Nieuwe methoden voor intranasale toediening onder inademing verdoving te evalueren van de neus-naar-Brain Drug Delivery

Samenvatting

Hier beschrijven we twee nieuwe methoden van stabiele intranasale toediening onder inademing verdoving met minimale fysieke stress voor proefdieren. Ook beschrijven we een methode voor kwantitatieve beoordeling van drug distributie niveaus in de hersenen via de neus-aan-hersenen pathway met behulp van radiolabeled [¹⁴C]-inuline als model substraat van in water oplosbare macromoleculen.

Samenvatting

Intranasale toediening is gemeld als een mogelijke weg voor de neus-naar-brain levering van therapeutische agenten die de bloed - hersenbarrière omzeilt. Echter zijn er enkele verslagen met betrekking tot niet alleen de kwantitatieve analyse, maar ook het beheer van de optimale voorwaarden en dosering van regimes voor onderzoek van de neus-naar-brain levering. De beperkte vooruitgang in onderzoek naar mechanismen van de neus-naar-brain traject met behulp van knaagdieren vertegenwoordigt een aanzienlijke belemmering op het gebied van het ontwerpen van de neus-naar-brain afgiftesystemen voor kandidaat-drugs.

Om te krijgen wat vooruitgang in dit opzicht, wij ontwikkeld en geëvalueerd van twee nieuwe methoden van stabiele intranasale toediening onder inademing verdoving voor proefdieren. Ook beschrijven we een methode voor de beoordeling van de drug distributie niveaus in de hersenen via de neus-aan-hersenen pathway met behulp van radio-geëtiketteerden [¹⁴C]-inuline (moleculair gewicht: 5.000) als substraat model van in water oplosbare macromoleculen.

Aanvankelijk, ontwikkelden we een pipet gebaseerde intranasale administratie-protocol met behulp van tijdelijk openable maskers, waardoor ons voor het uitvoeren van betrouwbare toediening aan dieren onder stabiele verdoving. Met behulp van dit systeem, [¹⁴C]-inuline kon worden verstuurd naar de hersenen met weinig experimentele fout.

Later ontwikkelden we een intranasale toediening protocol inhoudt van omgekeerde cannulation van de kant van de luchtwegen door de slokdarm, die werd ontwikkeld om te minimaliseren van de effecten van mucociliary klaring (MC). Deze techniek heeft geleid tot aanzienlijk hogere niveaus van [¹⁴C]-inuline, die kwantitatief werd ontdekt in de bulbus olfactorius cerebrum en de medulla oblongata, dan de pipetteermethode. Dit lijkt te zijn omdat de handhaving van de drug-oplossing in de neusholte werd aanzienlijk verhoogd door actieve administratie met behulp van een injectiespuit pomp in een richting tegenovergesteld aan de MC in de neusholte.

Kortom, de twee methoden voor intranasale toediening ontwikkeld in deze studie kunnen worden verwacht dat uiterst nuttige technieken voor de beoordeling van de farmacokinetiek bij knaagdieren. De omgekeerde cannulation methode, in het bijzonder zou kunnen nuttig zijn voor de beoordeling van het volledige potentieel van de neus-naar-brain levering van drugkandidaten.

Inleiding

Biomedicines zoals peptiden, oligonucleotides en antilichamen worden beschouwd als potentiële toepassing als nieuwe therapeutische agenten voor vuurvaste centraal zenuwstelsel-stoornissen die momenteel geen curatieve therapie hebben. Omdat de meeste biomedicines wateroplosbaar macromoleculen zijn, is levering uit het bloed naar de hersenen via de intraveneuze of orale toediening echter zeer moeilijk als gevolg van de impedantie van de bloed - hersenbarrière (BBB).

In de afgelopen jaren is intranasale toediening gemeld als een mogelijke weg voor de neus-naar-brain levering van therapeutische agenten die de BBB^{1,2,3,4,5 vermijdt}. Er zijn echter relatief weinig meldingen met betrekking tot de kwantitatieve analyse van neus-aan-hersenen pathway levering⁶. Bovendien zijn er vrijwel geen verslagen over vastgestelde optimale administratie voorwaarden en doseren regimes, zoals volume, times, periodes, en snelheid, voor onderzoek van de neus-naar-brain levering. De genoemde tekortkomingen kunnen worden toegeschreven aan de volgende redenen: (i) een optimale wijze van intranasale toediening voor muizen nog moet worden vastgesteld, en (ii) intranasale toediening door pipetteren, die over het algemeen wordt gebruikt, wordt doorgaans gekenmerkt door de variatie van de interindividual onder de dieren als gevolg van mucociliary klaring (MC), waardoor het vaak leidt tot underestimations van het potentieel van de feitelijke levering van neus-tot-brein van een bepaald geneesmiddel.

Inademing verdoving met behulp van Isofluraan (Inleiding: 4%, onderhoud: 2%) met een inademing masker voor knaagdieren heeft opgedaan wijdverbreide gebruik, met het doel van het verminderen of elimineren van de pijn geassocieerd met chirurgie uitgevoerd op proefdieren. Het gebruik van maskers maakt het relatief eenvoudig om uit te voeren van typische drug administration bij proefdieren onder inademing verdoving via de subcutane, intraperitoneaal en intraveneuze routes. In het geval van intranasale toediening moet het masker echter worden tijdelijk verwijderd uit de dieren voor drug administration. Met onderhoud onder 2% Isofluraan, dieren meestal ontwaken snel van inademing verdoving. Wanneer het volume van de administratie per dosis groot is, hierdoor kan de oplossing van de drug van de neusholte stromen naar de slokdarm, en dus een enkele grote dosis wellicht worden opgesplitst in meerdere kleinere doses voor intranasale toediening aan kleine dieren. Zoals intranasale toediening noodzakelijk masker verwijderen voor herhaalde toediening en voldoende tijd voor duurzame neusholte levering is, is er een grote kans dat muizen van verdoving tijdens de administratieve procedures ontwaken zou. Dit maakt het erg moeilijk om uit te voeren intranasale toediening onder een stabiele toestand van verdoving, en waarschijnlijk draagt bij tot de waargenomen interindividual variatie van de neus-naar-brain levering onder knaagdieren.

In deze studie ontwikkeld wij daarom twee nieuwe methodes van stabiele intranasale toediening onder inademing verdoving, die minimale fysieke belasting van de proefdieren opleggen. Voor de eerste methode gebruikten we een tijdelijk openable masker waarmee intranasale toediening tijdens inademing verdoving. Het openable gedeelte van het masker bevat een siliconen plug die om stabiele intranasale toediening met behulp van een precisiepipet overeenkomstig administratie timing kan worden gebruikt. Voor de tweede methode, een canule is operatief ingevoegd om het passeren van de slokdarm in de neusholte en een spuitpomp werd vervolgens gekoppeld aan dit zodat de drug oplossing kon worden direct en betrouwbaar bezorgd in de neusholte onder stabiele inademing anesthesie. Deze methode kan het verbeteren van de levering van drugs in de hersenen via de neus-naar-brain-route, omdat door het aanzienlijk het minimaliseren van de effecten van MC, drug retentively in de neusholte zou worden verbeterd. Daarnaast beschrijven we een methode voor het uitrekenen kwantitatief drug distributie niveaus (% voor de ingespoten dosis/g hersenen) in de hersenen met behulp van radio-geëtiketteerden [¹⁴C]-inuline [molecuulgewicht (MW): 5.000] als een model substraat van in water oplosbare macromoleculen.

Protocol

Deze dierlijke studie (#AP17P004) werd uitgevoerd overeenkomstig de richtsnoeren die zijn goedgekeurd door de Nihon Universiteit Animal Care en gebruik Comité (Tokyo, Japan). Deze studie (#17-0001) werd goedgekeurd door het midden van de isotoop van de School voor farmacie, Nihon Universiteit.

1. dieren die worden gebruikt voor intranasale toediening onder inademing verdoving

1. Het huis van de experimentele muizen in roestvrij stalen kooien onder een 12-h licht/donker cyclus (licht op 8:00-8:00 uur), met een gecontroleerde temperatuur onderhouden bij 23 ± 1° C, luchtvochtigheid van 50% ± 10%, en ad libitum toegang tot voedsel en water.
2. Anesthetize voorafgaand aan experimenten, de muizen via inademing van 2% Isofluraan, volgende inleiding bij een concentratie van 4%. Bevestig het vereiste veiligheidsniveau afstomping door te controleren voor de verdwijning van oppervlakte vergissingen.

2. bereiding van de oplossing van de administratie

1. Bereid de oplossing van een administratie van [¹⁴C]-inuline (50 μM, 0.5 aanbevolen/mL per muis) door verder verdunnen in een met fosfaat gebufferde zoutoplossing, en bewaren bij 4 ° C tot gebruik.

3. intranasale administraties voor muizen

1. Micropipet-methode met behulp van een tijdelijk openable inhalatie-masker (Figuur 1)
   Opmerking: Deze techniek is een wijziging van het protocol van de intranasale toediening met behulp van een micropipet Frey et al. ingestelde ³
   1. Oplossen van muizen in de liggende positie op een prikbord door taping hun ledematen onder inademing verdoving met 2% Isofluraan (figuur 1A).
   2. Het toedienen van een totaal volume van 25-μL beheer oplossing aan elke muis tussenpozen 30-s via 1 - tot 2-μL doses toegediend als alternatief in de linker- en neusgaten terwijl de muizen zijn vastgesteld onder inademing verdoving (figuur 1B en C).
   3. Opmerking: Afval verdoving gas is opruiming op actieve wijze (fume hood, harde-ducted bioveiligheid kabinet, vacuüm, enz.) wanneer het masker wordt geopend en op passieve wijze (verdoving afgas bus) wanneer gesloten
2. Cannulation omkeren m ethod van de kant van de luchtwegen door de slokdarm (Figuur 2)
   Opmerking: Deze techniek is een wijziging van het protocol intranasale absorptie voor ratten Hirai et al. ingestelde ⁷
   1. Corrigeer muizen in de liggende positie op een prikbord door hun ledematen onder inademing verdoving met 2% Isofluraan vast te binden.
   2. Haar in de nek is geschoren en klaargestoomd via betadine of chloorhexidine toepassing gevolgd door een spoeling van alcohol.
   3. Bloot de luchtpijp en de slokdarm door uitbreiding van de huid onder de keel met een tang na het maken van een kleine incisie (1,5 cm) met een schaar.
   4. Maak een incisie (1 mm) in de luchtpijp met behulp van schaar.
   5. Invoegen van een canule (binnendiameter: 0.58 mm, exterieur diameter: 0.965 mm) tot een lengte van 1,2 cm en bevestig het andere uiteinde van de canule aan de binnenkant van de inademing masker.
   6. Maak een incisie (1 mm) in de slokdarm met behulp van schaar, plaatst u een canule (binnendiameter: 0,28 mm, exterieur diameter: 0.61 mm) tot een lengte van 1,4 cm naar het posterieure deel van de neusholte, en afbinden (figuur 2A en B).
      Opmerking: Procedures 3.2.2 tot en met 3.2.4 werden uitgevoerd onder een stereoscopische Microscoop bij × 10 vergroting.
   7. Een naald (27G × 1/2) hechten aan een 1 mL spuit gevuld met een oplossing van het beheer en verbinden met een programmeerbare micro-spuitpomp.
   8. Sluit boven de canule die had zijn opgenomen in de slokdarm op 3.2.5 (figuur 2C) naald.
   9. Beheren van een totaal volume van 25 μL [¹⁴C]-inuline oplossing met een constante snelheid (5 l/min) (figuur 2C en 2D).

4. kwantitatieve Experiment met behulp van Radio-geëtiketteerden wateroplosbare macromoleculen ([¹⁴C]-inuline)

1. Decapitate de experimentele muizen onder verdoving en open hun craniums, met behulp van schaar en van de kant van de medulla oblongata, terwijl de zorg niet om beschadiging van de hersenen.
2. Pak zorgvuldig de hele hersenen door scooping met behulp van een micro-spatel van de schedel.
3. Plaats een filtreerpapier bevochtigd met zoutoplossing op een petrischaal die is opgeslagen op het ijs.
4. Plaats de uitgepakte hersenen op het bevochtigde koffiefilter.
5. Veeg bloed vast te houden aan het oppervlak van de hersenen met een wattenstaafje bevochtigd met zoutoplossing te elimineren ten minste de invloed van [¹⁴C]-inuline in het bloed op het oppervlak van de hersenen.
6. Hersenen snel ontleden en verdeel ze in drie delen: de bulbus olfactorius cerebrum en de medulla oblongata (inclusief de pons).
7. Leg monsters van de hersenen in weefsel oplosmiddel bij 50 ° C gedurende 1 uur.
8. Voeg toe 10 μL van de vloeibare scintillatietelling cocktail aan de hersenen monsters.
9. Breng een hoeveelheid van 25 μL van de oplossing van de administratie opgelost in Scintillatie cocktail aan een flesje Scintillatie om te bepalen van de radioactiviteit van de toegepaste oplossing.
10. Meten van de disintegrations per minuut [¹⁴C] radioactiviteit in de hersenen steekproef ([¹⁴C] X_hersenen) en de toegepaste oplossing ([¹⁴C] X_{IN dosis}) in een vloeibare scintillatietelling teller uitgerust met een passende Crossover correctie voor ³H en ¹⁴C.

5. de gegevensanalyse

1. Bereken de drug distributie niveaus (%) voor de ingespoten dosis (ID %) met behulp van de volgende vergelijking:
   ID % ⁄g hersenen = (_hersenenX [¹⁴C] / [¹⁴C] X_{IN dosis}) × 100,
   waar X_hersenen (dpm/g hersenen) is de hoeveelheid [¹⁴C] - inuline gemeten in het hersenweefsel en X_{IN dosis} (dpm/25 μL oplossing) is de concentratie van de [¹⁴C] - inuline in de oplossing gebruikt voor intranasale toediening.

Resultaten

Figuur 3 toont de [¹⁴C]-inuline niveaus (ID % ⁄g hersenen) in de bulbus olfactorius (A) hersenen (B) en de medulla oblongata (C) verkregen met behulp van de twee soorten intranasale toediening beoordeeld in de huidige studie. Intranasale toediening met behulp van het pipet methode ingeschakeld levering van [¹⁴C]-inuline in de hersenen met behulp van openable inademing maskers (Figuur 1). Onder inademing verd...

Discussie

De neus-naar-brain levering van drugs naar verwachting hebben een uitgesproken invloed op het centrale zenuwstelsel-stoornissen omdat dit traject vertegenwoordigt een rechtstreekse vervoer route die rondwegen van de BBB. Drie verschillende routes van de neus-naar-brain zijn bij datum⁸gemeld. De eerste is de bulbus zenuwtraject, die van de olfactorische mucosa in de nasale mucosa naar de reukkolf via de bulbus zenuw loopt. De tweede is het pad van de nervus trigeminus, die van de respiratoire mucos...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
ddY muis	Japan SLC, Inc.		Mannetje, 4-6 weken, 20-30 g
Isofluraan	Pfizer	v002139
Isofluraan setup	SHINANO manufacturing CO. LTD.	SN-487-OTAir, SN-489-4
Isofluraan masker	SHINANO manufacturing CO. LTD.		Voor kleine knaagdieren
Isofluraan masker (openbaar type)	SHINANO manufacturing CO. LTD.		Speciale bestellingen
Anesthesiebox	SHINANO manufacturing CO. LTD.	SN-487-85-02
Dierproefschaar-1	NATSUME SEISAKUSHO CO., LTD.	B-27H
Dierproefschaar-2	NATSUME SEISAKUSHO CO., LTD.	B-13H
Pincet-1	FINE SCIENCE TOOLS Inc.	11272-30	Dumont #7 Dumoxel
Pincet-2	NATSUME SEISAKUSHO CO., LTD.	A-12-1
Kanule buis (PE-50)	Becton, Dickinson and Company.	5069773	I.D.: 0.58 mm, O.D.: 0.965 mm
Kanule buis (SP-10)	NATSUME SEISAKUSHO CO., LTD.	KN-392	I.D.: 0.28 mm, O.D.: 0.61 mm
Scheerapparaat	MARUKAN, LTD.	DC-381
Stereoscopisch microscoop	Olympus Corporation	SZ61
Naald 27G 1/2 inch 13 mm	TERUMO CORPORATION	NN-2738R
1 mL spuit	TERUMO CORPORATION	SS-01T
Spuitpomp	Neuro science	NE-1000
Cellulose membraan	Toyo Roshi Kaisya, Ltd.	00011090
Microspatula	Shimizu Akira Inc.	91-0088
Micropipet (0.5-10 uL)	Eppendorf AG	Z368083
Pipetchip	Eppendorf AG	0030 000.811
Tape	TimeMed Labeling System, Inc.	T-534-R	Voor het fixeren van muis
[14C]-Inuline	American Radiolabeled Chemicals Inc.	ARC0124A	0.1 mCi/mL
EtOH	Wako Pure Chemical Industries, Ltd.	054-00461
Vloeibare scintillatieteller	Perkin Elmer Life and Analytical Sciences, Inc	Tri-Carb 4810TR