Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Ontrafeling van de hoofdrolspelers van de Humorale immuniteit: geavanceerde en geoptimaliseerd lymfocyt isolatie Protocol van RattenUitrustingen Peyer van Patches

13.5K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/58490

⸱

21 november 2018

 ,  ,  ,  , 
1Division of Hematology-Oncology, Beth Israel Deaconess Medical Center, Harvard Medical School, 2Department of Medicine, Beth Israel Deaconess Medical Center, Harvard Medical School

In dit artikel

Samenvatting

In deze studie presenteren we een roman en effectieve protocol voor de isolatie van lymfocyten van Peyer van Patches (PPs), die vervolgens kunnen worden gebruikt voor in vivo en in vitro Functionele assays evenals stroom cytometrische studies van folliculaire T helper en germinal center B cellen.

Samenvatting

In de mucosa van de darm vormen immune cellen een unieke immunologische entiteit, die, immuun tolerantie stimuleert terwijl gelijktijdig overdracht van het immuunsysteem verdediging tegen ziekteverwekkers. Het is reeds lang gevestigd dat Peyer van patches (KKS) een essentiële rol in de mucosal immune netwerk hebben door het hosten van verschillende effector T en B-cel subsets. Een bepaalde fractie van deze effector cellen, folliculaire T-helper (TFH) en germinal center (GC) B-cellen worden geprofessionaliseerd in de regulering van de Humorale immuniteit. Vandaar, omvat de karakterisering van deze deelverzamelingen van de cel binnen PPs in termen van hun differentiatie programma en functionele eigenschappen kan leveren belangrijke informatie over mucosale immuniteit. Daartoe zou een eenvoudig toepassing, efficiënte en reproduceerbare methode van lymfocyt isolatie van PPs waardevol voor onderzoekers. In deze studie, we gericht op het genereren van een effectieve methode om te isoleren van lymfocyten van muis PPs met hoge cel opbrengst. Onze aanpak bleek dat eerste weefsel verwerking zoals het gebruik van spijsvertering reagentia en weefsel agitatie, evenals cel kleuring voorwaarden en selectie van antilichaam panelen, grote invloed hebben op de kwaliteit en de identiteit van de geïsoleerde lymfocyten en op experimentele resultaten.

Hier beschrijven we een protocol waarmee onderzoekers efficiënt isoleren lymfocyt populaties van PPs waardoor reproduceerbare stroom cytometry gebaseerde beoordeling van T en B-cel subsets voornamelijk gericht op TFH en GC B cel subsets.

Inleiding

Het hele maagdarmkanaal vanaf het begin tot het einde is versierd met een uitgebreid lymfoïde netwerk dat immune cellen meer dan enig andere orgel in mens en muis1 bevat. Peyer de patches (KKS) vormen een belangrijk onderdeel van de intestinale tak van deze cellulaire immuun organisatie, zogenaamde gut-geassocieerde lymfoïde weefsel (GALT)2,3. Binnen PPs, duizenden miljoenen antigenen afgeleid van dieet materialen, commensale microbiota en pathogenen worden continu bemonsterd en wanneer nodig passende immuunrespons naar hen zijn gemonteerd dus handhaving intestinale immuun homeostase. In die zin kunnen de KKS worden genoemd als "amandelen van de dunne darm". KKS bestaan uit grote sub compartimenten: subepithelial koepel (SED), grote B-cel follikel zones; de bovenliggende follikel-geassocieerde epitheel (FAE) en de interfollicular regio (IFR) waar T-cellen gelegen4 zijn. Deze unieke compartimentering van PPs maakt het mogelijk verschillende effector cel deelverzamelingen om samen te werken, verleent dus immunocompetence in de darm.

KKS ontbreken afferent lymfatische, en vanwege deze reden niet antigenen vervoerd naar PPs van de dunne darm worden uitgevoerd via de lymfevaten in tegenstelling tot de meeste van de andere lymfoïde organen. In plaats daarvan, gespecialiseerde epitheliale cellen gelegen in FAE, zogenaamde M-cellen, zijn verantwoordelijk voor de overdracht van luminal antigenen in de KKS-5. Vervolgens, de vervoerde hoeveelheden antigenen worden opgepikt door de dendritische cellen (DC's) en fagocyten die zich in de regio subepithelial koepel (SED) onder de FAE6,7 bevinden. Dit proces antigeen sorteren door DCs in de PP is cruciaal voor het initiëren van de aanpassings immune reactie8 en latere generaties van IgA dat cellen9.

Als gevolg van de zware last die antigene commensale flora en dieet materiaal, KKS host endogeen geactiveerd effector T en B-cel deelverzamelingen in grote abundanties zoals TFH en IgA+ GC B cellen10, suggereren dat PPs een site van actieve immune vertegenwoordigen antwoord11. Detectie van tot 20-25% TFH cellen binnen de totale CD4+ T cel compartiment en tot 10-15% GC B binnen totaal aantal B-cellen cellen is mogelijk in KKS verzameld van unimmunized jonge C57BL/6 muizen12. In tegenstelling tot de soorten van andere T-helper cellen (dwz., Th1, Th2, Th17 cellen), TFH cellen Toon unieke tropisme in B-cel follikels voornamelijk ten gevolge van CXCR5 expressie, die TFH cel homing langs CXCL13 kleurovergang13 bevordert. In de B-cel follikel zones van PPs induceren TFH cellen IgA klasse schakelaar recombinatie en somatische hypermutation in geactiveerde B-cellen waaruit hoge-affiniteit IgA producerende cellen14 onderscheiden. Vervolgens deze plasmacellen antilichaam-afscheidende migreren naar de lamina propria (LP) en immuun homeostase in de darm10regelen.

Identificatie en karakterisering van TFH en GC B-cel populaties binnen PPs onderzoekers te onderzoeken van de dynamiek van de humorale immuunreacties onder steady-state omstandigheden zonder de behoefte aan tijdrovende immunisatie modellen in staat kunnen stellen traditioneel gebruikt in TFH-GC B cel studies15,16,17,18. Analyseren van TFH cellen binnen PPs is niet zo eenvoudig als andere cel subsets. Technische uitdagingen omvatten ideale weefsel voorbereiding voorwaarden, oppervlakte antilichaam-marker combinatie, identificeren, alsmede passende positieve en negatieve controles selecteren. Zowel TFH en PP onderzoeksgebieden vertonen grote variabiliteit in termen van de experimentele procedures en zijn verre van overdracht van een consensus om gestandaardiseerde protocollen als gevolg van verschillende redenen. Ten eerste neiging elke deelverzameling van de cel binnen PPs om differentieel door weefsel voorbereiding factoren vereisen verdere wijzigingen in een cel deelverzameling-specifieke manier worden beïnvloed. Ten tweede, is er een significante discrepantie tussen de gerapporteerde methoden met betrekking tot de details voor cel bereiding op basis van PPs. derde, het aantal protocol gebaseerde vergelijkende studies onderzoeken ideaal weefsel voorbereiding technieken en proefomstandigheden voor PP en TFH is onderzoek vrij beperkt.

Huidige protocol gebaseerde studies voorgesteld voor PP cel voorbereiding19,20,21,22 waren niet TFH- of GC B-cel-georiënteerd. Bovendien, sommige weefsel voorbereiding voorwaarden aanbevolen voor PPs19,20 zoals collagenase gebaseerde spijsvertering bleken de uitkomst van TFH identificatie negatief beïnvloeden door stroom cytometry18. Op deze basis redeneerde wij dat een geoptimaliseerde, gestandaardiseerde en reproduceerbare protocol dat kan worden gebruikt voor het bestuderen van TFH en GC B cel dynamiek binnen PPs zou waardevol zijn onderzoekers bezig met dit onderwerp. Deze behoefte gaf ons de impuls voor het genereren van een verbeterde en bijgewerkte protocol voor de isolatie en de karakterisering van PP lymfocyten die fijn is geoptimaliseerd voor cellulaire herstel, levensvatbaarheid en efficiëntie voor de karakterisering van het cytometrische van de stroom van verschillende T en B deelverzamelingen van de cel. We wilde ook uitsluiten van de verschillende stappen van de moeizame voorbereiding voorgesteld in eerdere protocollen, daardoor, vermindering van de vereiste manipulaties en tijd voor de voorbereiding van de weefsels en cellen van PPs.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Alle studies en experimenten beschreven in dit protocol werden uitgevoerd onder richtlijnen volgens institutionele Animal Care en gebruik Comité (IACUC) van Beth Israël diaken Medical Center.

1. de ontwerpen van experimentele opstelling en muis groepen

  1. (Optioneel) Samen het huis van de experimentele muizen om horizontale overdracht van darmflora tussen experimentele muizen en om niet-specifieke variabiliteit binnen PP lymfocyten. Daarnaast gebruiken littermate besturingselementen van hetzelfde geslacht te minimaliseren variabiliteit.

2. chirurgische excisie en weefsel voorbereiding stappen:

  1. Chirurgische verwijdering van de dunne darm (SI)
    1. Muizen met behulp van CO2 verstikking of een equivalente methode goedgekeurd door de Commissie institutionele dierenethiek euthanaseren.
    2. De muis overbrengen in een speciaal gebied voor chirurgische excisie. Plaats van de achterkant naar beneden en zuiveren van de buik met 70% ethanol. Een laparotomie uitvoeren door het snijden van de buikhuid en buikvlies langs de middellijn van het schaambeen aan de ribbenkast, waardoor de peritoneale holte.
      Opmerking: Voer de eerste incisie op een relatief klein gebied van de huid penetreren de peritoneale Holte en beschadigen intestinale weefsel te voorkomen. Blijven de besnijdenis tot gewenste anatomische grens.
    3. Identificeer het caecum, die is een ideale mijlpaal voor de detectie van de terminal ileum, hetgeen het distale deel van de dunne darm.
      Opmerking: Caecum bevindt zich meestal op de lagere linkerkant van de buik van de muis.
    4. Ileocaecale junction lokaliseren en maken een cut op dit niveau als distale mogelijk te scheiden van de dunne darm van het caecum. Gedurende de volgende stappen, Vermijd buitensporige fysiek contact met de darmwand omdat kwetsbare PPs gemakkelijk op aanraking samenvouwen.
    5. Verwijder voorzichtig de hele dunne darm tot de pyloric sphincter door het snijden van het mesenterium met behulp van schaar. Identificeren van de kruising tussen de Maagportier en twaalfvingerige darm en de twaalfvingerige darm op dit niveau, die leiden zal tot volledige detachement van dunne darm vanuit de buikholte snip.
      Opmerking: (i) vermijden Hyperextensie aangezien dit de breuk van de darmwandzou kunnen veroorzaken. (ii) als LP lymfocyt isolatie is gewenst naast PP lymfocyten, volledige verwijdering van de mesenterische vet is nodig. Voor PP alleen op isolatie, kan resterende mesenterische vet evenwel enkele voordelen tijdens de verdere stappen van de isolatie; dus moet het worden gehandhaafd.
    6. Vrijstaand dunne darmen plaats in een 6-well bord gevuld met koude RPMI + 10% foetale runderserum (FBS) en zachtjes de weefsels handmatig doorroeren totdat alle intestinale segmenten zijn ondergedompeld in de koude media. Het handhaven van de weefsels op ijs in de volgende stappen.
    7. Na de ontrafeling van het gewenste aantal muis dunne darmen, overgaan tot PP excisie van verzamelde dunne darmen.
  2. Chirurgische excisie van PPs en voorbereiding van eencellige schorsing:
    1. Zachtjes overdragen van de dunne darm op een papieren handdoek door de mesenterische vet met behulp van de verlostang aangrijpend en plaats de mesenterische zijde naar de papieren handdoek. Bevochtig het hele intestinale segment met koude RPMI + 10% FBS weefsel uitdroging en kleverigheid te voorkomen.
      Opmerking: Resterende mesenterische vet kunnen nuttig zijn in dit stadium omdat vetweefsel segmenten op de mesenterische site van SI aan de papieren handdoek houden van de anti-mesenterische site naar vasthouden zal boven.
    2. Het identificeren van de Pod, die worden weergegeven als wit multi lobulated aggregaten in de vorm van een "bloemkool-achtige" op de anti-mesenterische kant van de darmwand.
      Opmerking: Flushing uit de luminal inhoud is niet aanbevolen totdat alle PPs worden weggesneden. Legen van de luminal inhoud kan leiden tot de ineenstorting van de PPs en het kleurcontrast tussen PPs en de darmwand, die zeer nuttig is voor de visuele identificatie van PPs zal voorkomen.
    3. Na het identificeren van PPs aan de anti-mesenterische kant, plaats de chirurgische gebogen-einde scissor op PPs (kromme moet trotseren) beteugeling van de PP van de distale en proximale rand.
      Optioneel: Duw de PP zachtjes richting de messen van schaar met een vingertop. Deze manoeuvre zal leiden tot betere uitsluiting van het omgevende weefsel van de niet-PP. Accijnzen de PPs zachtjes, met uitzondering van het omringende weefsel van de darm.
      Opmerking: (i) deze stap is cruciaal voor het verkrijgen van maximale opbrengst van de cel van de PP terwijl het minimaliseren van de cel besmetting van naburige intestinale compartimenten zoals LP en intestinale epitheel, die ook rijk aan T-cellen zijn. (ii) vanaf één SI weggesneden uit C57BL/6 muis, kunnen 5-10 PPs (gemiddelde grootte, multi lobulated) worden verzameld. Door te streven naar nog kleinere PPs (niet multi lobulated), verzameling van maximaal 12-13 KKS per muis (C57BL/6) is mogelijk met behulp van dit protocol.
    4. Overdracht de verwijderde PPs op een 12-well weefselkweek bord gevuld met ijskoude RPMI + 10% FBS en behouden op ijs met pincet of gebogen chirurgische scharen.
      Opmerking: (i) onmiddellijk na excisie van PPs, slijm en intestinale inhoud op het oppervlak van PP kunnen worden gereinigd door het weefsel voorzichtig wrijven op een papieren handdoek. Deze stap zal helpen verbeteren van de levensvatbaarheid van PP lymfocyten. (ii) in plaats van het overbrengen van de PPs naar een plaat, kan overzetten naar gescheiden buizen ook worden beschouwd afhankelijk van aantal van de totale steekproef.
    5. Optioneel: Wanneer PP excisie en latere plaatsing in de plaat goed zijn voltooid, het aantal en de grootte van PPs verzameld uit verschillende experimentele/muis groepen kunnen worden gedocumenteerd door het nemen van een foto van de plaat van de weefselkweek met PPs.
    6. Bereid een reeks van 50 mL conische buizen gevuld met 25 mL van RPMI + 10% FBS (vooraf opgewarmd bij 37 ° C). Met behulp van een paar van schaar, knip de rand van een 1.000 µL-tip van de afstand waarmee het streven van de KKS met 1 mL pipet. De KKS met 1 mL pipet gecombineerd en overbrengen van de 12-well weefselkweek plaat naar de conische buisjes bereid 50 mL.
      Opmerking: Gebruik een nieuwe tip voor elk monster muis te voorkomen van kruisbesmetting tussen de monsters.
    7. Beveilig het deksel en verticaal plaatsen van de buizen in een roteerschudapparaat bij 37 ° C, met continue agitatie bij 125 – 150 omwentelingen per minuut gedurende 10 minuten. Ondertussen bereiden een nieuwe set van 50 mL tubes en plaats een 40 µm cel zeef op de bovenkant van elke buis, waardoor één celsuspensie zal worden opgesteld.
      Opmerking: (i) de agitatie stap verwijdert het resterende intestinale inhoud, slijm en cel puin, die de levensvatbaarheid van de cellen en het herstel van PP lymfocyten te verminderen als niet verwijderd. (ii) niet van toepassing elk soort spijsverteringsenzymen op PP weefsel omdat het spijsverteringsproces een dramatisch verlies van CXCR5-expressie aan vanaf het celoppervlak veroorzaakt.
    8. Na de agitatie, door de KKS te overbrengen in de 40 µm cel zeef geplaatst op de top van de onlangs bereid conische 50 mL tubes. Met behulp van de afgeronde kant van de zuiger van een 10 mL spuit, zachtjes verstoren de PPs door de zeef van de cel voor het genereren van één celsuspensie. Spoel de zeef met 15-20 mL koude RPMI + 10% FBS.
      Opmerking: (i) vóór filtering, schud de buizen met de PPs horizontaal. Deze korte shake vergemakkelijkt de overdracht van PPs in cel vulinrichtingen. (ii) het gebruikmaken van een 70 µm cel zeef voor de isolatie van niet-lymfoïde immuuncellen (bv., monocyten, macrofagen, DCs) wordt aanbevolen.
    9. Centrifugeer de eencellige schorsingen bij 350 – 400 x g gedurende 10 minuten bij 4 ° C.
    10. Zorgvuldig Verwijder het supernatant en resuspendeer de cellen bij een concentratie van 10 x 106 cellen/mL. Met behulp van een hemocytometer cellen tellen.
      Opmerking: (i) voorafgaand aan het tellen van de cel, het nummer van de cel Totaal voor elke muis PP-groep kan worden ongeveer geschat met behulp van de volgende formule: "0,5-1 x 106 cellen x (aantal PPs) = cel totaal tellen". Verdere verdunningen met trypan blauw voor het tellen van de cel kunnen het nodig zijn. (ii) als alternatief voor het handmatig tellen, kunnen geautomatiseerde cel items worden gebruikt.
    11. Overdracht van 2-2,5 x 106 cellen in passende omvang (bv., 200 µL) in een 96-Wells ronde-bodemplaat.
      Opmerking: Voor één kleur en negatieve controlemonsters, 0,5-1 x 106 cellen mogelijk voldoende.
    12. Centrifugeer de plaat bij 350 x g gedurende 5 min bij 4 ° C. Flick van de plaat.
    13. Wassen van de cellen in 200 µL van kleuring Buffer.

3. oppervlakte antilichaam kleuring

  1. Levensvatbaarheid kleuring:
    1. Na de definitieve wash, resuspendeer de cellen in 100 μl van corrigeerbare levensvatbaarheid kleurstof verdund in PBS (1:1, 000). Incubeer gedurende 30 min op ijs of bij 4 ° C in het donker.
      Opmerking: (i) de intracellulaire kleuring voor het opsporen van belangrijke transcriptie factoren zoals Foxp3 of Bcl-6 vereist fixatie van de cellen. In dat geval niet-corrigeerbare levensvatbaarheid kleurstoffen (bv., 7-AAD, DAPI) kan niet worden gebruikt. (ii) om te verdunnen corrigeerbare levensvatbaarheid kleurstof, gebruik niet elke kleuring buffer die eiwitten bevatten. De media die worden gebruikt in deze stap moet worden proteïne-vrij. (iii) de uitsluiting van dode cellen met behulp van levensvatbaarheid kleuring is cruciaal omdat dode cellen ernstige technische moeilijkheden bij het stroom cytometry analyse veroorzaken kunnen door de uitstoot van autofluorescence en door nonspecifically, oppervlakte antilichamen te binden die tot valse leiden kunnen positieve resultaten.
    2. Wassen van de cellen tweemaal met de kleuring van de buffer. Centrifugeer bij 350 x g gedurende 5 min bij 4 ° C. Flick van de plaat.
  2. FC blok en oppervlakte - laag I:
    1. Bereid de oplossing van de Fc-blok door verder verdunnen van anti-CD16/32 antilichaam (1:200) in de kleuring van de buffer.
    2. Resuspendeer de cellen in 20 μL van bereide oplossing van de Fc-blok. Incubeer gedurende 15 minuten op het ijs.
    3. Zonder wassen, toevoegen 80 μL van oppervlakte antilichaam cocktail (Zie tabel 1 voor het antilichaam samenvatting) in passende verdunningen bereid. Incubeer op ijs voor minstens 30 min.
    4. Wassen tweemaal door het toevoegen van buitensporige kleuring buffer. Centrifugeer bij 350 x g gedurende 5 min bij 4 ° C. Flick van de plaat.
  3. Oppervlakte - laag II:
    1. Daar kleurstofoplossing bereid door verdunning van fluorescerende-geconjugeerde daar in kleuring buffer.
    2. Na de definitieve wash, resuspendeer de cellen met 100 μl van vooraf verdunde streptavidine (1:100) kleurstofoplossing. Incubeer gedurende minstens 15 min op ijs in het donker.
    3. Wassen tweemaal met de kleuring van de buffer. Centrifugeer bij 350 x g gedurende 5 min bij 4° C. Flick van de plaat.
      Optioneel: Als intracellulaire kleuring voor folliculaire regelgevende T cel detectie niet, na de laatste wash gewenst is, resuspendeer de cellen in 200 μL van kleuring buffer en overdracht in passende buizen om gegevens in de stroom cytometer te vergaren. Wanneer de monsters niet vast zijn, moet overname van gegevens door stroom cytometry plaatsvinden binnen 3-4 uur om nauwkeurige resultaten te verkrijgen.

4. cel fixatie

  1. Bereiden fixatie/permeabilization (Fix/Perm) werkende oplossing met behulp van de reagentia van het Foxp3/transcriptie Factor kleuring Buffer ingesteld. Meng één-deel van fixatie/permeabilization concentraat met drie delen van fixatie/permeabilization naar de gewenste eindvolume verdunningsmiddel.
  2. Na de definitieve wash, resuspendeer de cellen in 200 μL van de werkoplossing voor Fix/permanent.
  3. Incubeer de plaat op ijs of bij 4 ° C gedurende 20 minuten. 20 min voor deze stap niet overschrijden. Langere incubatietijd kan ernstig verminderen het herstel van de cel.
  4. Centrifugeer bij 350 x g gedurende 5 min bij 4 ° C. Flick van de plaat. (Optioneel) Na deze stap, vaste cellen kunnen worden opgeslagen voor meerdere dagen bij 4 ° C in de buffer met bovien serumalbumine (BSA) kleuring of FBS tot latere intracellulaire kleuring of stroom cytometry acquisitie.
  5. Resuspendeer de cellen in 200 μL van permeabilization Buffer (x1) vers vooraf verdund in gezuiverde gedeïoniseerd water.
  6. Centrifugeer bij 350 x g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur (RT).
  7. Een keer wassen met 200 μL van permeabilization buffer en centrifugeer bij 350 x g gedurende 5 min op RT.

5. de intracellulaire kleuring

  1. Bereid de oplossing van de Fc-blok door verder verdunnen van anti-CD16/32 antilichaam (1:200) in permeabilization buffer.
    Opmerking: Na de fixatie stap, de cellen moeten worden gehandhaafd in de buffer van de permeabilization tot het einde van het intracellulaire kleuring proces.
  2. Na de definitieve wash, resuspendeer de cellen in 20 μL van Fc-blok oplossing. Incubeer gedurende 10-15 min. op RT in het donker.
  3. Zonder wassen, Voeg 80 μL van intracellulaire antilichaam cocktail (100 μl eindvolume) vooraf verdund in permeabilization buffer. Incubeer gedurende 30 min op RT.
  4. Voeg 100 μl van Perm Buffer en centrifuge bij 350 x g gedurende 5 min op RT.
  5. Een keer wassen met 200 μL van permeabilization buffer, centrifugeer bij 350 x g gedurende 5 min op RT.
  6. Na de definitieve wash, resuspendeer de cellen in 200 μL van kleuring van buffer en overdracht van de cellen in passende buizen (eindvolume van 400 μL in kleuring buffer) en gegevens verwerven door stroom cytometry. Monsters gekleurd in 96-wells-plaat kunnen ook worden uitgevoerd zonder overgeplaatst naar buizen als een stroom cytometer met plaat lezer optie beschikbaar is. Deze stap minimaliseert cel verlies tijdens het overbrengen van de cel.
  7. Een minimum van 5 x 105 totaal aantal cellen op de stroom cytometer om reproduceerbare analyse van TFH, TFR te kunnen verwerven alsmede GC B cellen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

In tegenstelling tot een vorige protocol20, wij hebben geconstateerd dat PPs niet gelijkelijk zijn verdeeld in de SI maar meer dichtbevolkte zijn gelokaliseerd aan de uiteinden van het distale en proximale van de SI zoals in figuur 1A. Stroom cytometrische analyse toonde aan dat, indien correct gevolgd, ons protocol geeft een PP lymfocyten bevolking waaruit naar voren-naast scatter distributie vergeli...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Hier beschrijven we een protocol dat is geoptimaliseerd voor de karakterisering van het cytometrische van de stroom van TFH en GC B cellen. Een van de grote voordelen van onze protocol is dat hierdoor het isolement van maximaal 107 (gemiddeld 4-5 x 106 cellen) totale PP cellen uit een enkele muis (C57BL/6-stam) zonder enige spijsvertering proces. We hebben vastgesteld dat de cel Totaal opbrengst was positief gecorreleerd met het aantal PPs en van de volgende eenvoudige vergelijking die nuttig is voo...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

Geen belangenconflicten verklaard.

Dankbetuigingen

Wij wil Laura Strauss en Peter Sage dank voor nuttige discussies en steunen met stroom cytometry analyses.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
anti-mouse CD4 antibodyeBioscience, Biolegend*17-0041-81,10054*Zie Tabel 1 voor gedetailleerde informatie
anti-mouse CD19 antibodyeBioscienceMA5-16536Zie Tabel 1 voor gedetailleerde informatie
anti-mouse PD-1 antibodyeBioscience61-9985-82Zie Tabel 1 voor gedetailleerde informatie
anti-mouse ICOS antibodyeBioscience12-9942-82Zie Tabel 1 voor gedetailleerde informatie
anti-mouse GL7 antibodyBiolegend144610Zie Tabel 1 voor gedetailleerde informatie
anti-mouse CXCR5 antibodyBiolegend*, BD Bioscience145512*, 551960Zie Tabel 1 voor gedetailleerde informatie
anti-mouse BCL-6 antibodyBiolegend358512Zie Tabel 1 voor gedetailleerde informatie
anti-mouse Foxp3 antibodyeBioscience17-5773-82Zie Tabel 1 voor gedetailleerde informatie
Streptavidin-BV421BD Bioscience563259Zie Tabel 1 voor gedetailleerde informatie
FixableViability DyeeBioscienceL34957Zie Tabel 1 voor gedetailleerde informatie
7AADBiolegend420404Zie Tabel 1 voor gedetailleerde informatie
FcBlock (CD16/32)BD Bioscience553141Zie Tabel 1 voor gedetailleerde informatie
Collagenase IIWorthingtonLS004176
Collagenase IVWorthingtonLS004188
Foxp3/Transcription Factor Staining Buffer SeteBioscience00-5523-00
6-well,12-well & 96-well platesFalcon/Corning353046,353043/3596
50 mL conical tubesFalcon3520
40 µm cell strainerFalcon352340
10 mL syringe-plungerExel INT26265
RPMICorning15-040-CV
PBSCorning21-040-CM
FBSAtlanta BiologicalsS11150
Orbital shakerVWRModel 200
Curved-end scissor
Fine Serrated Forceps
Small curved scissor

Referenties

  1. van den Berg, T. K., van der Schoot, C. E. Innate immune ‘self’ recognition: a role for CD47-SIRPα interactions in hematopoietic stem cell transplantation. Trends in Immunology. 29 (5), 203-206 (2008).
  2. Mowat, A. M., Agace, W. W. Regional specialization within the intestinal immune system. Nature Reviews Immunology. 14 (10), 667-685 (2014).
  3. Reboldi, A., Cyster, J. G. Peyer’s patches: Organizing B-cell responses at the intestinal frontier. Immunological Reviews. 271 (1), 230-245 (2016).
  4. Heel, K. A., McCauley, R. D., Papadimitriou, J. M., Hall, J. C. Review: Peyer’s patches. Journal of Gastroenterology and Hepatology. 12 (2), 122-136 (1997).
  5. Fagarasan, S., Kinoshita, K., Muramatsu, M., Ikuta, K., Honjo, T. In situ class switching and differentiation to IgA-producing cells in the gut lamina propria. Nature. 413 (6856), 639-643 (2001).
  6. Hopkins, S. A., Niedergang, F., Corthesy-Theulaz, I. E., Kraehenbuhl, J. P. A recombinant Salmonella typhimurium vaccine strain is taken up and survives within murine Peyer’s patch dendritic cells. Cellular Microbiology. 2 (1), 59-68 (2000).
  7. Shreedhar, V. K., Kelsall, B. L., Neutra, M. R. Cholera toxin induces migration of dendritic cells from the subepithelial dome region to T- and B-cell areas of Peyer's patches. Infection and Immunity. 71 (1), 504-509 (2003).
  8. Sato, A., Iwasaki, A. Peyer’s patch dendritic cells as regulators of mucosal adaptive immunity. Cellular and Molecular Life Sciences. 62 (12), 1333-1338 (2005).
  9. Bemark, M., Boysen, P., Lycke, N. Y. Induction of gut IgA production through T cell-dependent and T cell-independent pathways. Annals of the New York Academy of Sciences. 1247 (1), 97-116 (2012).
  10. Fagarasan, S., Kawamoto, S., Kanagawa, O., Suzuki, K. Adaptive Immune Regulation in the Gut: T Cell-Dependent and T Cell-Independent IgA Synthesis. Annual Review of Immunology. 28, 243-273 (2010).
  11. Hase, K., et al. Uptake through glycoprotein 2 of FimH + bacteria by M cells initiates mucosal immune response. Nature. 462 (7270), 226-230 (2009).
  12. Wu, H., et al. An Inhibitory Role for the Transcription Factor Stat3 in Controlling IL-4 and Bcl6 Expression in Follicular Helper T Cells. Journal of Immunology. 195 (5), 2080-2089 (2015).
  13. Vinuesa, C. G., Tangye, S. G., Moser, B., Mackay, C. R. Follicular B helper T cells in antibody responses and autoimmunity. Nature Reviews Immunology. 5 (11), 853-865 (2005).
  14. Victora, G. D., Nussenzweig, M. C. Germinal Centers. Annual Review of Immunology. 30, 429-457 (2012).
  15. Vaeth, M., et al. Store-Operated Ca2+Entry in Follicular T Cells Controls Humoral Immune Responses and Autoimmunity. Immunity. 44 (6), 1350-1364 (2016).
  16. Meli, A. P., et al. The Integrin LFA-1 Controls T Follicular Helper Cell Generation and Maintenance. Immunity. 45 (4), 831-846 (2016).
  17. Fu, W., et al. Deficiency in T follicular regulatory cells promotes autoimmunity. Journal of Experimental Medicine. 215 (3), 815-825 (2018).
  18. Espéli, M., Walker, J. M. T follicular helper cells - Methods and Protocols. , (2015).
  19. Couter, C. J., Surana, N. K. Isolation and Flow Cytometric Characterization of Murine Small Intestinal Lymphocytes. Journal of Visual Experiments. (111), e54114(2016).
  20. De Jesus, M., Ahlawat, S., Mantis, N. J. Isolating And Immunostaining Lymphocytes and Dendritic Cells from Murine Peyer’s Patches. Journal of Visual Experiments. (73), e50167(2013).
  21. Pastori, C., Lopalco, L. Isolation and in vitro Activation of Mouse Peyer’s Patch Cells from Small Intestine Tissue. Bio-protocol. 4 (21), e1282(2014).
  22. Fukuda, S., Hase, K., Ohno, H. Application of a Mouse Ligated Peyer’s Patch Intestinal Loop Assay to Evaluate Bacterial Uptake by M cells. Journal of Visual Experiments. (58), 3225(2011).
  23. Naito, Y., et al. Germinal Center Marker GL7 Probes Activation-Dependent Repression of N-Glycolylneuraminic Acid, a Sialic Acid Species Involved in the Negative Modulation of B-Cell Activation. Molecular and Cellular Biology. 27 (8), 3008-3022 (2007).
  24. Bollig, N., et al. Transcription factor {IRF4} determines germinal center formation through follicular T-helper cell differentiation. Proceedings of the National Academy of Science of U. S. A. 109 (22), 8664-8669 (2012).
  25. Pérez-Mazliah, D., et al. Follicular Helper T Cells are Essential for the Elimination of Plasmodium Infection. EBioMedicine. 24, 216-230 (2017).
  26. Sage, P. T., Sharpe, A. H. T follicular regulatory cells in the regulation of B cell responses. Trends Immunology. 36 (7), 410-418 (2015).
  27. Van Damme, N., et al. Chemical agents and enzymes used for the extraction of gut lymphocytes influence flow cytometric detection of T cell surface markers. Journal of Immunological Methods. 236 (1-2), 27-35 (2000).
  28. Meenan, J., et al. Altered expression of alpha 4 beta 7, a gut homing integrin, by circulating and mucosal T cells in colonic mucosal inflammation. Gut. 40 (2), 241-246 (1997).
  29. Cao, A. T., et al. Interleukin (IL) -21 promotes intestinal IgA response to microbiota. Mucosal Immunology. 8 (5), 1072-1082 (2015).
  30. Wei, J., et al. Autophagy enforces functional integrity of regulatory T cells by coupling environmental cues and metabolic homeostasis. Nature Immunology. 17 (3), 277-285 (2016).
  31. Autengruber, A., Gereke, M., Hansen, G., Hennig, C., Bruder, D. Impact of enzymatic tissue disintegration on the level of surface molecule expression and immune cell function. European Journal of Microbiology & Immunology. 2 (2), 112-120 (2012).
  32. Trapecar, M., et al. An Optimized and Validated Method for Isolation and Characterization of Lymphocytes from HIV+ Human Gut Biopsies. AIDS Research and Human Retroviruses. 33 (S1), (2017).
  33. Bergqvist, P., Gardby, E., Stensson, A., Bemark, M., Lycke, N. Y. Gut IgA Class Switch Recombination in the Absence of CD40 Does Not Occur in the Lamina Propria and Is Independent of Germinal Centers. Journal of Immunology. 177 (11), 7772-7783 (2006).
  34. Keil, B., Gilles, A. M., Lecroisey, A., Hurion, N., Tong, N. T. Specificity of collagenase from Achromobacter iophagus. FEBS Letters. 56 (2), 292-296 (1975).
  35. Mora, J. R., et al. Selective imprinting of gut-homing T cells by Peyer’s patch dendritic cells. Nature. 424 (6944), 88-93 (2003).
  36. Reboldi, A., et al. Mucosal immunology: IgA production requires B cell interaction with subepithelial dendritic cells in Peyer’s patches. Science. 352 (6287), (2016).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Meer artikelen verkennen

FlowcytometrieTFH-cellenkiemcentrum-B-cellencelkleuringantilichaampanelweefseldigestiecelviabiliteitCXCR5-expressie
Ontrafeling van de hoofdrolspelers van de Humorale immuniteit: geavanceerde en geoptimaliseerd lymfocyt isolatie Protocol van RattenUitrustingen Peyer van Patches
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.