Gelijktijdige Cryosectioning van meerdere knaagdier hersenen

Samenvatting

Hier presenteren we een protocol om te bevriezen en afdeling hersenweefsel van meerdere dieren als een tijdbesparende alternatief voor één hersenen verwerken. Dit vermindert kleuring variabiliteit tijdens immunohistochemistry en vermindert de tijd cryosectioning en beeldvorming.

Samenvatting

Histologie en immunohistochemistry zijn routine analysemethoden te visualiseren van microscopische anatomie en lokaliseren van eiwitten in biologische weefsels. In neurowetenschap, evenals een overvloed van andere wetenschappelijke disciplines, worden deze technieken gebruikt. Immunohistochemistry kan worden gedaan op dia gemonteerd weefsel of de zwevende delen. Voorbereiding van monsters dia gemonteerde is een intensief proces van tijd. Het volgende protocol voor een techniek, genaamd de Megabrain, verminderd de tijd genomen om cryosection en mount hersenweefsel door tot 90% door het combineren van meerdere hersenen in een enkele diepgevroren blok. Bovendien, deze techniek verminderd variabiliteit tussen de rondes, in een grote histochemische studie kleuring gezien. De huidige techniek is geoptimaliseerd voor het gebruik van knaagdier hersenweefsel in downstream immunohistochemische analyses; echter kan het worden toegepast op verschillende wetenschappelijke gebieden die gebruikmaken van cryosectioning.

Inleiding

Hier presenteren we het protocol voor een nieuwe methode, die wij Megabrain noemen, ontwikkeld om meerdere knaagdier gelijktijdig voor downstream immunohistochemische procedures hersenen cryosection. Een Megabrain zorgt voor de productie van afzonderlijke dia's met weefsel van meerdere dieren. Deze techniek is geoptimaliseerd voor het knippen van coronale secties uit 9 volwassen ratten hemisferen, of 5 volwassen volledige hersenen, tegelijkertijd. De techniek is daarom meest toepasselijke in grote immunohistochemische studies of andere analyses gedaan op dia gemonteerde hersenweefsel van een grote cohort van dieren.

Immunohistochemistry impliceert het gebruik van specifieke antilichamen gericht tegen proteïnen van belang om te begrijpen en karakteriseren van hun expressie en cellulaire veranderingen in specifieke weefsel^1,2,3. Het gebruik van immunohistochemistry heerst in onderzoek neurowetenschap, onder andere wetenschappelijke disciplines, helpend in het cellulaire en moleculaire begrip van de hersenen-⁴. Grootschalige studies waarbij veel dieren en delen van de hersenen kunnen zowel de resource en de tijd intensief zijn. Als zodanig, is er een veelzijdig grondgedachte achter de ontwikkeling van het Megabrain: om tijd doorgebracht cryosectioning, montage en kleuring van weefsel, tijdens het gebruik bijgevolg minder reagentia. Bovendien is de mogelijkheid om het proces te stroomlijnen en vlek meerdere hersenen in dezelfde ronde draagt bij tot verlichting van enkele van de variabiliteit tussen de partijen, een beperking van immunohistochemistry³kleuring. Daarnaast segmenteren van een Megabrain is een tijdbesparende alternatief voor het segmenteren van individuele bevroren knaagdier hersenen en zorgt voor een snelle vergelijking van weefsel tussen dieren of zelfs behandelgroepen door microscopie technieken.

Protocol

De Megabrain-techniek is geoptimaliseerd met behulp van geheel en hemisected hersenen van mannelijke volwassen C57Bl6 muizen⁵, jonge Sprague-Dawley ratten en volwassen Sprague-Dawley ratten die transcardially geperfundeerd met 1 x fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS waren) gevolgd door 4% paraformaldehyde⁶. Vergelijkbare uitkomsten kunnen worden bereikt in andere stammen van de muis en rat, in beide geslachten en op verschillende leeftijden. De studie voor het genereren van gegevens voor dit manuscript jonge Sprague-Dawley ratten gebruikt en is goedgekeurd door de Universiteit van Arizona institutionele dierenverzorgers en gebruik Comité, en proefdieren werden verzorgd volgens de gids voor de zorg en het gebruik van laboratorium Dieren⁷.

1. Cryoprotection van geperfundeerd hersenen

1. Volgende succesvolle transcardial perfusie⁶, de volledige hersenen^6,8 van dieren te verzamelen en na oplossen door te plaatsen in een 25 mL flesje van 4% paraformaldehyde in PBS gedurende 24 uur.
   Let op: Paraformaldehyde is een giftige weefsel fixatief; voorzichtig behandelen. Paraformaldehyde overboeken naar een specifiek gelabelde afval container waarmee zijn concentratie en het volume binnen een chemische zuurkast en klik vervolgens op te slaan in het chemisch afval kabinet totdat verwijderd door chemische veiligheid of goed opgeleid personeel.
2. Na 24 uur is verstreken, in een zuurkast, verwijder hersenen uit 4% paraformaldehyde met behulp van een spatel. Breng de hersenen in een flesje van ongeveer 20 mL 15% sacharoseoplossing in 1 x Tris-gebufferde zoutoplossing (TBS) totdat de hersenen zinkt naar de bodem van de flacon (ongeveer 24 h).
3. Daarop overbrengen in de hersenen een flesje ongeveer 20 ml 30% sacharoseoplossing in 1 x TBS, totdat de hersenen naar de bodem van de flacon (ongeveer 24-48 h zinkt).

2. brain bevriezing

1. Plaats een bekerglas van 500 mL glas op een bedje van droog ijs in een ijsemmer. Giet 300 – 400 mL tolueen (2 methyl-butaan) in het bekerglas van glas.
2. Laat de temperatuur van de tolueen te bereiken tussen-45 ° C en -50 ° C. Monitoren en onderhouden van deze temperatuurbereik met een thermometer, het constant gedurende de hele procedure te houden. Ervoor dat de temperatuur lezingen zijn genomen uit het midden van de oplossing, en niet tijdens het aanraken van de onderkant of zijkant van het bekerglas.
3. Vul op de benchtop, een wegwerp schimmel te embedding (zie lijst van de materialen) ongeveer 1/2 vol met optimale snijden temperatuur (OCT; Zie Tabel van materialen) Compound. Ervoor zorgen dat er geen luchtbellen in de LGO. Als er luchtbellen verwijderen met een spatel of naald.
4. De eerste hersenen uit de flacon van 30% sucrose verwijderen met een spatel. Op dit punt, bevriezen ofwel hersenen geheel of hemisect, afhankelijk van het ontwerp van de studie.
   1. Gebruik voor hemisected de hersenen, een nieuwe scheermesje te maken van een schoon gesneden door het weefsel te scheiden van de hemisferen. Als niet vereist voor de studie, verwijdert u het cerebellum en de bulbus bollen in dit stadium. Als het cerebellum nodig is voor de studie, wordt voorgesteld om te snijden een vlak stuk posterieure eind van de hersenen om hulp van de hersenen in staande recht in de mal. Als de studie alleen weefsel van een gelokaliseerde regio vereist, kan een knaagdier hersenen-matrix worden gebruikt voor het blokkeren van de hersenen op basis van bekende coördinaten.
5. Geven de hersenen een numeriek systeem naamgeving. Teken een diagram zoals afgebeeld in Figuur 1. Schrijf het nummer van de eerste hersenen worden geplaatst in de mal van de Megabrain in positie 2, positie 1 verlaten als een spatie om te helpen bij een snelle identificatie van de richting waarin de hersenen waren bevroren.
6. Met behulp van botte pincet of pincet, halen de hersenen in positie 1 worden geplaatst. Oriënteren op de hersenen met de kant te snijden eerste naar boven. De hersenen in de LGO in de juiste locatie, met behulp van het pincet te zijn positie aanpassen tot het lager onafhankelijk staat.
7. Herhaal stap 2.3-2.5 voor de resterende hersenen/hemisferen worden bevroren in posities 3 – 10. Vermijd plaatsing hersenen/hemisferen in een symmetrische indeling.
8. Bekijk alle 9 hersenen in de Megabrain schimmel. Zodra de hersenen staan zelfstandig rechtop, en goed georiënteerd in de LGO (zoals weergegeven in figuur 2B), toevoegen meer OCT aan de mal (tot de bovenkant van de hersenen vallen). Opnieuw, ervoor zorgen dat er geen zichtbare luchtbellen in de LGO.
9. Gebruik het pincet te houden van de hoek van de mal, ervoor te zorgen dat de verlostang doen niet gedeeltelijk worden ondergedompeld in de LGO (figuur 3A). Voorzichtig om te houden van het niveau van de schimmel, lager de mal in de tolueen (-45 ° C tot-50 ° C) zodat het onderste derde van de mal is ondergedompeld. Houd het hier om eventuele luchtbellen in de LGO te stijgen naar de oppervlakte en weg van het weefsel (figuur 3B).
10. Na 30 s, lagere de hele schimmel in het tolueen en de introductie van de verlostang, waardoor de Megabrain ondergedompeld gedurende ten minste 3 minuten (Figuur 3 c). Verzekert dat schimmel is niveau, zodat de hersenen blijven rechtop en equidistante (figuur 3D).
11. Gebruik het pincet te verwijderen van de schimmel met de bevroren, OCT ingesloten na 3 min, hersenen (figuur 3E) van de tolueen.
12. Onmiddellijk, de schimmel en de inhoud ervan wikkel in aluminiumfolie en geef deze het label met de dierlijke cijfers of Megabrain identificatie. Raak de bevroren Megabrain zo spaarzaam mogelijk om te voorkomen dat het ontdooien van het weefsel.
13. Deze Megabrain kan nu worden overgedragen naar een vriezer van-20 ° C en opgeslagen gedurende ten minste 24 h.
    Opmerking: Protocol kan hier worden onderbroken en de Megabrain kan worden opgeslagen bevroren totdat cryosectioning plaatsvindt.

3. voorbereiding van de Megabrain voor het segmenteren op de cryostaat

1. Het kabinet temperatuur van de cryostaat instellen tot-19 ° C. Zorg ervoor dat deze temperatuur wordt bereikt voordat u verdergaat. In de gehele afdelen, zorgen dat de temperatuur in de kast tussen-18 ° C en -20 ° C. blijft
2. Neem de Megabrain uit de diepvries van-20 ° C en plaats het in de cryostaat. Plaats ook een klauwplaat van de afmetingen van de juiste grootte, en twee dunne omver te werpen schilderskwast in de cryostaat. Laat de Megabrain zowel de chuck in de cryostaat gedurende ten minste 15 minuten om te komen tot de temperatuur van de cryostaat.
3. Label dia's op de juiste manier met het identificatienummer van de Megabrain en het dianummer. Leg deze dia's op een dia warmer (35-45 ° C).
4. Het uitpakken van de Megabrain van de aluminiumfolie. Gebruik een scheermesje te snijden verticaal de hoeken van de schimmel makkelijk verwijderen van het blok van LGO worden toegestaan van de schimmel (figuur 4A).
5. Afzien van een dunne laag (ongeveer 3 mm dik) van LGO op de chuck.
6. Snel, met minimale contact tussen de vingers en de LGO, plaats u de Megabrain op de chuck, in de gewenste richting. Grote pincet kan ook worden gebruikt voor deze stap te minimaliseren ontdooien. Voordat u begint met de sectie, laat de Megabrain gemonteerd chuck in de cryostaat gedurende 15-20 minuten om de LGO's naar het volledig bevriezen.
7. Zodra de basislaag van LGO heeft bevroren, breng een dikke laag van 2 mm OCT rond de zijkanten van de Megabrain en laten uitvoeren naar beneden vanaf de zijkanten op de chuck. Dit helpt beveiligen van de Megabrain naar de chuck. Nogmaals, voordat u verdergaat, laat de chuck Megabrain gemonteerd in de cryostaat gedurende 15-20 minuten om de LGO te bevriezen.
8. Gebruik een scheermesje te verwijderen alle overtollige OCT van de partijen of de onderkant van de chuck (figuur 4B).

4. Cryosectioning de Megabrain

1. Voordat u begint, zorg ervoor dat een bekerglas van ten minste 20 mL 1 x PBS toegankelijk.
2. Plaats de chuck, gemonteerd met de Megabrain, in het hoofd van de chuck op de cryostaat (figuur 4B).
3. Stel de cryostaat te snijden op de gewenste dikte. De huidige methode is geoptimaliseerd voor 10 µm tot 50 µm secties.
4. Trim de LGO en weefsel zoals die nodig zijn voor het bereiken van de gewenste hersenen regio voor weefsel collectie (figuur 4C).
5. Als u klaar bent voor het verzamelen van weefsel, de anti-roll plaat verlagen, totdat het rust op het podium en draai aan de hendel van de cryostaat te nemen van één afdeling. Langzaam til van de anti-roll plaat, voorzichtig dat de verdeelde Megabrain niet is gekoppeld aan de plaat van de anti-roll en niet naast het podium Figuur 4 d valt).
6. Zachtjes kunt de schilderskwast uitrollen van de Megabrain-sectie totdat het ligt plat op het podium van de cryostaat (figuur 5A). (Indien nodig, houd de LGO plat met behulp van de verfborstels ter voorkoming van rollen).
7. Dia verwijderen uit dia warmer en beweeg de dia, de labelkant omlaag, over de Megabrain-sectie in het werkgebied de sectie vast te houden aan de dia toe te staan.
8. Snel een daling van 1 x PBS van toepassing op elke weefselsectie op de dia en laat dit drogen totdat ze hebben platte geborsteld niet (zie stap 4.9).
9. Gebruik een fijne omver te werpen verfkwast gedipt in 1 x PBS borstel uit alle bubbels in het weefsel te ontvouwen van het weefsel, dus het ligt plat op de dia (figuur 5B). Wees voorzichtig niet te veranderen van de positie van de secties van de hersenen en dus verliest de relatieve positie naar de andere weefselsecties. Manipuleren van het weefsel zorvuldig te vermijden van tranen. Houd hersenen secties uit de buurt van de randen van de dia, zoals perifere ruimte benodigd voor een dekglaasje aan PAP pen in sommige kleuring protocollen is.
10. Plaats de dia weer op de dia warmer en droog zijn voor 45 min. Cover zo nodig om te voorkomen dat stof afwikkeling op het weefsel. Eenmaal droog, slaat u de dia's in bij-80 ° C tot verder gebruik.

Resultaten

Een positief eindresultaat voor deze procedure is weefsel dat ligt plat op de dia, met geen blaasjes of tranen, in de richting waarin ze werden bevroren. Weefselsecties zijn gelijkmatig uit elkaar en herkenbaar als gevolg van goede plaatsing van de hersenen in de LGO en de goede notatie zoals aangetoond in Figuur 1. Ervan uitgaande dat het hersenweefsel werd bijeengezocht uit dieren van dezelfde leeftijd, en dat het weefsel was correct wordt uitgelijnd in de ...

Discussie

Dit moet worden beschouwd tijdens deze procedure dat de temperatuur van de Megabrain en de omgeving moet voortdurend worden gecontroleerd om te voorkomen dat ontdooien en weer bevriezen van het weefsel. De hersenen kan alleen worden verwijderd uit de diepvries van-20 ° C tot aan 3 keer als telkens als het wordt aangeraakt en links in de cryostaat, met een warmere wisselende temperatuur, het weefsel ontdooit en refreezes, waardoor een gelei als textuur en abnormale weefsel integriteit¹⁰. Daarom is ...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Andwin scientific tissue-tek CRYO-OCT compound (case of 12)	Fisher Scientific	14-373-65
Thermo Scientific Shandon Peel-A-Way Disposable Embedding Molds	Fisher Scientific	18-41
Fisherbrand High Precision Straight Broad Strong Point Tweezers/Forceps	Fisher Scientific	12-000-128
Fisherbrand 20 mL HDPE Scintillation Vials with Polypropylene Cap	Fisher Scientific	03-337-23
Sucrose, poly bottle 2.5 kg	Fisher Scientific	S2-212	Zowel 15% als 30% sucroseconcentraties moeten worden gemaakt.
2-Methylbutaan (gecertificeerd), Fisher Chemical	Fisher Scientific	O3551-4
PYREX Tall-Form Beakers	Fisher Scientific	02-546E
Fisherbrand General Purpose Liquid-in-Glass Partial Immersion Thermometers (-50 to +50 °C)	Fisher Scientific	13-201-642
Fisherbrand Scoopula Spatula	Fisher Scientific	14-357Q
STANLEY Razor Blade	Grainger	4A807
Edge-Rite Microtome blades	Fisher Scientific	14-070-60
Microscope slides (1" frost) - white	Fisher Scientific	22-034-979
Gibco PBS (Phosphate Buffered Saline) 10x, pH 7.2	Fisher Scientific	70-013-032	Verdun voor gebruik tot 1X
15 stuks fijne penselen	Amazon	B079J12ZRV
PAP pen	abcam	ab2601
Chuck getoond in figuur 4 is op maat gemaakt door een laborant, maar vergelijkbare maten zijn commercieel verkrijgbaar bij andere bedrijven.	Electron Microscopy Sciences	EMS065