kern. Dienst van een bioresponsive schild met positief geladen pHPMA co polymeren waarbinnen deeltje mensenhandel aan de kern, handhaving van de efficiëntie van de hoge transductie van Ad vectoren in vitro en in vivo37.

Kortom, deze gegevens wijzen erop dat, zelfs in de veronderstelling dat alle vector-gastheer-interacties waren bekend en overwogen, buitensporige Eiwitmantel oppervlakte wijzigingen nodig zijn om te overwinnen van de hindernissen systemische vector levering is gekoppeld.

Hier bieden we een protocol voor het uitvoeren van specifieke chemische wijzigingen van adenovirus vector capsids voor afscherming en/of kredietherschikking van adenovirus vector deeltjes en adenovirus gebaseerde oncolytische virussen. Het concept van deze technologie is uiteengezet in Figuur 1. Het staat de afscherming van bepaalde regio's van Eiwitmantel van ongewenste interacties door covalente gehechtheid van synthetische polymeren. Tegelijkertijd biedt het ook een middel om te hechten liganden en combineren van afscherming en targeting. Met behulp van eenvoudige chemie, zal onderzoekers zitten kundig voor covalent wijzigen adenovirus vector oppervlak met een breed scala aan moleculen met inbegrip van peptiden/eiwitten, koolhydraten, lipiden en andere kleine moleculen. Het protocol biedt bovendien een algemeen concept voor de chemische modificatie van biologisch actieve virus afkomstige vectoren onder handhaving van hun biologische integriteit en activiteit.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Opmerking: In de volgende, een protocol voor genetischgemodificeerdeorganismen-chemische PEGylation van een advertentie vector voor detail wordt beschreven. Teneinde specifieke koppeling van de PEG-groep, een vector AD5-post was van tevoren genetisch gewijzigd door invoering van een cysteine residu in de hexon eiwit op de hypervariable-lus 5 zoals beschreven in een eerdere publicatie36, en een maleimide-geactiveerde PEG compound wordt gebruikt als koppeling samengestelde.

1. bereiding van Buffers voor Vector zuivering door CsCL stap gradiënten

  1. Bereiden van 400 mL Adenovirus buffer (Ad-buffer) door toevoeging van 50 mM HEPES (4.76 g/400 mL) en 150 mM NaCl (3.504 g/400 mL) tot tweemaal gedestilleerd water (ddH2van O). 350 mL van deze buffer is nodig ter voorbereiding van de volgende drie varianten van de Ad-buffer.
    1. Variant A: aanpassen 150 mL van Ad-buffer, pH 7,6 met NaOH.
    2. Variant B: een eindconcentratie van 10 mM TCEP [tris(2-carboxyethyl)phosphine), 0.143 g] toevoegen aan 50 mL en aanpassen aan pH 7,2 met HCl.
    3. Variant C: een eindconcentratie van 0.5 mM TCEP (0.022 g) 150 ml toevoegen en aanpassen aan pH 7,2 met HCl.
    4. Voorbereiden van de buffers in ddH2O en p.a. chemicaliën. 100 mL elke variant A variant C te bereiden de CsCl buffers te gebruiken (Zie stappen 1.2 en 1.3; 50 mL van elk) noodzakelijk voor de CsCl stap kleurovergangen (Zie stappen 3.2.6. en 3.2.18).
  2. Voorbereiding van de CsCl stap kleurovergang buffer (ρCsCl = 1.41 g/cm3) in Ad-buffer
    Opmerking: Deze buffer nodig zullen zijn in twee verschillende varianten:
    1. Weeg twee aliquots van precies 27.42 g CsCl in 50 mL buizen.
    2. ΡCsCl = 1.41/TCEP buffer: lossen CsCl in 40 mL variant C van Ad-buffer.
    3. ΡCsCl = 1.41 buffer: lossen CsCl in 40 mL variant A van Ad-buffer.
    4. Controleer en pas indien nodig de pH met HCl. Vul aan met de bijbehorende advertentie-buffer variant precies 50 mL. Om te bereiken de beste resultaten van de scheiding, zijn de exacte CsCl concentratie en pH cruciaal.
    5. Controleer de dichtheid (CsCl inhoud) door weging van 1 mL (1.41 g) van elke kleurovergang buffer.
  3. Voorbereiding van de CsCl stap kleurovergang buffer (ρCsCl = 1,27 g/cm3) in Ad-buffer
    Opmerking: Deze buffer nodig is in twee verschillende varianten:
    1. Weeg twee aliquots van precies 18.46 g CsCl in 50 mL tubes.
    2. ΡCsCl = 1,27/TCEP buffer: lossen CsCl in 40 mL variant C van Ad-buffer.
    3. ΡCsCl = 1,27 buffer: lossen CsCl in 40 mL variant A van Ad-buffer.
    4. Controleer en pas indien nodig de pH met HCl. Ten slotte, vul aan tot precies 50 mL met de corresponderende Ad-buffer variant. Om te bereiken de beste resultaten van de scheiding, zijn de exacte CsCl concentratie en pH cruciaal.
    5. Controleer de dichtheid (CsCl inhoud) door weging van 1 mL (1,27 g) van elke kleurovergang buffer.
  4. Alle buffers (Ad-buffers en CsCl stap kleurovergang buffers) door filtratie (met behulp van 0,45 µm porie maaswijdte) in steriele flessen steriliseren.
  5. Na sterilisatie, Voorkom oxidatie van TCEP en verzadigen en bedekken de buffers bevattende TCEP met argon sparging de buffers met argon gas voor ongeveer 30 s. Zorg alleen gebruik van steriele hulpmiddelen (bv., steriele Pipetteer tips) bij de toepassing van het argon gas en gebruik flessen groot genoeg is om te laten argon spek.
    Opmerking: Alle buffers moet bereid zijn fris en beschermd tegen licht en kan worden achtergelaten bij 4 ° C voor meerdere dagen (met name de CsCl stap kleurovergang buffers die alleen zouden moeten worden gehouden voor een paar dagen).

2. koppeling wordt: Bewaren en bereiden

Opmerking: Moeities gebruikt voor koppeling aan cysteines moeten thiol-reactieve groepen. Maleimide-geactiveerde verbindingen zullen vormen stabiele thioether obligaties met de genetisch geïntroduceerde cysteines. Als alternatief, ortho-pyridyldisulfide (OPSS)-geactiveerde verbindingen kunnen worden gebruikt, die bioresponsive disulfide bruggen tussen de deeltjes van de vector en de koppeling groep vormen. Gelyofiliseerd malPEG-750, evenals de meeste andere koppeling reagentia zijn gevoelig voor hydrolyse en moeten worden opgeslagen droog in de vorm van gelyofiliseerd poeders bij-80 ° C.

  1. Om te voorkomen dat de opbouw van het water bij het ontdooien van de flesjes condenserend, bewaar de flesjes in grotere buizen (bv., 50 mL tubes) gevuld met een kussen van silica gel kralen. Bewaar deze buizen in een voldoende grotere container ook gevuld met een kussen van silica gel kraal.
  2. Alvorens te strak sluiten elke buis en container, uitwisseling van lucht met argon gas. Dit kan worden bereikt door het plaatsen van de open buizen en containers in een exsiccator, gevolgd door het verwijderen en vervangen van de lucht met argon gas. Aangezien argon gas zwaarder dan lucht is, buizen en containers zijn gevuld met argon gas en kunnen nu worden geplaatst in elkaar, met elk deksel goed gesloten.
  3. Opslag containers bij-80 ° C.
  4. Bij het ontdooien, plaatsen van de containers op silica kralen in een exsiccator en langzaam warm ze tot kamertemperatuur, en open vervolgens de container.
  5. Bij het uitvoeren van een reactie van de koppeling, vers kunt oplossen door de hoeveelheid substraat nodig in de geschikt oplosmiddel te koppelen. Wees voorzichtig niet te het toevoegen van meer dan 10% oplossing te koppelen aan de definitieve koppeling reactie, vooral als DMF of DMSO wordt gebruikt als het oplosmiddel voor de koppeling substraat.

3. versterking, reiniging en chemische modificatie van Ad vectoren:

  1. Versterking van Ad vectoren
    Opmerking: De volgende stappen moeten worden uitgevoerd met behulp van een kabinet van veiligheid volgens lokale biologische veiligheidsvoorschriften.
    1. Transfect een replicatie gebrekkige ∆E1 Ad vector met één (of meerdere) genetisch geïntroduceerde cysteïne-residue(s) in HEK 293 cellen zoals beschreven door Kratzer en Kreppel38.
    2. Volgens het protocol38, versterken de vector door sequentiële reïnfecties tot een laatste voorbereidende infectie van 15-20 grote (15 cm) cel cultuur platen (ongeveer 1-2 x 107 cellen/plaat).
      Opmerking: Optimaal, de laatste herinfectie moet worden getimed zodat cellen Toon volledige cytopathogeen effect (CPE) op de ochtend van zuivering en wijziging prestaties (Zie Figuur 2).
    3. Na de definitieve amplificatie stap, kunnen cellen geresuspendeerde in Ad buffer + 10 mM TCEP (variant B) worden bevroren bij-80 ° C; voor optimale opbrengst voor vector deeltjes, wordt een onmiddellijke opvolging van cel lysis en vector zuivering en wijziging echter aanbevolen.
  2. Zuivering en chemische modificatie van Ad vectoren
    Opmerking: Zuivering van vectoren is uitgevoerd volgens het adenovirus zuivering protocol beschreven in38maar onder niet-oxiderende omstandigheden. Oogsten en lysis van de cel, alsmede de zuivering en chemische modificatie vector kan worden uitgevoerd binnen één dag. Lyse van de geïnfecteerde cellen volgens het protocol eerder beschreven en oogst38.
    1. Het verzamelen van cellen door schrapen van de platen en de overdracht van het supernatant op 200-500 mL centrifugeren buizen.
    2. Draai de cel oplossing voor 10 min bij 400 x g.
    3. Resuspendeer de pellet cel in 4 mL van Ad-buffer + 10 mM TCEP (pH 7,2) (variant B) en overdracht aan een steriele 50 mL-buis. Als cel opbrengst laag of slechts een zwakke CPE was geïnduceerd, resuspendeer het in 2 mL.
    4. De vector redden door 3 cycli van bevriezing (in vloeibare stikstof) en ontdooien (in een waterbad 37 ° C).
    5. Spin voor 10 min bij 5.000 x g bij 4 ° C.
    6. Bereiden twee gelijke CsCl stap verlopen tijdens het centrifugeren wordt:
      1. Ten eerste, als de lagere fase, voeg 3 mL van 1.41 g/cm3 ρCsCl in Ad-buffer + 0.5 mM TCEP (pH 7,2, variant C) in de buizen van de ultracentrifuge. Het markeren van het niveau van de lagere fase op de buis alvorens de bovenste fase te laden.
      2. Zorgvuldig stapelen de bovenste fase van 5 mL van 1,27 g/cm3 ρCsCl in Ad-buffer + 0.5 mM TCEP (pH 7,2, variant C) door zeer langzaam het volume 5 mL langs de muren van de buis op de lagere fase pipetteren.
        Opmerking: Sinds tijdens de koppeling een hoge concentratie van TCEP kan reageren met het residu van de maleimide van malPEG-750 en leiden tot verminderde koppeling efficiëntie, zuivering door CsCl stap verloop moet al worden uitgevoerd onder een verlaagde concentratie van de TCEP.
    7. Laden van het supernatant op het CsCl verloop [hetzij gelijkelijk verdelen het supernatant op beide verlopen of, in het geval van een lage vector rendement (zie hierboven), laden van het supernatant op slechts één kolom], en vul beide verlopen even naar de top met Ad buffer + 10 mM TCEP (pH 7 .2, variant B).
    8. Pas het gewicht van de tegenovergestelde buizen aan een 0.0 g gewicht verschil.
    9. Ultracentrifuge gedurende 2 uur bij 176,000 x g bij 4 ° C.
    10. Met een klem, verbeteren de ultracentrifugatie tube naar een stand, dat verlaten van het gebied rond de lagere fase niveau merk toegankelijk. Plaats de zwanenhals lamp boven de buis. Rond het merk, op de grens tussen de boven- en ondergrenzen fasen, moet een duidelijke band (de vector-virionen) zichtbaar (figuur 3A-3 C).
    11. Het verzamelen van de vectoren door de buis te prikken met een naald en aspirant de vector-band in een spuit. Verzamelde vector virionen overbrengen in een tube van 15 mL.
      Opmerking: Zwakkere bands boven de band Ad vector onvolledig vector deeltjes bevatten en moeten worden vermeden voor aspiratie. De cel puin en groen fluorescent proteïne (EGFP) van EGFP-uiten Ad-vectoren in het bovenste gedeelte van de ultracentrifuge verzamelen zal buis (Zie figuur 3A en 3B). Dit en de volgende stappen tot koppeling (stap 3.2.16) moeten worden verricht snel, zoals de vectoren zijn nu verstandig om disulfide binding als gevolg van de lage concentratie van de TCEP.
    12. Voor het berekenen van de hoeveelheid koppeling substraat nodig voor efficiënte volledige binding van het substraat aan alle cysteïne residuen in de voorbereiding van de vector, OD260op te waarderen:
      1. Volgens het protocol beschreven door Kratzer en Kreppel38, vortex een mengsel van 10 µL van de verzamelde vector-virionen 89 µL van Ad buffer en 1 µL van 10% SDS. Als een lege sonde, vortex 99 µL van Ad-buffer en 1 µL van 10% SDS.
      2. Incubeer te denatureren de virionen, zowel op 56 ° C gedurende 10 minuten.
      3. OD260bepalen.
      4. De titer van de fysieke vector per µL met behulp van de volgende vergelijking berekenen: OD260 x Factor verdunning x empirisch bepaald uitsterven coëfficiënt van Ad (1.1 x 109 vector deeltjes = 1 OD260 eenheid/µL). Daarom een gemeten OD260 van 1.36 van een vector verdund 1:10, zou resulteren in: 1.36 x 10 x 1,1 x 109 = ongeveer 1.5 x 1010 vector deeltjes/µL.
        Opmerking: Deze titer is slechts een ruwe schatting; het is echter nauwkeurig genoeg voor de stoichiometrische berekeningen die worden beschreven in de volgende.
    13. Afhankelijk van het eiwit gewijzigd door invoering van een cysteïne, bepalen de hoeveelheid substraat van de koppeling (in grammen) voor een efficiënte koppeling reactie, volgens de volgende algemene vergelijking: Virus titer x Volume x aantal cysteines x overmaat van groep x Moleculaire gewicht van groep / 6,022 x 1023 = gram substraat te koppelen.
      Opmerking: In deze vergelijking: 1) virus titer is de titer/µL, bepaald door OD260 zoals hierboven beschreven, 2) volume rekeningen voor het volume in µL van streefde vector gebruikt in de reactie van de koppeling, 3) het aantal cysteines is het aantal eiwitten waarin het cysteïne residu geïntroduceerd per vector deeltje, 4) overmaat van deel daarvan is de factor van de overtollige nodig deel daarvan voor een efficiënte koppeling reactie (50 x) en 5) het molecuulgewicht van de groep moet worden ingevoerd als Da (niet kDa).
    14. Vers kunt oplossen door de hoeveelheid stof (of haalbaar bedrag) nodig in de geschikt oplosmiddel.
      Opmerking: Als de hoeveelheid koppeling substraat nodig is laag en moeilijk te wegen, maar dure, weeg de minimale hoeveelheid samengestelde mogelijk en los het op in een geschikte concentratie voor toepassing naar de reactie van de koppeling.
    15. Breng de vector-oplossing over in een buis van de juiste grootte (bijvoorbeeld 2 mL tube) en voeg het berekende bedrag samengestelde stamoplossing te koppelen aan de vector.
    16. Meng voorzichtig de oplossing door overhead rotatie gedurende 1 uur bij kamertemperatuur.
    17. Vullen opwaarts naar de vector-oplossing voor de totale volume 6 mL met Ad-buffer (pH 7,6, variant A).
      Opmerking: Deze stap moet worden uitgevoerd voordat de oplossing wordt toegepast op het verloop van de stap om ervoor te zorgen dat de oplossing van de vector, waarin nog CsCl uit de eerste stap verloop, een dichtheid lager dan 1,27 g/mL heeft.
    18. In een tweede CsCl banding stap, zuiveren de vector uit de groep spoorverontreiniging koppeling:
      1. Twee gelijke CsCl stap verlopen door de volgende stappen uit te voeren voor elk bereiden: 1) lagere fase: 3 mL 1.41 g/cm3 ρCsCl in Ad-buffer (pH 7,6, variant A), 2) markeren niveau van lagere fase op de buis voor het laden van de bovenste fase, en 3) de bovenste fase : van 1,27 g/cm3 ρCsCl in Ad-buffer (pH 7,6, variant A) 5 mL.
        Opmerking: Nadat de koppeling heeft plaatsgevonden, buffers zonder TCEP worden gebruikt, zoals nu geen gratis thiol-groepen aanwezig zijn op de vector capsids moet.
      2. Laden van het supernatant op het CsCl verloop en vul beide verlopen even naar de top met Ad-buffer (pH 7,6, variant A).
      3. Aanpassen van de gewichten van de tegenovergestelde buisjes aan een 0.0 g gewicht verschil.
    19. Ultracentrifuge gedurende 2 uur bij 176,000 x g bij 4 ° C.
    20. Kort voor het einde van ultracentrifugatie, equilibreer een PD-10-kolom 5 keer met 5 mL Ad-buffer (pH 7,6, variant A).
    21. Zoals gedaan in stap 3.2.10, bevestigen de ultracentrifugatie buis zich verlaten gebied rond de lagere fase niveau merk toegankelijk. Plaats de zwanenhals lamp boven de buis. Nogmaals, rond de grens tussen de boven- en ondergrenzen fasen, een verschillende band (de vector-virionen) moet zichtbaar (Figuur 3 c).
    22. Verzamelen van de vectoren door de buis te prikken met een naald en aspirant de vector-band in een spuit en de vector overbrengen in een tube van 15 mL. Zorg voor het verzamelen van de virionen van beide kleurovergang buizen samen als een totaal volume van 2.5 mL of minder. Als een kleiner volume wordt ingezameld, vul om het verkrijgen van een totaal volume van 2.5 mL met Ad buffer (variant A).
    23. Laad de 2,5 mL op de equilibrated PD-kolom. Gooi de doorstroming.
    24. Voeg 3 mL Ad buffer (variant A) op de kolom en verzamel de doorstroming (met de gezuiverde vector-virionen).
    25. Voeg glycerol (333 µL) voor het verkrijgen van een eindconcentratie van 10% en verdeel in geschikte aliquots (bijvoorbeeld 400 µL elk), en omvatten een aliquoot gedeelte van 20 µL voor titer bepaling door OD260 meting.
    26. Winkel de vector-oplossing bij-80 ° C.
    27. Bepaal de titer van vector door het meten van de OD-260 van 20 µL vector oplossing, 79 µL van Ad-buffer (variant A), en 1 µL van 10% SDS zoals beschreven in stap 3.2.12. Gebruik als een leeg, 79 µL van Ad-buffer (variant A), 10 µL van 10% glycerol en 1 µL van 10% SDS.
    28. Bereken de vector-titer als: OD260 x-Factor van verdunning x 1,1 x 109 vector deeltjes/µL.
      Zoals voorbereid in stap 3.2.27, berekenen: OD260 x 5 x 1,1 x 109 vector deeltjes/µL

4. verificatie van de koppeling door SDS-PAGE:

Opmerking: Als verbindingen met voldoende hoog molecuulgewicht worden gebruikt voor koppeling aan Ad virionen, koppeling kan worden geverifieerd door polyacrylamide gelelektroforese (SDS-pagina). Succesvolle koppeling moet vervolgens leiden tot een verschuiving van de eiwit-band die overeenkomt met de gewijzigde Ad virion proteïne, in vergelijking met de proteïne in de ongewijzigde Ad virion (Zie Figuur 4).

  1. Volgens de berekende titer van vector (stap 3.2.28), 1-2 x 1010 vector deeltjes door SDS-PAGE (8%) te scheiden.
  2. De gel te ontwikkelen door zilver-kleuring van de gel39 om te ontdekken zelfs zwak eiwit bands:
    1. Voorbereiden op buffers zilveren kleuring (de bedragen die nodig zijn voor 100 mL buffer zijn aangegeven in vierkante haken):
      1. Bereid buffer 1 door het mengen van 38 mL ddH2O, 50% MeOH (50 mL 100 MeOH), 12% AcOH (12 mL voor 100% AcOH), en 0.0185% HCHO (50 µL van 37% HCHO).
      2. Bereiden van buffer 2 door toevoeging van 50% EtOH (50 mL 100% EtOH) aan 50 mL ddH2O.
      3. Bereiden van buffer 3 door toe te voegen 0.127 g/L Na2S2O3 (12.744 mg) tot 100 mL van ddH2O.
      4. Bereiden van buffer 4 door toevoeging van 2 g/L AgNO3 (0.2 g) en 0.0185% HCHO (50 µL van 37% HCHO) tot 100 mL van ddH2O.
      5. Bereiden van buffer 5 door toevoeging van 60 g/L Na2CO3 (6 g), 0.0185% HCHO (50 µL van 37% HCHO), en 2,5 mg/L Na2S2O3 (0.256 mg) tot ddH2O tot het verkrijgen van een eindvolume van 100 mL.
      6. Bereid buffer 6 door het mengen van 38 mL ddH2O, 50% MeOH (50 mL voor 100% MeOH), en 12% AcOH (12 mL voor 100% AcOH).
      7. Bereid buffer 7 door het mengen van 60 mL ddH2O, 30% MeOH (30 mL voor 100% MeOH), en 10% glycerine (10 mL voor 100% glycerine).
      8. Bereid buffer 8 door het mengen van 10% glycerine (10 mL voor 100% glycerine) met 90 mL ddH2O.
  3. Uitvoeren van zilveren kleuring
    1. Corrigeer de gel in de buffer 1 voor 30 min.
    2. De gel in de buffer 2 voor 15 min te wassen.
    3. Voorbehandeling van de gel in de buffer 3 voor 1 min.
    4. De gel 3 keer wassen in ddH2O voor 20 s.
    5. Impregneren de gel in de buffer 4 voor 20 min.
    6. De gel 2 keer wassen in ddH2O voor 20 s.
    7. Ontwikkelen van de gel in de buffer 5 totdat bands zichtbaar zijn (10 s tot 10 min).
    8. De gel 2 keer wassen in ddH2O gedurende 2 minuten.
    9. Stop ontwikkeling in buffer 6 voor 5 min.
    10. Instandhouding van de gel in de buffer 7 voor 20 min.
    11. De gel opslaan in buffer 8.
      Opmerking: Koppeling van efficiëntie kan worden bepaald door densitometric kwantificering van de gewijzigde en ongewijzigde bands van de gerichte capsomere.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Figuur 2 toont voorbeelden van de cytopathogeen effect (CPE) op 293 (HEK 293) cellen die succesvolle vector productie aangeeft. Cellen moeten laten zien van morfologie (figuur 2C) 40-48 uren na inoculatie met de vector van het virus. De juiste timepoint voor oogsten is cruciaal voor niet verliezen virusdeeltjes door lysis van de cel en het voorkomen van oxidatie van de genetisch geïntroduceerde thiol-groepen. Als vector deeltjes ...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

De efficiëntie waarmee de genetisch geïntroduceerde cysteines kunnen chemisch worden gewijzigd is meestal 80-99%, en bepaalde variabelen beïnvloeden deze efficiëntie. In de eerste plaats is het essentieel dat de genetisch geïntroduceerde cysteines geen voortijdige oxidatie ondergaan. Terwijl ze goed beschermd in het reducerende milieu van de cellen van de producent, is het verplicht om een niet-oxiderende milieu na het loslaten van deeltjes van de vector uit de cellen van de producent en tijdens chemische modificatie. Te...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te onthullen.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Vectorzuivering en chemische modificatie
Argon gasAir liquidelokale gasdealer
Vloeibare stikstofAir liquidelokale gasdealer
500 mL centrifugebuizenCorning431123
Stericup Express Plus 0.22 µmMilliporeSCGPU02RE
Tris(2-carboxyethyl)fosfine (TCEP)Sigma-AldrichC4706-10g
2 mL (3mL) Norm Ject (spuitjes)Henke Sass Wolf4020.000V0
Fine-Ject naalden voor eenmalig gebruik (geel 0,9 x 40 mm)Henke Sass Wolf4710009040
Caesiumchloride 99,999% Ultra kwaliteitRoth8627.1
SilicagelkralenApplichemA4569.2500
Methoxypolyethyleenglycolmaleïmide - 750 (PEG mal-750)Iris Biotechbewaar in silicagelkralen bij -80 °C
13,2 mL Ultra Clear UltracentrifugebuizenBeckman Coulter344059alleen openen in kap
PD-10 grootte-exclusiechromatografiekolomGE Healthcare17-0851-01bewaar bij 4 °C
HepesAppliChemA1069.1000
SDS UltrapureAppliChemA1112,0500
GlycerolAppliChemA1123.1000
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Materiaal voor celcultuur
DPBSPAN BiotechP04-36500
DMEMPAN BiotechP04-03590
Trypsin/EDTAPAN BiotechP10-0231SP
FBS GoodPAN BiotechP40-37500
Penicilline/StreptomycinePAN BiotechP06-07100
Biosphere Filter Tips (diverse maten)Sarstedt
Serologische pipetten (diverse maten)Sarstedt
reactiebuizen (diverse maten)Sarstedt
TC platen 15cmSarstedt83.3903
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Materiaal voor zilverkleuringsprotocol
MethanolJ.T.Baker8045
Ethanol absoluutAppliChem1613,2500PE
AzijnzuurAppliChemA0820,2500PE
Formaldehyde 37%AppliChemA0877,0250
Ethanol absoluutAppliChemA1613,2500PE
NatriumthiosulfaatAppliChem1,418,791,210
ZilvernitraatAppliChemA3944.0025
NatriumcarbonaatAppliChemA3900,0500
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Speciaal laboratoriummateriaal
ExsiccatorNalgene5311-0250
Megafuge 40Heraeus
Roter voor Megafuge TX750 + Adapter en Llids voor 500 mL buizenHeraeus
WaterbadConventioneel
Ultracentrifuge bijv. Optima XPN-80Beckman Coulter
geschikte Ultrazentrifuge Rotor bijv. SW41Beckman Coulter
pH-meterConventioneel
Standaard met klemmenConventioneel
GanzenhalslampConventioneel
Overhead rotorConventioneel
Thermische blokConventioneel
Fotometer (OD 260)Conventioneel

Referenties

  1. Benko, M., Harrach, B. Molecular evolution of adenoviruses. Current Topics in Microbiology and Immunology. , 3-35 (2003).
  2. Davison, A. J., Benko, M., Harrach, B. Genetic content and evolution of adenoviruses. Journal of Genetic Virology. 84, 2895-2908 (2003).
  3. Rowe, W. P., Huebner, R. J., Gilmore, L. K., Parrott, R. H., Ward, T. G. Isolation of a cytopathogenic agent from human adenoids undergoing spontaneous degeneration in tissue culture. Proceedings of the Society for Experimental Biology and Medicine. 84, New York, N.Y. 570-573 (1953).
  4. van Oostrum, J., Burnett, R. M. Molecular composition of the adenovirus type 2 virion. Journal of Virology. 56, 439-448 (1985).
  5. Stewart, P. L., Fuller, S. D., Burnett, R. M. Difference imaging of adenovirus: bridging the resolution gap between X-ray crystallography and electron microscopy. TheEMBO Journal. 12, 2589-2599 (1993).
  6. Stewart, P. L., Burnett, R. M., Cyrklaff, M., Fuller, S. D. Image reconstruction reveals the complex molecular organization of adenovirus. Cell. 67, 145-154 (1991).
  7. Meier, O., et al. Adenovirus triggers macropinocytosis and endosomal leakage together with its clathrin-mediated uptake. Journal of Cellular Biology. 158, 1119-1131 (2002).
  8. Xu, Z., et al. Coagulation factor X shields adenovirus type 5 from attack by natural antibodies and complement. Nature Medicine. 19, 452-457 (2013).
  9. Qiu, Q., et al. Impact of natural IgM concentration on gene therapy with adenovirus type 5 vectors. Journal of Virology. 89, 3412-3416 (2015).
  10. Alemany, R., Suzuki, K., Curiel, D. T. Blood clearance rates of adenovirus type 5 in mice. Journal of Genetic Virology. 81, 2605-2609 (2000).
  11. Smith, J. S., Xu, Z., Tian, J., Stevenson, S. C., Byrnes, A. P. Interaction of systemically delivered adenovirus vectors with Kupffer cells in mouse liver. Human Gene Therapy. 19, 547-554 (2008).
  12. Schiedner, G., et al. A hemodynamic response to intravenous adenovirus vector particles is caused by systemic Kupffer cell-mediated activation of endothelial cells. Human Gene Therapy. 14, 1631-1641 (2003).
  13. Xu, Z., Tian, J., Smith, J. S., Byrnes, A. P. Clearance of adenovirus by Kupffer cells is mediated by scavenger receptors, natural antibodies, and complement. Journal of Virology. 82, 11705-11713 (2008).
  14. Khare, R., Reddy, V. S., Nemerow, G. R., Barry, M. A. Identification of adenovirus serotype 5 hexon regions that interact with scavenger receptors. Journal of Virology. 86, 2293-2301 (2012).
  15. Piccolo, P., Annunziata, P., Mithbaokar, P., Brunetti-Pierri, N. SR-A and SREC-I binding peptides increase HDAd-mediated liver transduction. Gene Therapy. 21, 950-957 (2014).
  16. Plüddemann, A., Neyen, C., Gordon, S. Macrophage scavenger receptors and host-derived ligands. Methods (San Diego, Calif). 43, 207-217 (2007).
  17. Ganesan, L. P., et al. Rapid and efficient clearance of blood-borne virus by liver sinusoidal endothelium. PLoS Pathogen. 7, e1002281(2011).
  18. Cichon, G., et al. Titer determination of Ad5 in blood: a cautionary note. Gene Therapy. 10, 1012-1017 (2003).
  19. Carlisle, R. C., et al. Human erythrocytes bind and inactivate type 5 adenovirus by presenting Coxsackie virus-adenovirus receptor and complement receptor 1. Blood. 113, 1909-1918 (2009).
  20. Waddington, S. N., et al. Adenovirus serotype 5 hexon mediates liver gene transfer. Cell. 132, 397-409 (2008).
  21. Kalyuzhniy, O., et al. Adenovirus serotype 5 hexon is critical for virus infection of hepatocytes in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 105, 5483-5488 (2008).
  22. Vigant, F., et al. Substitution of hexon hypervariable region 5 of adenovirus serotype 5 abrogates blood factor binding and limits gene transfer to liver. Molecular Therapy. The Journal of the American Society of Gene Therapy. 16, 1474-1480 (2008).
  23. Jonsson, M. I., et al. Coagulation factors IX and X enhance binding and infection of adenovirus types 5 and 31 in human epithelial cells. Journal of Virology. 83, 3816-3825 (2009).
  24. Bradshaw, A. C., et al. Requirements for receptor engagement during infection by adenovirus complexed with blood coagulation factor X. PLoS Pathogen. 6, e1001142(2010).
  25. Duffy, M. R., Bradshaw, A. C., Parker, A. L., McVey, J. H., Baker, A. H. A cluster of basic amino acids in the factor X serine protease mediates surface attachment of adenovirus/FX complexes. Journal of Virology. 85, 10914-10919 (2011).
  26. Xu, Z., et al. Coagulation factor X shields adenovirus type 5 from attack by natural antibodies and complement. Nature Medicine. 19, 452-457 (2013).
  27. Prill, J. -M., et al. Modifications of adenovirus hexon allow for either hepatocyte detargeting or targeting with potential evasion from Kupffer cells. Molecular Therapy. The Journal of the American Society of Gene Therapy. 19, 83-92 (2011).
  28. Zaiss, A. K., et al. Hepatocyte Heparan Sulfate Is Required for Adeno-Associated Virus 2 but Dispensable for Adenovirus 5 Liver Transduction In Vivo. Journal of Virology. 90, 412-420 (2015).
  29. Delgado, C., Francis, G. E., Fisher, D. The uses and properties of PEG-linked proteins. Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems. 9, 249-304 (1992).
  30. Parveen, S., Sahoo, S. K. Nanomedicine: clinical applications of polyethylene glycol conjugated proteins and drugs. Clin. Pharmacokinet. 45, 965-988 (2006).
  31. O'Riordan, C. R., et al. PEGylation of adenovirus with retention of infectivity and protection from neutralizing antibody in vitro and in vivo. Human Gene Therapy. 10, 1349-1358 (1999).
  32. Subr, V., et al. Coating of adenovirus type 5 with polymers containing quaternary amines prevents binding to blood components. Journal of Controlled Release. 135, 152-158 (2009).
  33. Kreppel, F., Gackowski, J., Schmidt, E., Kochanek, S. Combined genetic and chemical capsid modifications enable flexible and efficient de- and retargeting of adenovirus vectors. Molecular Therapy. The Journal of the American Society of Gene Therapy. 12, 107-117 (2005).
  34. Corjon, S., et al. Targeting of adenovirus vectors to the LRP receptor family with the high-affinity ligand RAP via combined genetic and chemical modification of the pIX capsomere. Molecular Therapy: The Journal of the American Society of Gene Therapy. 16 (11), 1813-1824 (2008).
  35. Prill, J. -M., et al. Modifications of adenovirus hexon allow for either hepatocyte detargeting or targeting with potential evasion from Kupffer cells. Molecular Therapy. The Journal of the American Society of Gene Therapy. 19, 83-92 (2011).
  36. Krutzke, L., et al. Substitution of blood coagulation factor X-binding to Ad5 by position-specific PEGylation: Preventing vector clearance and preserving infectivity. Journal of Controlled Release. 235, 379-392 (2016).
  37. Prill, J. -M., et al. Traceless bioresponsive shielding of adenovirus hexon with HPMA copolymers maintains transduction capacity in vitro and in vivo. PloS One. 9, e82716(2014).
  38. Kratzer, R. F., Kreppel, F. Production, Purification, and Titration of First-Generation Adenovirus Vectors. Methods in Molecular Biology. , Clifton, NJ. 377-388 (2017).
  39. Blum, H., Beier, H., Gross, H. J. Improved silver staining of plant proteins, RNA and DNA in polyacrylamide gels. ELECTROPHORESIS. 8, 93-99 (1987).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Tags

Adenovirusvectorencapsidmodificatiegenetische modificatiechemische koppelingcesiumchloridegradiëntvectorzuiveringcysteïnerestenshielding targetinggentherapieoncolytische virotherapie
Gecombineerde genetische en chemische Eiwitmantel wijzigingen van genenoverdracht Adenovirus gebaseerde vectoren voor afscherming en Targeting
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.