Methodenartikel

Een lus-gemedieerde isotherme amplificatie (LAMP) Assay voor snelle identificatie van Bemisia tabaci

DOI:

10.3791/58502

⸱

29 oktober 2018

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Method Development and Analytics, Agroscope, 2Swiss Tropical and Public Health Institute, 3University of Basel, 4Swiss Federal Plant Protection Service, Federal Office for Agriculture, 5OptiGene Limited, 6Fera Science Limited, 7School of Natural and Environmental Sciences, Newcastle University, 8Department of Plants and Plant Products, Agroscope

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Deze paper meldt het protocol voor een snelle identificatie assay voor Bemisia tabaci gebaseerd op lus-gemedieerde isotherme amplificatie (LAMP) technologie. Het protocol vereist minimale laboratorium opleiding en kan, daarom, ter plaatse op de punten van binnenkomst voor de plant invoer zoals zeehavens en luchthavens worden uitgevoerd.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De wittevlieg Bemisia tabaci (Gennadius) is een invasieve plaag van groot belang, voor de productie van plantaardige en decoratieve gewassen in veel landen over de hele wereld. Ernstige opbrengst verliezen worden veroorzaakt door rechtstreekse vervoedering, en nog belangrijker, ook door de overdracht van meer dan 100 schadelijke pathogene plantenvirussen. Wat betreft andere invasieve plagen vergemakkelijkt meer internationale handel de versnippering van B. tabaci naar gebieden buiten het oorspronkelijke bereik. Inspecties van plant importeren producten op plaatsen van binnenkomst zoals zeehavens en luchthavens zijn, dus gezien als een belangrijke preventieve maatregel. Deze laatste lijn van verdediging tegen invallen van de pest is echter alleen doeltreffend zijn als snelle identificatiemethoden voor verdachte insect specimens beschikbaar zijn. Want de morfologische differentiatie tussen de gereglementeerde B. tabaci en nauwe verwanten zonder quarantainestatus moeilijk voor niet-taxonomen, een snelle identificatie van moleculaire test gebaseerd op de ()-lus-gemedieerde isotherme amplificatie is LAMP) technologie heeft ontwikkeld. Deze publicatie rapporteert het gedetailleerd protocol van de roman assay beschrijven snelle DNA-extractie, de set-up van de reactie van de LAMP, evenals de interpretatie van de uitlezing, waarmee het identificeren van B. tabaci exemplaren binnen één uur. In vergelijking met de bestaande protocollen voor het opsporen van specifieke B. tabaci biotypes, de ontwikkelde methode richt zich op de gehele B. tabaci soorten complex in één assay. Bovendien beoogt de bepaling die ter plaatse door de plant gezondheidsinspecteurs met minimale laboratorium opleiding direct bij de punten van binnenkomst worden toegepast. Grondige validatie uitgevoerd onder on-site laboratorium toont aan dat de gerapporteerde LAMP assay een hulpprogramma voor snelle en betrouwbare identificatie is, verbetering van het beheer van B. tabaci.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De wittevlieg Bemisia tabaci (Gennadius) is een invasieve insect plaag beïnvloeden het rendement van vele economisch belangrijke gewassen, met inbegrip van siergewassen, groenten, peulvruchten en katoen1,2. Naast schade via directe floëem-voeding, schaadt de homopteran soorten planten niet indirect door de uitscheiding van grote hoeveelheden van honingdauw op de oppervlakken van bladeren en vruchten, evenals door de overdracht van talrijke plant pathogene virussen1 , 3 , 4. recente genetische studies vergelijken van DNA sequenties van het mitochondriaal gen cytochroom c oxidase 1 (COI) bleek dat B. tabaci een is complex van ten minste 34 morphocryptic soorten-3,4. Twee zeer invasieve en schadelijke leden binnen dit complex, biotype B afkomstig uit het Midden-Oosten en de Aziatische kleine regio, evenals biotype Q die afkomstig zijn uit het Middellandse-Zeegebied hebben wereldwijd zijn verspreid via de internationale handel activiteiten met plantaardige producten, met name door het vervoer van siergewassen1,5,6. Als gevolg van de status ervan wereldwijd pest, de Internationale Unie voor het behoud van de natuur en de natuurlijkehulpbronnen (IUCN) B. tabaci als één van de "werelds 100 slechtste invasieve exoten" en leden van de complexe soorten die vermeld gereglementeerde organismen door veel landen1,3,4.

In de Europese Unie (EU), wordt B. tabaci vermeld in de bijlage van Plant Health Richtlijn 2000/29/EG 1AI zoals een quarantaine organisme waarvan invoering van niet-EU-landen en de verspreiding ervan binnen de EU zijn verboden4. Een essentiële preventieve maatregel tegen de verspreiding van quarantaineorganismen is de controle op plant verzendingen op punten van binnenkomst (POEs) zoals luchthavens en zeehavens7,8. In het geval wordt een quarantaine organisme aangetroffen, wordt de nationale Plant bescherming organisatie (NPPO) verantwoordelijke actie onderneemt door afwijzing of behandeling (met inbegrip van vernietiging) van de besmette verzending9. Officieren inspecteren de invoer vaak hoeft echter niet de taxonomische expertise om te nauwkeurig identificeren de enorme waaier van pest soorten wereldhandel9is gekoppeld. Met name de identificatie van onvolwassen levensfasen (bijv, eieren en larven) zonder verschillende morfologische sleutels is vrijwel onmogelijk voor niet-taxonomen8,9,10. Bijgevolg, teneinde uitvoering van quarantaine maatregelen met minimale vertraging, er is behoefte aan een alternatieve, snelle on-site identificatie assays9.

Een kandidaat-methode is de lus-gemedieerde isotherme amplificatie (LAMP) technologie van DNA die onlangs is gebleken een geschikte technologie voor de identificatie van plant ziekteverwekkers11,12,13. LAMP is zeer specifiek, omdat de methode maakt gebruik van ten minste twee primerparen herkennen van zes verschillende DNA doel sequenties14. Dankzij de DNA strand displacement activiteit van de polymerase van DNA van Bst , worden LAMP reacties uitgevoerd onder isotherme voorwaarden14. Vandaar, in tegenstelling tot conventionele polymerase-kettingreactie (PCR)-gebaseerd testen er is geen noodzaak voor een thermische cycler13,14. Een ander voordeel ten opzichte van PCR-gebaseerde testen is haar veerkracht tegen potentiële remmers in het DNA-extract, de behoefte aan een DNA zuivering stap13te omzeilen. Als gevolg van het protocol van de snelheid en eenvoud, kan de LAMP zelfs ter plaatse omstandigheden met behulp van een draagbaar, batterij gedreven real-time detectie apparaat8,15worden uitgevoerd.

Een LAMP assay werd ontworpen in reactie op de vraag voor een snelle on-site identificatiemethode voor B. tabaci8. Het overkoepelende doel was het ontwikkelen van een protocol dat kan worden uitgevoerd door inspecteurs van plant gezondheid met beperkte laboratorium opleiding. Een sterke focus was, daarom instellen voor het optimaliseren van de snelheid en de eenvoud van het protocol. Terwijl de bestaande diagnostische tests zijn over het algemeen ontwikkeld voor de identificatie van één of meerdere biotypes van B. tabaci, de nieuwe LAMP assay behandelt de hele B. tabaci soorten complexe8,16,17 ,18. Het probleem van de diversiteit van de uitgesproken genetische binnen-taxon van het complex was opgelost met behulp van combinaties van verschillende primer verzamelingen en de toepassing van gedegenereerde primers8. De roman B. tabaci LAMP assay is ontworpen op een zodanige wijze dat de inleidingen een fragment aan de 3' eind van de mitochondriale COI gen8 richten. Dit gen presenteert een geschikte doelgroep voor dierlijke diagnostische testen omdat het herbergt regio's behouden genoeg om diagnostische gevoeligheid voor een bepaalde soorten, terwijl het discrimineren genoeg tussen nauw verwant organismen19, 20. bovendien de COI-gen wordt vaak gebruikt als een genetische marker in genetische bevolkingsonderzoeken en als een sequentie van de handtekening in DNA barcoding analyses, resulterend in talrijke DNA reeks vermeldingen in open brongegevensbestanden zoals GenBank en BOLD21 ,22. Naast het openbaar COI-sequenties van B. tabaci, COI sequenties van nauw verwante soorten (Aleurocanthus spp. [N = 2], Aleurochiton aceris, Aleurodicus dugesii, Bemisia spp. [N = 3], Neomaskellia andropogonis, Tetraleurodes acaciaeen Trialeurodes spp. [N = 4]) werden opgenomen in het ontwerp van de inleiding van deze studie en gebruikt voor het beoordelen van diagnostische gevoeligheid en specificiteit in silico8 .

Als gevolg van de nauwkeurigheid van de methode, de snelheid (< 1 h) en de eenvoud van het protocol, de bepaling heeft aangetoond dat geschikt voor on-site toepassing wanneer uitgevoerd als onderdeel van de importprocedure voor de controle op een Zwitserse POE-8.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. voorbereiding

  1. Voorbereiding aliquots van alkalische DNA-extractie-oplossing.
    1. Produceren van een voorraad van DNA extractie alkalisch met behulp van moleculaire rang water aangevuld met 600 µM kaliumhydroxide (KOH) en 2 µM Cresol rood.
      Let op: KOH is een sterke base opgelost in water. Morsen van vloeistoffen, en huid- en oogcontact vermijden.
    2. Afzien van 30 µL van alkalische DNA extractieoplossing (bereid in stap 1.1.1) in 0,5 mL microcentrifuge buizen en slaan de aliquots bij 4 ° C.
      Opmerking: Gebruik de aliquoted DNA-extractie-oplossing binnen 1 jaar.
  2. Voorbereiding B. tabaci positieve versterking controle (PAC).
    1. Genereren van PCR waarbij van het fragment van de DNA van het doel van LAMP.
      Opmerking: Een inleiding in algemene PCR beginselen en praktijken wordt gegeven door Lorenz23.
      1. Synthetiseren of verkrijgen van de inleidingen C1-J-2195 (5'-TTGATTTTTTGGTCATCCAGAAGT-3') en TL2-N-3014 (5'-TCCAATGCACTAATCTGCCATATTA-3 ') een fragment van de mitochondriale COI gen24,25te versterken.
      2. Instellen van de PCR-reactie zoals beschreven in tabel 1. Gebruik van DNA-extract (zie stap 2.1) voor een verwijzing B. tabaci specimen als DNA sjabloon.
        Opmerking: Optioneel, het is mogelijk om op te halen van de B. tabaci DNA voor de PAC met behulp van een commerciële kit volgens de instructies van de fabrikant.
      3. Program een thermische cycler met behulp van de volgende voorwaarden: 15 min bij 95 ° C; 45 cycli van 40 s bij 95 ° C, 15 bij 45 ° C, speedramp van meer dan 60 s s tot 60 ° C, 2 min bij 72 ° C; 7 min bij 72 ° C; Houd bij 4 ° C.
      4. Reinig de PCR versterking product met behulp van een commerciële PCR schoonmaak kit volgens protocol van de fabrikant en elueer het eindproduct in moleculaire rang water.
      5. Gebruik een commerciële kit met kleurstof DNA-intercalating voor het meten van de concentratie van DNA van het PCR-amplificatie product volgens de instructies van de fabrikant en Verdun met moleculaire rang water tot een concentratie van 1 ng / µL. Bewaar de verdunde PCR versterking product als PAC stockoplossing bij-20 ° C.
        Opmerking: Gebruik de PAC stockoplossing binnen 1 jaar.
      6. Aanvulling van de PAC stockoplossing (bereid in stap 1.2.1.5) met 0,6 µM KOH en Verdun met moleculaire rang water tot een concentratie van 5 x 10-3 ng / µL. Bewaar het product bij 4 ° C.
        Opmerking: Gebruik de PAC binnen 5 uur voor de voorbereiding van de kant-en-klare B. tabaci LAMP Kit die worden beschreven in de volgende stap.
  3. Voorbereiding kant-en-klare B. tabaci Lampset (protocol voor 20 eenheden)
    1. Gebruik schaar naar 8-buis LAMP stroken in twee 4-buis LAMP reepjes gesneden.
    2. Label de buizen van de 4-buis LAMP strips volgens de regeling die is afgebeeld in Figuur 1.
    3. B. tabaci LAMP reactie mastermix (protocol voor 80 reacties) voor te bereiden.
      1. Voeg 1195.1 µL van kant-en-klare GspSSD isothermische master mix (met de polymerase van GspSSD, pyrophosphatase, magnesium-sulfaat, deoxynucleotides, dubbele streng bindende DNA binden kleurstof) en 717.4 µL van B. tabaci LAMP primer mix een 2 ml microcentrifuge buis. Kort vortex en pulsstand centrifuge.
      2. Afzien 22.5 µL van B. tabaci LAMP reactie mastermix (bereid in stap 1.3.3.1) in elke buis van de 4-buis LAMP strips (bereid in stap 1.3.1) en pulse centrifuge.
    4. Vortex de B. tabaci LAMP PAC (bereid in stap 1.2) snel en pulsstand centrifugeren. Dan, voeg 2.5 µL in de buis voorzien van "PAC" van elke strip LAMP 4-buis (Figuur 1).
    5. Nauwe deksels en winkel de kant-en-klare B. tabaci LAMP kit eenheden bij-20 ° C.
      Opmerking: Gebruik ze binnen 1 jaar.

2. ter plaatse LAMP analyse

  1. DNA-extractie
    1. Steriele tandenstokers gebruiken om de insecten specimens in 0,5 mL microcentrifuge buizen met 30 µL van DNA extractieoplossing (bereid in stap 1.1.2).
      Opmerking: Zorg ervoor dat de insecten worden ondergedompeld in de extractieoplossing.
    2. Incubeer de monsters gedurende 5 minuten bij 95 ° C in een thermomixer (300 rpm). Kort vortex en pulsstand centrifuge.
  2. B. tabaci LAMP assay
    1. Dooi een kant-en-klare B. tabaci Lampset bereid in stap 1.3. Vortex snel en pulse centrifuge.
      Opmerking: Met elke kit, het is beide mogelijk om te testen van twee verschillende exemplaren of voor het analyseren van het DNA-extract van een exemplaar in tweevoud.
    2. Voeg 2.5 µL van DNA monsterextract (bereid in stap 2.1) in de buizen met het label "S1" en "S2" van de kant-en-klare B. tabaci Lampset (Figuur 1).
    3. Voeg 2.5 µL van pure alkalische DNA extractieoplossing (bereid in sectie 1.1) in de buis met het label "NAC" voor de versterking van de negatieve controle (Figuur 1).
    4. Vortex de kant-en-klare B. tabaci LAMP kit snel en pulse centrifuge.
    5. Invoegen de kant-en-klare B. tabaci LAMP kits in de LAMP-analyse-apparaat (met real-time fluorescentie-meting) of een real-time PCR-platform en het uitvoeren van een isotherme amplificatie DNA-analyse bij 65 ° C gedurende 60 minuten.
    6. Meten van de smeltende temperaturen van DNA-amplificatie producten door verhitting tot 98 ° C met een latere koeling stap (oprit tarief van 0,05 ° C/s) tot 75 ° C, tijdens het meten van de fluorescentie in real-time.
  3. LAMP assay uitlezing
    1. De uitlezing van de LAMP als volgt handmatig valideren.
      1. Als DNA-amplifications werden gemeten voor het monster en de PAC, geen DNA-amplificatie werd gemeten voor de nar en de onthardende temperatuur van de amplificatie producten werden tussen 80.0 en 85,5 ° C, kunt u overwegen de LAMP resultaten als positief (Figuur 2).
      2. Als er geen versterking van DNA voor de monsters (dat wil zeggen, buizen gelabelde S1 en S2), maar voor PAC- en NAC dan het resultaat van de LAMP als beschouwen negatieve (Figuur 2).
      3. DNA-amplificatie werd gemeten voor de monsters, maar de onthardende temperaturen van bijbehorende amplificatie producten buiten het bereik 80.0 \u2012 85,5 ° C werden, en/of PAC gaf geen versterking van DNA, en/of NAC gaf een DNA-amplificatie, overweeg het resultaat van de LAMP als ONGELDIG (Figuur 2).
    2. Optioneel, valideren de uitlezing van de LAMP met de LAMP validatie applicatie (aanvullende bestand 1).
      1. Definiëren van doelsoorten en definieer het aantal geteste monsters. Klik op de knop "rapport genereren" .
      2. Overdracht van de uitlezing (Ja/Nee, onthardende temperatuur amplificatie product, resultaten van DNA-amplificatie van PAC- en NAC) van het on-site LAMP analyseapparaat of real-time PCR-platform naar de bijbehorende input velden van de validatie applicatie. Het resultaat van de validatie wordt onmiddellijk na het invoeren van de gegevens.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tijdens de validatie van de bepaling van B. tabaci LAMP werden insect specimens onderschept in de loop van de regelmatige Zwitserse controle importproces geanalyseerd8. De specimens afkomstig is van acht verschillende landen (Canarische eilanden, Dominicaanse Republiek, Israël, Maleisië, Marokko, Singapore, Thailand en Vietnam) en de genetische diversiteit van B. tabaci gevonden op Europese POEs8tot uiting komt. Alle LAMP resultaten waren kruis-gevalideerd door DNA barcoding8.

Van een totaal van 80 monsters geanalyseerd door LAMP, 75 exemplaren (93,8%) waren correct geïdentificeerd als B. tabaci (true-positieven), twee exemplaren (2,5%) waren correct geïdentificeerd als zijnde niet B. tabaci (true-negatieven), en drie monsters (3,8%) ten onrechte werden geïdentificeerd als zijnde niet B. tabaci (vals-negatieven) (tabel 2)8. De corrigeren-negatieve resultaten afkomstig is van twee Trialeurodes vaporariorum exemplaren, een niet-gereguleerde soorten met een hoog risico te verwarren met B. tabaci bij POEs voor plantaardige producten8. Op basis van deze resultaten, de volgende metingen van diagnostische nauwkeurigheid werden berekend: testen van specificiteit (true-negatieve tarief), 100%; testen van de gevoeligheid (true-positive rate), 96,2%; testen van de efficiëntie (percentage van juiste testresultaten), 96,3% (tabel 2)8. Bij de beoordeling van de analytische gevoeligheid (detectiegrens), versterkt de B. tabaci LAMP-assay met succes monster DNA verdund tot 100 fg/µL over drie technische replicatieonderzoeken (tabel 3).

Een subset van de tests (N = 13) ter plaatse omstandigheden in het Swiss POE Zurich Airport werd uitgevoerd door plant gezondheidsinspecteurs met behulp van de kant-en-klare B. tabaci LAMP kits8. Wanneer Kruis-gevalideerd in het referentielaboratorium, alle resultaten van het ter plaatse testen bleken te zijn juiste (test efficiëntie = 100%)8. De beoordeling van de on-site LAMP assay prestaties, was de gemiddelde tijd op positieve (tijd tot een positieve resultaten beschikbaar was) 38.4 ± 10.3 min (gemiddelde ± standaardafwijking)8. Een representatieve DNA-amplificatie plot en de bijbehorende onthardende afgeleide van een B. tabaci LAMP analyse uitgevoerd onder on-site voorwaarden staan in figuur 3A en B. In dit voorbeeld monster één en twee werden correct geïdentificeerd als B. tabaci aangegeven door de versterking van DNA na ongeveer 30 min (figuur 3A) samen met de verwachte onthardende temperaturen bij ongeveer 82 ° C (figuur 3B).

figure-results-1
Figuur 1: visualisatie van de experimentele opstelling van een kant-en-klare B. tabaci Lampset beschreven in het protocol. S1, voorbeeld 1; S2, monster 2; PAC, positieve versterking controle; NAC, versterking van de negatieve controle. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

figure-results-2
Figuur 2: schema van LAMP uitlezing validatie. PAC: positieve versterking controle; NAC: versterking van de negatieve controle. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

figure-results-3
Figuur 3: DNA amplificatie plot (A) en gloeien afgeleide (B) van een B. tabaci LAMP analyse uitgevoerd onder on-site voorwaarden. Fluorescentie werd gemeten in eenheden van de relatieve intensiteit. Groene lijn, voorbeeld 1; oranje lijn, monster 2; blauwe lijn, negatieve versterking control (NAC); rode lijn, positieve versterking controle (PAC). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

ComponentVoorraad conc.Laatste reactie conc.Volume per reactie
Taq Polymerase Master Mix2 x1 x10 ΜL
Primer C1-J-219520 ΜM0.4 ΜM0.4 ΜL
Primer TL2-N-301420 ΜM0.4 ΜM0.4 ΜL
Moleculaire Grade Water--8.2 ΜL
DNA-sjabloon--1 ΜL

Tabel 1: voorbereiding van de PCR reactie mastermix voor de B. tabaci positieve versterking controle. Componenten en concentraties die nodig zijn voor het instellen van een PCR-reactie. De uiteindelijke reactie volumewaarde bedraagt 20 µL. Primer reeksen worden weergegeven in 1.2.1.1.

NNTPNFPNTNNFNSEN (%)SPE (%) EVF (%)
807502396,210096,3

Tabel 2: Resultaten van de B. tabaci LAMP assay validatie. N, reeks analyses; NTP, aantal true-positieve resultaten; NFP, aantal vals-positieve resultaten; NTN, aantal true-negatieve resultaten; NFN, aantal vals-negatieve resultaten; SEN, diagnostische gevoeligheid; SPE, diagnostische specificiteit, EVF, testen van efficiëntie.

CDNA (fg/µL)NPR TP (min)
(gemiddelde ± SD)		 TA (° C)
(gemiddelde ± SD)
1 x 105 333.5 ± 2,981.3 ± 0,1
1 x 104 330.7 ± 1.181 ± 0.0
1 x 103 340.4 ± 3,981,1 ± 0,1
1 x 102 350,7 ± 1.681,1 ±0.1
1 x 101 0--
1 x 100 0--

Tabel 3: analytische gevoeligheid (detectiegrens) van de B. tabaci LAMP assay. Elke verdunning werd getest in triplicates. C-DNA, DNA concentratie per reactie; NPR, het aantal positieve worden gerepliceerd; T,P, tijd tot een positief resultaat beschikbaar was; TA, onthardende temperatuur; SD, standaarddeviatie.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De mogelijkheid om nauwkeurig identificeren van potentieel schadelijke organismen zonder vertraging vertegenwoordigt een cruciaal aspect voor het beheer van pest soorten9,10,26. Naast snelle, voor plantaardige importproducten, moet een ideale pest identificatiemethode eenvoudig uit te voeren op het terrein op POEs8,26. Deze paper meldt het protocol van een nieuwe LAMP assay voor de snelle identificatie van B. tabaci, een quarantaine insect organisme vaak onderschept aan de Europese grenzen (https://ec.europa.eu/food/sites/food/files/plant/docs/ph_biosec_europhyt _annual-verslag _2016.pdf).

De grondgedachte achter de ontwikkeling van de diagnostische test was het ontwerpen van een gemakkelijk-aan-volg-protocol die kan worden uitgevoerd tijdens de controleprocedure voor importeren van plant door plant gezondheidsinspecteurs met minimale laboratorium opleiding. Om ter plaatse testen als snelle en eenvoudig mogelijk, is het protocol verdeeld in twee delen, de voorbereiding van een kant-en-klare kit en de werkelijke prestaties van de bepaling van de LAMP. Het eerste deel kan worden gedaan in een extern laboratorium, zodat de plant gezondheidsinspecteur de DNA-extractie en de LAMP assay on-site met slechts één pipetting stap kunt uitvoeren.

Hoewel slechts één stap, pipetting kleine hoeveelheden vloeistof kunnen zijn uitdagend voor gebruikers met weinig of geen ervaring van het laboratorium. Om aan te pakken dit probleem, wordt een kleurstof (cresol rode) toegevoegd aan de extractieoplossing, zodat de operator kan visueel bevestigen dat de kleine hoeveelheid (dat wil zeggen, 2.5 µL) DNA wordt goed overgebracht naar de respectieve buis. Een andere belangrijke vereenvoudiging van het protocol is de validatie applicatie zoals het vergemakkelijkt een betrouwbare interpretatie van de uitlezing van de LAMP (aanvullende bestand 1).

De roman B. tabaci LAMP assay is onder laboratorium ter plaatse door het testen van insecten specimens onderschept tijdens het importeren van de regelmatige controle van Zwitserland8gevalideerd. In totaal werden 80 exemplaren van drie continenten, Afrika, Eurazië en Noord-Amerika, geanalyseerd door LAMP. Van de 80 specimens waren slechts drie (3,8%) ten onrechte geïdentificeerd (vals-negatieven)8. Bij het analyseren van de primer doel DNA-sequenties van de vals-negatieve stalen, bleek het dat zij nieuwe B. tabaci haplotypes die tot nu toe niet beschreven8 hebbenwaren. Op basis van deze resultaten, de B. tabaci LAMP primer set geweest gewijzigde en met succes opnieuw gevalideerde8.

Een belangrijke beperking van elk DNA amplificatie gebaseerde methode met inbegrip van de LAMP is dat zij alleen vooraf gedefinieerde doel DNA sequenties8,27identificeren. Een grondige kennis van de genetische variatie gevonden in de volgorde van de target primer is daarom cruciaal om diagnostische nauwkeurigheid8,27. Dergelijke informatie is echter vaak zeer beperkt, met name in het geval van nieuwe opkomende pest soorten8. Hoewel zeldzaam, zijn vals-negatieve resultaten veroorzaakt door mutaties in de reeks doel verwachte8. In het geval van de huidige B. tabaci LAMP assay is een oplossing voor dit probleem de combinatie met een DNA barcoding gebaseerde technologie, een strategie die zijn gerealiseerd in de loop van de uitvoering van deze diagnostische test op de POE Zurich Airport-8. Hier werden alle LAMP-negatieve resultaten opnieuw geanalyseerd door DNA barcoding in een extern laboratorium8. In het geval dat een nieuwe plaag haplotype nog niet beschreven wordt aangetroffen, kunnen de LAMP inleidingen worden gewijzigd met behulp van de opeenvolging van DNA in de barcoding proces8gegenereerd. Het daaruit voortvloeiende verlies aan snelheid in het geval van een negatief resultaat van de LAMP wordt daarmee de maximale diagnostische nauwkeurigheid gegarandeerd in dit proces in twee fasen8gecompenseerd.

De set-up kosten voor de huidige LAMP assay op een POE zijn ongeveer USD 25.000. Met het toenemend aantal LAMP tests ontwikkeld voor plant ongedierte (bijvoorbeeld Erwinia amylovoraFlavescence dorée en Guignardia citricarpa), zo'n eenmalige investering lijkt gerechtvaardigd13,15, 28. het protocol kan echter mogelijk worden gewijzigd om deze kosten nog verder te verminderen. Bijvoorbeeld, voor de DNA-extractie kan stap bij 95 ° C de thermo-mixer hier gebruikt worden vervangen door een minder dure waterbad of door het uitvoeren van deze stap rechtstreeks in het real-time LAMP apparaat. Bovendien, de mengen stappen op de vortex kunnen waarschijnlijk worden vervangen door handmatig flicking de buizen, en in het DNA overdracht stap de pipet kan worden vervangen door steriele inoculatie lussen.

Toekomstige verbeteringen voor een snelle identificatie van B. tabaci en pest soorten zou in het algemeen een toepassing van een on-site rangschikken benadering die het mogelijk maken voor het uitvoeren van DNA barcoding analyses op POEs. Een veelbelovende kandidaat-systeem voor zo'n implementatie is de technologie van het rangschikken nanopore. Inderdaad, de technologie onlangs met succes is uitgevoerd in een on-site DNA barcoding poging om te beoordelen van de biodiversiteit van een regenwoud8,29,30. Een on-site DNA barcoding identificatiesysteem kan volledig vervangen door de behoefte aan de ontwikkeling van gerichte diagnostische tests en hun validatie. Het maakt het ook mogelijk extra informatie verzamelen over pest kenmerken zoals bestrijdingsmiddelen resistentie genen8. Niettemin, totdat nieuwe sequencing technologieën zullen regelmatig worden uitgevoerd, de bepaling van de LAMP B. tabaci vertegenwoordigt een snelle (< 1 h) en nauwkeurige identificatiemethode.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteur Michael Andreou is een aandeelhouder van OptiGene Limited dat produceert reagentia en instrumenten die worden gebruikt in dit artikel. De andere auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs zijn dankbaar Annette Grendelmeier, Aurelia Drenovac Cornelia Studer, Daniel Frei, Elisabeth Razavi, Markus Oggenfuss, Seraina Vonzun en Sven Moeller voor deelname aan de validatie van de bepaling van de LAMP B. tabaci .

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
B. tabaci LAMP primer mixOptiGene Ltd.op aanvraagVoor bereiding van
gebruiksklare B. tabaci LAMP kit
Centrifuge MiniSpinEppendorf AG5452000010Voor verschillende centrifugeerstappen
Cresol rood (rode kleurstof)Sigma-Aldrich Corp.114472Component van
DNA extractie oplossing
Eppendorf ThermoMixerEppendorf AG5382000015Voor DNA extractie
Genie II (LAMP analyseapparaat ter plaatse)OptiGene Ltd.Genie® IIVoor LAMP analyse
Genie Strips (LAMP strips met 8 buisjes)OptiGene Ltd.OP-0008-50Voor bereiding van
gebruiksklare B. tabaci LAMP kit
HotStarTaq Master MixQiagen AG203443Voor generatie van positieve
amplificatie controle
Labcycler (Thermocycler)SensoQuest GmbH,
gedistribueerd door Witec AG		011-103Voor DNA extractie
GspSSD Lyse n' Lamp Isothermal MastermixOptiGene Ltd.ISO-001LNLVoor bereiding van
gebruiksklare B. tabaci LAMP kit
Mini centrifuge Labnet PrismLabnet International Inc.C1801Voor verschillende centrifugeerstappen
NucleoFast 96 PCRMarcherey-Nagel GmbH743500.4Voor opruiming van positieve
amplificatie controle
Kaliumhydroxide oplossingSigma-Aldrich Corp.319376Component van
DNA extractie oplossing
Qbit Fluorometer 3Thermo Fisher Scientific Corp.Q33226Voor meten van DNA concentratie
van positieve controle
Qubit dsDNA HS Assay KitThermo Fisher ScientificQ32854Voor opruiming van positieve
amplificatie controle
Safe-Lock Tubes 0,5 mL (microcentrifuge buisje)Eppendorf AG0030 121.023Voor DNA extractie
Safe-Lock Tubes 2,0 mL (microcentrifuge buisje)Eppendorf AG0030 120.094Voor bereiding van
gebruiksklare B. tabaci LAMP kit
Houten tandenstokersVWR International LLC470226-594Voor DNA extractie
Vortex-Genie 2 (Vortex)Scientific Industries Inc.SI-0236Voor verschillende mengstappen

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. De Barro, P. J., Liu, S. S., Boykin, L. M., Dinsdale, A. B. Bemisia tabaci: a statement of species status. Annual Review of Entomology. 56, 1-19 (2011).
  2. Zhang, G. F., Lü, Z. C., Wan, F. H., Lövei, G. L. Real-time PCR quantification of Bemisia tabaci (Homoptera: Aleyrodidae) B-biotype remains in predator guts. Molecular Ecology Notes. 7 (6), 947-954 (2007).
  3. Boykin, L. M., De Barro, P. J. A practical guide to identifying members of the Bemisia tabaci species complex: and other morphologically identical species. Frontiers in Ecology and Evolution. 2, (2014).
  4. Cuthbertson, A. G. S., Vänninen, I. The importance of maintaining protected zone status against Bemisia tabaci. Insects. 6 (2), 432-441 (2015).
  5. Dalmon, A., Halkett, F., Granier, M., Delatte, H., Peterschmitt, M. Genetic structure of the invasive pest Bemisia tabaci: evidence of limited but persistent genetic differentiation in glasshouse populations. Heredity. 100 (3), 316-325 (2008).
  6. Dickey, A. M., Osborne, L. S., Shatters, R. G., Hall, P. A. M., Mckenzie, C. L. Population genetics of invasive Bemisia tabaci (Hemiptera: Aleyrodidae) cryptic species in the United States based on microsatellite markers. Journal of Economic Entomology. 106 (3), 1355-1364 (2013).
  7. Bacon, S. J., Bacher, S., Aebi, A. Gaps in border controls are related to quarantine alien insect invasions in Europe. PLOS ONE. 7 (10), e47689(2012).
  8. Blaser, S., et al. From laboratory to point of entry: development and implementation of a loop-mediated isothermal amplification (LAMP)-based genetic identification system to prevent introduction of quarantine insect species. Pest Management Science. 74 (6), 1504-1512 (2018).
  9. Floyd, R., Lima, J., de Waard, J., Humble, L., Hanner, R. Common goals: policy implications of DNA barcoding as a protocol for identification of arthropod pests. Biological Invasions. 12 (9), 2947-2954 (2010).
  10. Armstrong, K. F., Ball, S. L. DNA barcodes for biosecurity: invasive species identification. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 360 (1462), 1813-1823 (2005).
  11. Notomi, T., et al. Loop-mediated isothermal amplification of DNA. Nucleic Acids Research. 28 (12), E63(2000).
  12. Tomlinson, J. A., Boonham, N., Dickinson, M. Development and evaluation of a one-hour DNA extraction and loop-mediated isothermal amplification assay for rapid detection of phytoplasmas. Plant Pathology. 59 (3), 465-471 (2010).
  13. Kogovšek, P., et al. LAMP assay and rapid sample preparation method for on-site detection of flavescence dorée phytoplasma in grapevine. Plant Pathology. 64 (2), 286-296 (2015).
  14. Lee, M. S., Su, T. Y., Lien, Y. Y., Sheu, S. C. The development of loop-mediated isothermal amplification (LAMP) assays for the rapid authentication of five forbidden vegetables in strict vegetarian diets. Scientific Reports. 7, 44238(2017).
  15. Bühlmann, A., et al. Erwinia amylovora loop-mediated isothermal amplification (LAMP) assay for rapid pathogen detection and on-site diagnosis of fire blight. Journal of Microbiological Methods. 92 (3), 332-339 (2013).
  16. Cavalieri, V., Manglli, A., Tiberini, A., Tomassoli, L., Rapisarda, C. Rapid identification of Trialeurodes vaporariorum, Bemisia tabaci (MEAM1 and MED) and tomato-infecting criniviruses in whiteflies and in tomato leaves by real-time reverse transcription-PCR assay. Bulletin of Insectology. 67 (2), 219-225 (2014).
  17. Baek, J. H., Lee, H. J., Kim, Y. H., Lim, K. J., Lee, S. H., Kim, B. J. Development of an antibody-based diagnostic method for the identification of Bemisia tabaci biotype B. Pesticide Biochemistry and Physiology. 131, 18-23 (2016).
  18. Hsieh, C. H., Wang, H. Y., Chen, Y. F., Ko, C. C. Loop-mediated isothermal amplification for rapid identification of biotypes B and Q of the globally invasive pest Bemisia tabaci, and studying population dynamics. Pest Management Science. 68 (8), 1206-1213 (2012).
  19. Rejili, M., et al. A PCR-based diagnostic assay for detecting DNA of the olive fruit fly, Bactrocera oleae, in the gut of soil-living arthropods. Bulletin of Entomological Research. 106 (5), 695-699 (2016).
  20. Hebert, P. D. N., Ratnasingham, S., deWaard, J. R. Barcoding animal life: cytochrome c oxidase subunit 1 divergences among closely related species. Proceedings. Biological Sciences. 270 (Suppl 1), 96-99 (2003).
  21. Ratnasingham, S., Hebert, P. D. N. bold: The Barcode of Life Data System (http://www.barcodinglife.org). Molecular Ecology Notes. 7 (3), 355-364 (2007).
  22. Benson, D. A., Karsch-Mizrachi, I., Lipman, D. J., Ostell, J., Bank Wheeler, D. L. G. en GenBank. Nucleic Acids Research. 33, D34-D38 (2005).
  23. Lorenz, T. C. Polymerase chain reaction: basic protocol plus troubleshooting and optimization strategies. Journal of Visualized Experiments. (63), e3998(2012).
  24. Simon, C., Frati, F., Beckenbach, A., Crespi, B., Liu, H., Flook, P. Evolution, weighting, and phylogenetic utility of mitochondrial gene sequences and a compilation of conserved polymerase chain reaction primers. Annals of the Entomological Society of America. 87 (6), 651-701 (1994).
  25. Simon, C., Buckley, T. R., Frati, F., Stewart, J. B., Beckenbach, A. T. Incorporating molecular evolution into phylogenetic analysis, and a new compilation of conserved polymerase chain reaction primers for animal mitochondrial DNA. Annual Review of Ecology, Evolution, and Systematics. 37 (1), 545-579 (2006).
  26. Harper, S. J., Ward, L. I., Clover, G. R. G. Development of LAMP and real-time PCR methods for the rapid detection of Xylella fastidiosa for quarantine and field applications. Phytopathology. 100 (12), 1282-1288 (2010).
  27. Lauri, A., Mariani, P. O. Potentials and limitations of molecular diagnostic methods in food safety. Genes & Nutrition. 4 (1), 1-12 (2009).
  28. Tomlinson, J. A., et al. A loop-mediated isothermal amplification-based method for confirmation of Guignardia citricarpa in citrus black spot lesions. European Journal of Plant Pathology. 136 (2), 217-224 (2013).
  29. Branton, D., et al. The potential and challenges of nanopore sequencing. Nature Biotechnology. 26 (10), 1146-1153 (2008).
  30. Pomerantz, A., et al. Real-time DNA barcoding in a rainforest using nanopore sequencing: opportunities for rapid biodiversity assessments and local capacity building. GigaScience. 7 (4), giy033(2018).

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

DNA extractieidentificatie ter plaatseplantgezondheidsinspecteurssnelle diagnostische tooldetectie van invasieve plagenLAMP validatieZwitserse importcontrole

Gerelateerde artikelen