Gelijktijdige studie van de aanwerving van monocyt subpopulaties onder stroom In Vitro

Samenvatting

Hier presenteren we een geïntegreerde protocol die maatregelen monocyt subpopulatie mensenhandel onder stroom in vitro door gebruik van specifieke oppervlakte markers en confocal fluorescentie microscopie. Dit protocol kan worden gebruikt om te verkennen sequentiële werving stappen ook over andere subtypen van de leukocyten met behulp van andere specifieke oppervlakte markers profile.

Samenvatting

De aanwerving van monocyten uit het bloed aan gerichte perifere weefsels is kritiek aan het inflammatoire proces tijdens weefsel schade, ontwikkeling van de tumor en auto-immune ziekten. Dit wordt vergemakkelijkt door een proces van vangen van doorstroming op het luminal oppervlak van geactiveerde endotheliale cellen, gevolgd door hun migratie hechting en signaalcomplexen (zielsverhuizing) in het onderliggende aangetast weefsel. De mechanismen die ondersteuning bieden voor de preferentiële en context-afhankelijke werving van monocyt subpopulaties worden echter nog steeds niet volledig begrepen. Daarom hebben wij een methode waarmee de aanwerving van verschillende monocyt subpopulaties gelijktijdig worden gevisualiseerd en gemeten onder stroom ontwikkeld. Deze methode, gebaseerd op time-lapse confocal imaging, voorziet het duidelijke onderscheid tussen aanhangend en transmigrated monocyten. Hier beschrijven we hoe deze methode kan worden gebruikt om gelijktijdig de opeenvolging van de werving van pro-angiogenic en niet-angiogenic monocyten in vitro studie. Bovendien, deze methode kan worden uitgebreid om te bestuderen van de verschillende stappen van de aanwerving van maximaal drie monocyt populaties.

Inleiding

Monocyten een fagocytische onderdeel vormen van aangeboren immuniteit dat essentieel is voor de bestrijding van ziekteverwekkers, opruimen van beschadigde weefsels, angiogenese en de pathofysiologie van vele ziekten, waaronder kanker^1,2,3 . Monocyten zijn beenmerg-afgeleide cellen samengesteld van heterogene subpopulaties die circuleren in het bloed, maar op de site van ontsteking in perifeer weefsel kunnen worden aangeworven door middel van specifieke moleculaire mechanismen. De aanwerving cascades van monocyten, wat betreft de leukocyten in het algemeen impliceert verschillende stappen waaronder vangen, rollen, kruipen, arrestatie, migratie van signaalcomplexen (zielsverhuizing) en migratie door de vaatwand (kelder membraan en muurschildering cellen)⁴. Deze maatregelen betreffen voornamelijk ontsteking geïnduceerde moleculen op het endotheel luminal oppervlak zoals selectinen, glycoproteïne liganden chemokines, intercellulaire en regulates celadhesie-moleculen en hun receptoren op leukocyten zoals selectine liganden en integrins. Mensenhandel trajecten via ofwel de endothelial cel kruispunten (paracellular) of via de endothelial cel lichaam (transcellulair) kunnen worden gebruikt door leukocyten te steken van het endotheel barrière-⁵. Terwijl monocyten zijn historisch gedocumenteerd te transmigrate door de transcellulair-route, hebben mogelijke verschillen in hun trekkende traject voorgesteld als monocyten zijn niet langer beschouwd als een homogene-celpopulatie. Het is nu duidelijk dat monocyt diversiteit kan worden gedefinieerd door elk van hun verschillen en overeenkomsten, met betrekking tot hun kenmerkende extravasation cascades^3,6. Daarom, teneinde ondubbelzinnig onderscheid te maken tussen monocyt subpopulaties, is het van cruciaal belang om te visualiseren en fenotype het gedrag van elk van deze verschillende subpopulaties tijdens de aanwerving verwerken.

Monocyten van menselijke, pig, rat en muis waren onderverdeeld in fenotypische subpopulaties met bepaalde waaraan functies en specifieke trekkende gedrag^7,8,9. Bijvoorbeeld, bij de mens, kunnen monocyten worden onderverdeeld in drie subgroepen op basis van hun oppervlakte uitdrukking van CD14, een co-receptor voor bacteriële lipopolysaccharide en CD16, de Fc-gamma receptor III. Menselijke monocyt subpopulaties omvatten klassieke CD14⁺CD16^-, middenniveau CD14⁺CD16⁺ en niet-klassieke CD14^dimCD16^{+ 6,9}cellen. De klassieke CD14⁺CD16^- monocyten bleken te zijn voornamelijk inflammatoire overwegende dat de pool van CD16⁺ monocyten bleken collectief te presenteren TIE2 meningsuiting en proangiogenic functie¹⁰. Consequent, endothelial cel stimulatie met inflammatoire cytokines zoals menselijke tumor necrose factor (TNF) α of Interleukine (IL-1) beta (conventionele ontsteking) is voldoende om te leiden tot de volledige aanwerving van klassieke CD14⁺CD16 ^- de monocyten. Gelijktijdige acties van vasculaire endotheliale groeifactor (VEGF) A en TNFα (angiogenic factoren gestuurde ontsteking) zijn echter vereist om te provoceren de transmigratie van de CD16⁺ proangiogenic pool van monocyten³. In het verleden het traditionele systeem van de Transwell onder statische omstandigheden, de parallelle plaat stroom zaal en de µ-dia stroom kamers zijn gebruikt om het kwantitatief analyseren de aanwerving van een leukocyte bevolking op een tijd in vitro^{11 ,12,13}. Terwijl deze protocollen zijn gevalideerd, een meer robuuste methode waardoor de gelijktijdige analyse van meerdere monocyt subpopulaties zou worden beschouwd als meer inzicht. Dergelijke methodologieën moeten rekening voor meerdere interacties en de verschillende frequenties van elke respectieve bevolking en bieden ook een mechanistische inzicht in de gelijkenissen en de specifieke kenmerken voor de aanwerving cascades die elke monocyt bepalen subset.

Hier presenteren we een methode gebaseerd op de time-lapse beeldvorming van monocyt recruitment onder stroom waarmee de trekkende cascades van verschillende monocyt subpopulaties gelijktijdig worden bestudeerd met behulp van de confocal microscopie. Deze methode integreert bepaalde kritische features die endothelial cel ontsteking, evenals de hemodynamica van circulerende monocyten in post capillaire venules, de hoofdlocatie van leukocyten aanwerving in vivo na te bootsen. De voorgestelde methode maakt gebruik van menselijke navelstreng ader endotheliale cellen (HUVEC), die worden gegenereerd door een goed gangbaar protocol van isolatie van menselijke umbilical koorden. Deze klinische resource heeft het voordeel dat ze gemakkelijk beschikbaar als biologische bijproduct, terwijl ook het verstrekken van een redelijk rendement van endotheliale cellen die geïsoleerd uit de navelstreng ader worden kunnen. Wij ook gebruikt fluorescente kleurstoffen en immunofluorescentie onderscheid maken tussen de verschillende cellulaire componenten, en confocale microscopie ondubbelzinnig definiëren monocyt positionering (luminal vs. abluminal) na verloop van tijd. Het hier gepresenteerde protocol heeft ontwikkeld om tegelijkertijd maatregel de zielsverhuizing niveaus van monocyt subpopulaties. Bovendien moet worden opgemerkt dat deze methode kan worden uitgebreid om te bestuderen van andere leukocyten subpopulaties en recruitment processen door gebruik van verschillende biomerkers en etikettering.

Protocol

Menselijke materialen werden gebruikt met de geïnformeerde toestemming van vrijwillige donoren en in overeenstemming met de Zwitserse ethische comités op klinisch onderzoek.

1. isolatie en invriezen van menselijke navelstreng ader endotheliale cellen (HUVEC)

1. Voeg 5 mL van coating oplossing in een maatkolf van T75 (0,1 mg/mL collageen G en 0,2% gelatine in fosfaatgebufferde zoutoplossing PBS met een pH van 7,4) gedurende 30 minuten bij 37 ° C voordat de HUVEC isolatie.
2. Het snoer met PBS reinigen, veeg het met steriele kompressen, en plaatst u deze in een steriele 20 cm petrischaal. Snijd de uiteinden van het koord met een steriele schaar.
3. Identificeer de één grote ader en de twee kleine slagaders. Zachtjes invoegen een canule met een drie-weg-afsluiter die eraan verbonden zijn in de extremiteiten van de ader aan de uiteinden van het koord.
4. Draai het snoer en de verbinding van de canule stevig met een lengte van de draad.
5. Perfuse het snoer tweemaal met 20 mL van RPMI medium met 100 U/mL penicilline, 100 U/mL streptomycine en 250 ng/mL amfotericine B te wassen aan het snoer van aderen. Dit proces maakt de verschijning van het snoer witter en helderder. Leeg de ader vóór collagenase toevoeging door het verzamelen van de RPMI met een spuit aan het ene uiteinde.
6. De ader met 12 mL 1 mg/mL collagenase soort perfuse ik (0,22 µm-gefilterd).
7. Sluit de afsluiter op het snoer eindigt en Incubeer bij 37 ° C gedurende 12 minuten aan het snoer.
8. Zachtjes masseren aan het snoer als u wilt loskoppelen van de endotheliale cellen van de ader lumen.
9. Neem 30 mL van RPMI met foetaal kalfsserum van 10% met een 50 mL injectiespuit en sluit deze aan één uiteinde van de navelstreng.
10. Een lege 50 mL-spuit verbinden met het andere uiteinde van de navelstreng
11. Open de afsluiter en perfuse van de ader van de ene kant terwijl samengebouwd verzamelen vanaf het andere einde.
    Opmerking: De verzamelde schorsing bevat endotheliale cellen.
12. Centrifugeer deze celsuspensie bij 200 x g gedurende 5 min.
13. Verwijder het supernatant en resuspendeer de pellet cel met volledige M199 medium (M199 met 20% FCS, 15 µg/mL endothelial celgroei voedingssupplementen, 100 µg/mL heparine natrium, 0,5 µM hydrocortison, 10 µg/mL L-ascorbinezuur, 100 U/mL penicilline, 100 U/mL 10 mL streptomycine en 250 ng/mL amfotericine B).
14. De coating oplossing uit de maatkolf T75 verwijderen en spoel één keer met PBS.
15. Zaad de cellen verzameld uit stap 1.13 in de maatkolf van T75 en plaats deze in de incubator bij 37 ° C met 5% CO₂.
16. De volgende dag, spoel de kolf 3 keer met het volledige M199 medium te verwijderen van de resterende rode bloedcellen en wijzig het medium om de 2 dagen tot de samenvloeiing.
17. Bij 80-90% samenvloeiing, spoel de HUVEC enkelgelaagde eenmaal met 5 mL PBS en loskoppelen van de cellen met 5 mL 0,05% trypsine in 1 mM EDTA bij 37 ° C gedurende 5 min. Voeg 4 mL van M199 en 1 mL FCS om de trypsine actie te stoppen. Spoel de kolf als u wilt loskoppelen van alle HUVEC.
18. Het verzamelen van een aliquoot deel van 50 µL te worden gebruikt voor de kleuring van VE-cadherine, PECAM-1 en gp38, en te analyseren door stroom cytometry te controleren HUVEC zuiverheid.
19. De rest van HUVEC verzamelen vanaf stap 1.18 in een tube van 15 mL en centrifuge bij 200 x g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
20. Verwijder het supernatant uit stap 1.19 resuspendeer de pellet van de cel in de bevriezing van de oplossing (FCS met 10% DMSO) bij een dichtheid van 5 x 10⁵ cellen/mL in cryotubes en bevriezen bij-80 ° C of in vloeibare stikstof tot gebruik.
21. HUVEC zuiverheid te controleren:
    1. Voeg 1 µL van anti-menselijke VE-cadherine-FITC antilichaam, 1 µL van anti-menselijke PECAM1-PE antilichaam en 1 µL van anti-menselijke Podoplanin-APC antilichaam aan de hoeveelheid 50 µL van HUVEC verzameld bij stap 1.18.
    2. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten.
    3. Voeg 100 µL van PBS en centrifuge bij 400 x g gedurende 30 s.
    4. Verwijder het supernatant en resuspendeer in 100 µL van PBS. Gegevens kunnen nu worden verworven door stroom cytometry technieken.
       Opmerking: HUVEC positief zijn voor VE-cadherine en PECAM-1, en negatief voor de Podoplanin.

2. HUVEC ontdooiing

Opmerking: Gebruik HUVEC bij lage passage voor experimenten (maximaal 5 passages).

1. Jas een T75 kolf met 1 mL van de oplossing van de coating bij 37 ° C gedurende 30 minuten.
2. Snel HUVEC deblokkeren bij 37 ° C gedurende 2 minuten en resuspendeer de cellen in 10 mL van volledige M199.
3. Centrifugeer de cellen bij 200 x g bij kamertemperatuur gedurende 5 minuten en verwijder het supernatant.
4. Resuspendeer de pellet cel in 10 mL van volledige M199.
5. Spoel de celsuspensie in de kolf van vooraf gecoat. Plaats de kolf in de incubator bij 37 ° C met 5% CO₂. Wijzig het kweekmedium cel om de 2 dagen.

3. HUVEC cultuur in 0.4 µ-dia zaal

1. Vijf dagen voordat het experiment van de doorstroming, jas vooraf de kamers van een 0.4 µ-dia met 30 µL van PBS 0,1 mg/mL collageen G, 0,2% gelatine bij 37 ° C gedurende 30 minuten.
2. De kamers met 100 µL van PBS wassen.
3. Loskoppelen van de cellen van een 80-90% confluente HUVEC van een T75 kolf.
4. HUVEC met 5 mL PBS afspoelen en los ze met 5 mL 0,05% trypsine bij 37 ° C gedurende 5 minuten.
5. Spoelen en verzamelen van de celsuspensie in volledige M199 en de cellen tellen met de meest geschikte methode. Centrifugeer bij 200 x g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
6. Resuspendeer de pellet cel bij 10⁶ cellen/mL en distribueren van 30 µL (30.000 cellen) per kamer.
7. Incubeer de cellen in een incubator bij 37 ° C met 5% CO₂ voor 1 h.
8. Voeg 150 µL van volledige M199 aan elke kamer en cultuur van de cellen voor 5 dagen in de incubator bij 37 ° C en 5% CO₂. Wijzig het medium om de 2 dagen.

4. HUVEC kleuring voor monocyt Recruitment Assay onder stroom

1. Bereiden de labeling drager dan ook gemaakt van M199 en 1 µM van CMFDA (5-chloromethylfluorescein DIACETAAT) en warm het bij 37 ° C gedurende 5 minuten voordat het labelen van de cel.
2. Wassen HUVEC twee keer met M199 medium opgewarmd bij 37 ° C.
3. Vervangen van het medium met 30 µL van verwarmde labeling medium met 1 µM van CMFDA en plaats in de incubator bij 37 ° C en 5% CO₂ gedurende 10 minuten.
4. Een keer wassen met volledige M199 en Incubeer de cellen met volledige M199 in de incubator bij 37 ° C en 5% CO₂ gedurende 30 minuten.
   Opmerking: Het is belangrijk om alle sporen van serum vóór toevoeging van de labeling oplossing te verwijderen, anders het kan veranderen HUVEC kleuring.
5. Vervangen van het medium met volledige M199 met beide menselijke TNFα (500 U/mL) of een combinatie van menselijke TNFα (500 U/mL) met menselijke VEGFA (1 µg/mL) gedurende 6 uur in een incubator bij 37 ° C en 5% CO₂.

5. isolatie van menselijke Pan monocyten en vlekken van subpopulaties

1. Een buffy coat van geconcentreerde menselijk bloed, óf gebruiken 20 mL vers geïsoleerd menselijk bloed, verzameld op de dag van het experiment in EDTA vacutainer buizen.
2. Verdun het bloed in PBS-1 mM EDTA (1:1) en Pipetteer voorzichtig 20 mL van de verdunde bloed op de top van de 20 mL van de kleurovergang media dichtheid. Centrifugeer bij 400 x g gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur met langzame acceleratie en zonder rem.
3. Verzamelen van de perifere mononucleaire bloedcellen (PBMC)-bloedplaatjes laag (tussen dichtheid kleurovergang media en plasma lagen) in een nieuwe tube van 50 mL met 40 mL PBS - 1 mM EDTA. Top tot 50 mL met PBS - 1 mM EDTA.
4. Centrifugeer bij 200 x g bij kamertemperatuur gedurende 5 min. Verwijder het supernatant.
5. Resuspendeer de pellet cel met 10 mL kleuring buffer (PBS - 1 mM EDTA met 0,5% bovien serumalbumine BSA).
6. Centrifugeer bij 200 x g bij kamertemperatuur gedurende 5 min. Verwijder het supernatant.
7. Herhaal stap 5.5 en 5.6.
8. Resuspendeer de pellet cel met 10 mL buffer kleuring. Neem een aliquoot deel van 10 µL voor een cel tellen.
9. Controleer PBMC populaties en cellen snel met een stroom-cytometer tellen.
   Opmerking: De karakteristieke lymfocyt en monocyt populaties kunnen worden waargenomen (figuur 1A). Van 50 mL vers bloed verwachten over 50-100 x 10⁶ PBMC.
10. Voor de aanwerving van CD14 + versus CD14-PBMC onder stroom:
    1. Wassen van de pellet driemaal met stroom buffer (M199 met 0,5% BSA) en resuspendeer de mononucleaire cellen in stroom buffer op 6 x 10⁶ cellen per mL.
    2. Zorg aliquots van 200 µL voor elke assay. Incubeer bij 37 ° C tot 20 min voor de bepaling.
    3. 5 µL van anti-CD14-PE en Hoechst 33342 op een eindconcentratie van 2 µM aan elk aliquot toevoegen. Meng en Incubeer bij 37 ° C gedurende 10 minuten.
    4. Centrifugeer het afgepipetteerde deel bij 400 x g gedurende 30 s.
    5. Verwijder het supernatant en resuspendeer de pellet met 200 µL van stroom buffer.
11. Voor de aanwerving van monocyt subpopulaties onder stroom:
    1. Isoleren monocyten met een pan monocyt isolatie kit volgens de instructies van de fabrikant.
       Opmerking: Het volgende protocol van de isolatie is voor 50 x 10⁶ cellen. Het kan worden geschaald omhoog of omlaag zolang het binnen de aanbevelingen van de fabrikant.
    2. Centrifugeer de PBMC schorsing bij 200 x g bij kamertemperatuur gedurende 5 minuten.
    3. Verwijder het supernatant en resuspendeer de pellet met 400 µL van kleuring van de buffer.
    4. Voeg 50 µL van Fc-receptor blokkerende reagens en 50 µL van Pan monocyt antilichaam cocktail.
    5. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten.
    6. Voeg 400 µL van kleuring buffer en 100 µL van magnetische kralen geconjugeerd anti-Biotine antilichaam. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 15 minuten.
    7. Voeg toe 2 mL kleuring buffer en een kolom van de MACS LS in combinatie met een magneet te gebruiken.
    8. Plaats van de kolom van LS op de magneet en voeg 1 mL buffer kleuring. Gooi de doorstroming.
    9. Passeren de PBMC schorsing in de kolom en verzamel de duidelijke stroom al die pan monocyten in een nieuwe tube van 15 mL bevatten.
    10. Voeg de kleuring buffer naar boven tot 5 mL.
    11. Doe een aliquoot gedeelte en de kwaliteit van de monocyt isolatie met een cytometer van de stroom.
    12. Bepaal de pan monocyt telling.
        Opmerking: Alleen monocyt bevolking kan worden waargenomen (figuur 1B).
    13. Centrifugeer het restant van de monocyten uit stap 5.11.11 bij 200 x g gedurende 5 min.
    14. Verwijder het supernatant.
    15. Resuspendeer de pellet cel in 5 mL stroom buffer (M199 met 0,5% BSA).
    16. Herhaal de 5.11.13 aan de 5.11.14 tweemaal te elimineren elk spoor van EDTA.
12. Maak monocyt schorsing in stroom (M199 met 0,5% BSA) bij 6 x 10⁶ cellen/mL buffer.
13. Zorg aliquots van 200 µL van monocyten voor elke aanwerving assay.
14. Houd het afgepipetteerde deel bij 37 ° C in de incubator tot 20 min vóór injectie.
15. 5 µL van anti-CD16-PE antilichaam en Hoechst 33342 (laatste 2 µM) aan elk aliquot toevoegen.
16. Meng en Incubeer bij 37 ° C gedurende 10 minuten.
17. Centrifugeer het afgepipetteerde deel bij 400 x g gedurende 30 s.
18. Verwijder het supernatant en resuspendeer de pellet met 250 µL van stroom buffer.
19. Voeg 30 µL van de monocyt schorsing in één kamer van de dia om te dienen voor het instellen van de parameters van de overname op de confocal microscoop.
20. De aliquots van monocyt schorsing behoeden voor stap 5.18 bij 37 ° C.
    Opmerking: Deze opschorting is klaar om te worden geïnjecteerd in de stroomsysteem.

6. bereiding van het Fluidic systeem

1. Zorgen dat de cel incubator voor de imaging ingesteld op 37 ° C.
   Opmerking: Een diagram van de stroomsysteem is afgebeeld in Figuur 2.
2. Monteren van de buis-deel I: invoegen een Luer connector male naar één uiteinde van een stuk van silicone slangen (8 cm lang en 3 mm dik) en sluit het andere uiteinde op een in-line Luer injectie set. De laatste Luer aansluiting verbinden met een stuk van Siliconen slang (40 cm en 3 mm dik) aan het ene uiteinde.
   Opmerking: Optioneel, kan een 3-weg kraan aangesloten op een 5 mL-spuit worden ingevoegd tussen de in-line Luer injectie set en het silicone slangen voor eventuele lucht zeepbel verwijdering.
3. Monteren van de buis-deel II: een 20 mL spuit verbinden met één uiteinde van een lengte van silicone slangen (1 m lang en 3 mm dik). Plaats een Luer connector male naar het andere uiteinde van de buis.
4. Verbinding maken met deel I en deel II buizen door het invoegen van de Luer aansluiting mannetjes om een Luer lock vrouwelijk (figuur 2A).
5. Zet het vrije uiteinde van de slang silicone in het reservoir met de stroom buffer (M199 + 0.5% BSA) opgewarmd bij 37 ° C.
6. Trek op de zuiger van de spuit van 20 mL te vullen van de buis met stroom buffer.
7. Plaats de injectiespuit op de pomp en veilig.
8. Instellen van de pomp in trekken modus (als tegenstelling tot Infundeer) en geef het debiet.
9. Het bepalen van de stroomsnelheid volgens de IBIDI-dia met behulp van de volgende formule gebruikt:
   
   Opmerking: De dia factor is afhankelijk van de dia van de IBIDI voor het experiment gebruikt. Voor de µ-dia ik^0.4 Luer lock gebruikt in dit voorbeeld wordt de dia factor is 131.6. Zie voor specifieke dia de factoren, het bedrijf website¹⁴. De viscositeit van de buffer stroom is 0.0072 dyn.s/cm². Shear stress op de post capillaire venules is ongeveer 0,5 dyn/cm².
10. Sluit de dia (figuur 2B):
    1. De silicone slangen rond het vrouwelijk Luer Lock klem en de twee Luer aansluiting mannetjes verbreken het voorste koppelingsvlak.
    2. De reservoirs van de dia met gestimuleerd HUVEC en opvulling met medium moet aansluiten. Luchtbellen vermijden tijdens deze stap.
    3. Opstijgen van de klemmen en ervoor te zorgen dat de verbinding niet lekt.
11. Plaats de dia onder de Microscoop voor time-lapse beeldvorming en start van de pomp.

7. time-lapse beeldvorming van monocyt Recruitment onder stroom door confocale microscopie

1. Gebruik van een 40 x doelstelling (Zie Tabel of Materials) voor imaging.
2. Activeren van de 405 nm (blauw monocyt kernen), 488 nm (groen endotheliale cellen) en 561 nm (rood CD16 + subset) lasers.
3. Gebruik de kamer waarin de monocyten als u wilt instellen van de parameters van de overname.
   Opmerking: Het gaatje en de intensiteit van de laser 405 nm, zijn voor het detecteren van zowel niet-transmigrated en transmigrated monocyten, hoog ingesteld. Dus, niet-transmigrated monocyten zijn licht zichtbaar in het basale plan. Echter enige transmigrated monocyten presenteren een onbevlekt gebied rond de kern die overeenkomt met de nieuwe ruimte die wordt ingenomen onder endotheliale cellen.
4. Plaats de kamer aan te schaffen onder de Microscoop.
5. Kies 3 velden gedachtewisseling binnen straal van 1 cm voor multi-positie confocal imaging.
6. Definiëren van de basale en de apicale zijde van endotheliale cellen
7. Het instellen van een z-stack op de 10 – 12 µm bereik (0,5 µm stap). Stormloop een time-lapse aanwinst om 1 min.
8. Na 3 min voor imaging, injecteren 200 µL van monocyt schorsing (6 x 10⁶ cellen/mL) via de in-line Luer injectie poort.
   Opmerking: Snel monocyten verschijnen in de apicale brandvlak, houden en starten van transmigratie (transit van de apicale aan het basale plan).
9. Afbeelding voor minstens 30 min. Zodra gebeëindigd, stoppen met imaging en stoppen van de stroom. Klem de buis om hen te verbreken van de dia.
10. Het herstellen van de dia met de 4% paraformaldehyde bij 4 ° C gedurende 10 minuten.
11. Wassen van de dia met PBS en sla de dia bij 4 ° C voor verdere analyse indien nodig.

8. het analyseren van de gegevens met ImageJ

1. Het aantal totale aanhangend monocyten in elk veld. Het bepalen van het aantal cellen per mm².
2. Rekenen transmigrated monocyten die aanwezig in het basale plan onder endotheliale cellen en geïdentificeerd door de aanwezigheid van een zwart gat (in het groene kanaal) rond de kern zijn.
3. Verdeel de graaf van transmigrated leukocyten door het totale aantal aanhangend leukocyten. De transmigratie tarief wordt gepresenteerd als een percentage van aanhangend monocyten.
4. Ter illustratie, kunnen het apicale en de basale partners worden aangetoond gelijktijdig ter illustratie van de gebeurtenissen in elk van deze endothelial compartimenten.

Resultaten

Vaststelling van de staat van de activering van de HUVEC veroorzaakt door TNFα

De bio-activiteit van de inflammatoire cytokine TNFα kan worden afhankelijk van de partij en de herverpakking van bevriezen-ontdooien cyclus. Het is belangrijk om te controleren van de status van de activering van HUVEC met TNFα behandeling. Dit kon worden uitgevoerd door kleuring parallel enkele monsters van confluente HUVEC voor de inflammatoire induct...

Discussie

Wij rapporteren hier, een methode die een studie van hoe monocyt subpopulaties via de ontstoken endothelial enkelgelaagde transmigrate detaillering. De besproken methode gebruikt confocale microscopie in plaats van fase contrast microscopie, die ook wordt gebruikt om te studeren monocyt recruitment onder stroom^3,11,19. Een groot voordeel van het gebruik van de confocal microscopie voor time-lapse beeldvorming is de mogelijkheid ...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Tissue Culture Flasks 75 cm2	TPP	90076	Routine culture of isolated HUVEC
µ-Slide VI 0.4	IBIDI	80606
Centrifuge Tubes 15 mL	TPP	191015
Centrifuge Tubes 50 mL	TPP	191050
Collagen G	Biochrom	L 7213	Voor coating van celcultuurkolven
Gelatin	Sigma-Aldrich	1393	Voor coating van celcultuurkolven
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (without MgCl2 and CaCl2)	Sigma-Aldrich	D8537
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (with MgCl2 and CaCl2)	Sigma-Aldrich	D8662
RPMI-1640 Medium	Sigma-Aldrich	R8758
3-Way Stopcocks	BIO-RAD	7328103
penicillin 10,000 μ/mL streptomycine 10,000 μg/mL fungizone 25 μ/mL	AMIMED	4-02F00-H
Collagenase type 1	Worthington	LS004216
Medium 199 1x avec Earle's salts, L-Glutamine, 25 mM Hepes	GIBCO	22340020
Bovine Albumin Fraction V	ThermoFisher	15260037
Endothelial Cell Growth Supplement, 150 mg	Millipore	02-102
Heparin Sodium	Sigma-Aldrich	H3149RT
Hydrocortisone	Sigma-Aldrich	H6909
L-Ascorbic acid	Sigma-Aldrich	A 4544
EDTA disodium salt dihydrate C10H14N2Na2O8 · 2H2O	APPLICHEM	A2937.0500
CD144 (VE-Cadherin), human recombinant clone: REA199, FITC	Miltenyi Biotech	130-100-713	AB_2655150
CD31-PE antibody, human recombinant clone: REA730, PE	Miltenyi Biotech	130-110-807	AB_2657280
Anti-Podoplanin-APC, human recombinantclone: REA446, APC	Miltenyi Biotech	130-107-016	AB_2653263
BD Accuri C6 Plus	BD Bioscience
µ-Slide I Luer	IBIDI	80176
CMFDA (5-chloromethylfluorescein diacetate)	ThermoFisher	C2925
Recombinant human TNFα	Peprotech	300-01A
Recombinant human VEGFA	Peprotech	100-20
NE-1000 Programmable Syringe Pump	KF Technology	NE-1000
Ficoll Paque Plus	GE Healthcare	17-1440-02
Anti-human CD14-PE, human recombinant clone: REA599, PE	Miltenyi Biotech	130-110-519	AB_2655051
Pan Monocyte Isolation Kit, human	Miltenyi Biotech	130-096-537
Anti-human CD16-PE, human recombinant clone: REA423, PE	Miltenyi Biotech	130-106-762	AB_2655403
LS columns	Miltenyi Biotech	130-042-401
QuadroMACS Separator	Miltenyi Biotech	130-090-976
Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate	ThermoFisher	H1399
Silicone tubing	IBIDI	10841
Elbow Luer Connector	IBIDI	10802
Female Luer Lock Coupler	IBIDI	10823
Luer Lock Connector Female	IBIDI	10825
In-line Luer Injection Port	IBIDI	10820
Ar1 confocal microscope	Nikon
40x objective	Nikon	40x 0.6 CFI ELWD S Plane Fluor WD:3.6-2.8mm correction 0-2mm
ImageJ Software	NIH