Methodenartikel

Isolatie van de Glomeruli en In Vivo Labeling van glomerulaire cel oppervlakte-eiwitten

DOI:

10.3791/58542

⸱

18 januari 2019

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Nephrology, Medical Faculty, Heinrich-Heine-University, 2Institute of Cellular and Integrative Physiology, University Medical Center Hamburg-Eppendorf

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hier presenteren we een protocol voor het lymfkliertest in vivo labelen van glomerulaire cel oppervlakte eiwitten met biotine. Dit protocol bevat informatie over hoe perfuse muis nieren, het isoleren van de glomeruli, en het uitvoeren van endogene immunoprecipitation van de proteïne van belang.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Proteïnurie vloeit voort uit de verstoring van het glomerulaire filter dat is samengesteld uit de fenêtré endotheel, glomerulaire kelder-membraan en podocytes met hun gleuf pessarium. De fijne structuur van de glomerulaire filter, met name de gleuf membraan, dat is afhankelijk van het samenspel van verschillende cel oppervlakte-eiwitten. Het bestuderen van deze cel-oppervlakte-eiwitten tot nu toe beperkt gebleven voor in vitro studies of histologische analyse. Hier presenteren we een lymfkliertest in vivo biotinylation labeling methode, waarmee de studie van de oppervlakte eiwitten glomerulaire cel onder fysiologische en pathofysiologische omstandigheden. Dit protocol bevat informatie over hoe perfuse muis nieren, het isoleren van de glomeruli, en het uitvoeren van endogene immunoprecipitation van een proteïne van belang. Halve kwantificatie van glomerulaire cel oppervlakte overvloed is beschikbaar met deze nieuwe methode, en alle eiwitten toegankelijk voor Biotine perfusie en immunoprecipitation kan worden bestudeerd. Bovendien, kan isolatie van de glomeruli met of zonder biotinylation verdere analyse van de glomerulaire RNA en eiwitten, evenals primair glomerulaire celkweek (dat wil zeggen, primaire podocyte celcultuur).

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Proteïnurie is een kenmerk van de glomerulaire letsel en meestal begeleidt verstoring van de glomerulaire filter1. Het glomerulaire filter is samengesteld uit de fenêtré endotheel, glomerulaire kelder-membraan en podocytes. De delicate moleculaire structuur van de glomerulaire filter is zeer dynamisch en onderhevig is aan cel oppervlakte-proteïne handel in beide gezonde en zieke nieren2,3,4,5,6 . Endocytose van cel oppervlakte-eiwitten is gebleken te zijn essentieel voor de overleving van de podocytes7. Nephrin en podocalyxin zijn transmembraan eiwitten uitgedrukt op podocytes. Nephrin is de ruggengraat van het middenrif glomerulaire gleuf, terwijl podocalyxin een coating van de voet van de secundaire processen van podocytes8,9,10sialoglycoprotein. Endocytotische handel eerder gebleken voor nephrin en podocalyxin3,11,12,13,14.

Tot de beste van onze kennis, is endocytose van cel oppervlakte-eiwitten niet nog is beschreven in glomerulaire endotheliale cellen van de literatuur. Echter uiting endotheliale cellen in het algemeen alle nodige eiwitten voor de verschillende soorten endocytose (dat wil zeggen, afhankelijk van de clathrin, vlot-afhankelijke endocytose)15,16. Daarom endothelial cel oppervlakte mensenhandel kan worden bestudeerd bij deze methode gebruikt, bijvoorbeeld, vasculaire endothelial (VE)-cadherine en intracellulaire adhesie molecuul (ICAM-2) als een cel oppervlak marker eiwitten voor glomerulaire endotheliale cellen17 .

Er bestaat helaas geen nauwkeurige in vitro model voor de delicate drie lagen glomerulaire filter in welke cel de oppervlakte-proteïne mensenhandel kan worden bestudeerd. Het doel van deze methode is dus om te studeren glomerulaire eiwit mensenhandel in vivo. Dit protocol bevat bovendien informatie over het isoleren van de glomeruli, waardoor verdere analyse van de glomerulaire RNA, eiwitten of cellen. Soortgelijke glomerulaire isolatie technieken zijn beschreven door verschillende groepen18,19.

Wij en anderen hebben vroeger ex vivo labeling van glomerulaire cel oppervlakte eiwitten door biotinylation2,3,4,20,21. Echter, in deze methode ex vivo geïsoleerde glomeruli werden blootgesteld aan mechanische stress, die invloed op endocytotische mensenhandel hebben kan. Als alternatief, immunofluorescentie labeling van glomerulaire cel oppervlakte-eiwitten is uitgebreid gebruikt in de literatuur2,20,22. Met deze methode echter slechts een klein aantal eiwitten binnen één dia kan worden geanalyseerd, en kwantificatie van immunofluorescentie beelden is vaak moeilijk.

Deze roman in vivo -methode biedt een betrouwbaar hulpmiddel om te studeren glomerulaire cel oppervlakte-proteïne overvloed en mensenhandel nauwkeurig in gezonde en zieke nieren, en het kan worden gebruikt als aanvulling op immunofluorescentie proeven.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Muizen zijn verkregen als een in-house ras uit de lokale dierenverzorgers faciliteit of Janvier Labs in Frankrijk. De onderzoeken werden uitgevoerd volgens de richtsnoeren in de gids voor de verzorging en het gebruik van proefdieren (Amerikaanse nationale instituten van gezondheid publicatie nr. 85-23, herziene versie van 1996). Alle dierproeven werden uitgevoerd volgens de relevante institutionele goedkeuringen (deelstaatregering LANUV verwijst naar nummer AZ:84-02.04. 2016.A435).

1. bereiding van de apparatuur, instrumenten en oplossingen

  1. Bereiden 1 L fosfaatgebufferde zoutoplossing aangevuld met 1 mM magnesiumchloride (MgCl2) en 0.1 mM calciumchloride (CaCl2) (PBSCM) en het filteren door middel van een steriel filter.
  2. 5 mL steriele PBSCM per muis voorbereiden perfusie en plaats deze op het ijs.
  3. Voorbereiden voor elke muis, 5 mL steriele PBSCM aangevuld met 0,5 mg/mL biotine.
  4. Voor elke muis, 5 mL steriele PBSCM bereiden en 0.8 x 108 magnetische kralen toe te voegen (bv., 200 µL van een 4 x 108 kralen/mL oplossing, zonder voorbehandeling) voor embolisatie kan leiden van de glomeruli. Bereid deze oplossing onder de cel cultuur Bank te houden van de magnetische kralen in de originele buis steriel. Plaats deze oplossing op het ijs.
  5. Bereid een blussen oplossing door 100 mM glycine toe te voegen aan PBSCM (5 mL per muis) en bewaar deze op ijs.
  6. Maak een oplossing van collagenase (0.378 U/mL collagenase A in steriele PBSCM). Per muis, 1 mL van de oplossing van collagenase Pipetteer in een tube 2 mL en plaats deze op het ijs.
  7. Voor het wassen, het bereiden van steriele PBSCM (zie stap 1.1) in een 50 mL tube en plaats deze op het ijs.
  8. Voor perfusie, gebruikt u een spuitpomp met een stroom van 2,0 mL/min.
  9. Een 10 mL injectiespuit met een naald 21G te bereiden. Plaats de punt van de naald in een 20-30 cm lange katheter (binnendiameter, ID = 0.58 mm). Verbinding maken met de katheter (ID 0.58 mm) met een 10 cm korte katheter (0,28 mm ID) en snijd het puntje van de kleinere katheter schuin voor een eenvoudige plaatsing in de aorta muis.
  10. Voor ligatuur procedures tijdens de operatie, knip drie 5-7 cm zijde draden (4-0 naar 6-0) per muis.
  11. Voorbereiding voor de operatie, 3 chirurgische klemmen, 2 chirurgische scharen, 2 pincet, 2 fijne pincet, 1 fijn schaar en wissers. Bereiden de narcose (bijvoorbeeld intraperitoneaal verdoving ketamine 100 mg/kg lichaamsgewicht en xylazine 5 mg/kg lichaamsgewicht).
  12. Voor isolatie van de glomeruli van twee nieren, door een 100 µm cel zeef, twee buizen van 50 ml en een magneet-catcher te gebruiken.
  13. CHAPS lysis-buffermengsel bereiden: 20 mM 3-[(3-cholamidopropyl)-dimethylammonio] -1-propanesulfonate (CHAPS); 20 mM Tris (hydroxymethyl)-aminomethan (Tris) pH 7.5; 50 mM sodiumchorlide (NaCl); 50 mM sodiumfluoride (NaF); 15 mM nb4P2O7; 0.1 mM ethyleendiamminetetra azijnzuuroplossing (NA2EDTA) pH 8.0; 2 mM sodiumorthovanadate; en 2 mM adenosinetriphosphat (ATP).
  14. Cool centrifuges tot 4 ° C.

2. operatie onder de Microscoop

  1. Anesthetize van de muis (bijvoorbeeld met ketamine/xylazine intraperitoneally, zie stap 1.11). Het uitvoeren van de teen-snuifje test om te bevestigen goede verdoving.
  2. Desinfecteer de ventrale zijde van de muis met 70% isopropanol.
  3. Uitvoeren van een mediane snede via de huid van het bekken naar het borstbeen en verwijder de huid van de buik fascia met pincet. Snijd de huid aan beide zijden in het midden van de buik met een chirurgische schaar.
  4. Wijzigen van chirurgische gereedschappen. Een mediane snede van de xiphoid toepassen op de blaas door de buikspier laag en verdeel ze in vier kwadranten met pincet en chirurgische scharen. Bevestig het bovenste twee opzij met klemmen richting de hals van de muis met twee chirurgische klemmen.
    Opmerking: De buik wordt nu geopend.
  5. Zet viscerale organen opzij met een steriel doekje en snijd het hepatische-phrenic ligament met een fijne schaar.
  6. Bereiden een afbinding (met een zijden draad 4-0 naar 6-0) rond de aorta proximale van de renale bloedvaten op de hoogte van de bijnier met twee fijne pincet. Draai de proximale aorta afbinding af te schaffen doorbloeding met een pincet.
  7. De distale aorta van andere weefsels, fascia en vet vrij en bereiden een afbinding rond de craniale hepatische/mesenterische slagader van de renale bloedvaten met fijne chirurgische pincetten.
  8. Bereiden van een afbinding (met een zijden draad 4-0 naar 6-0) rond de aorta distale van de renale bloedvaten en klem de vena cava en de aorta op het hoogtepunt van de bifurcatie.
  9. Snij een klein gaatje in de aorta distale aan de renale bloedvaten zodat het gat de helft van de diameter van de aorta is. Zet de katheter in de aorta en repareren met de bereid ligatuur.
    Let op: Vermijd bubbels in de perfusie-systeem om te voorkomen dat de lucht longembolie.
  10. Start perfusie met de ijskoude PBSCM op een debiet van 2 mL/min.
  11. Snijd een gat in de renale ader op het niveau van de renale bloedvaten met een fijne chirurgische schaar en draai de afbinding rond de lever en de lymfklieren slagaders.
    Opmerking: Nieren bleke moeten wenden na het starten van de perfusie.

3. in Vivo Biotinylation

  1. Veranderingen de spuit bubble-vrij om ijskoude PBSCM aangevuld met 0,5 mg/mL Biotine voor oppervlak etikettering en perfuse van de nieren met 5 mL op een debiet van 2 mL/min.
    Opmerking: Vermeng de PBSCM oplossingen (bijvoorbeeld door te draaien aan de buizen 50 mL) voorzichtig om te voorkomen dat bellen binnen de oplossing vormen. Na aspiratie van de oplossing binnen de spuit, blaasjes of lucht van de spuit te evacueren. Gebruik een extra canule (21G) op de injectiespuit te vullen de ruimte in de canule die is aangesloten op het systeem van de katheter. Ten slotte, stok de spuit in de canule met de katheter zonder bubbels.
  2. Wijzig de bubble-free spuit ijskoude PBSCM aangevuld met 100 mM glycine aan de glomeruli doven en perfuse met 5 mL op een stroom van 2 mL/min.
  3. Wijziging de spuit bubble-vrij om ijskoude PBSCM aangevuld met 200 μl magnetische kralen/mL en perfuse nieren op 2 mL/min.
    Opmerking: Op het oppervlak van de nier, embolisatie kan leiden van de glomeruli met bruin magnetische kralen worden zichtbaar.

4. isolatie van de Glomeruli van twee nieren

  1. Nieren op de Hilus verwijderen en verwijder de capsule. Plaats de nieren op ijs in 15 mL PBSCM in een 10 cm schotel voor de cultuur van de cel. De muis met cervicale dislocatie onder verdoving na de oogst van de nieren euthanaseren. De chirurgie en perfusie procedures duren ongeveer 20-22 min.
  2. Nieren in de kleinste stukjes gesneden mogelijk met een nieuwe dubbel-edge mes. Verplaatsen van het weefsel in een 2 mL-buis met 1 mL collagenase A (zie stap 1.6) en verteren bij 37 ° C gedurende 30 minuten. Voor en na vertering, meng zachtjes met een 1000 μL pipet knippen.
  3. Spoel het verteerd weefsel door een 100 μm cel zeef met ijskoude PBSCM. Voorzichtig gebruik de cel-schraper mince de resterende weefsel via de cel zeef en spoel het na met ijskoude PBSCM daarna tot een totaal volume van 50 mL.
  4. De schorsing bij 4 ° C 500 x g centrifugeren voor 5 min. Verwijder het supernatant en resuspendeer de pellet met iets minder dan 1,5 mL ijskoud PBSCM terwijl vortexing de pellet. Daarna zet de glomerulaire schorsing in een nieuwe 2 mL-buis.

5. wassen

  1. Gebruik de magneet-catcher te trekken van de glomeruli aan de ene kant. Wacht 1 minuut voordat de glomeruli hebben verplaatst naar de magneet.
  2. Verwijder de bovendrijvende vloeistof met een 1000 μL pipet terwijl de tube 2 mL in de magneet-catcher blijft. Tijdens het eerste en tweede wassen stappen (zie stap 5.3), 250 μL van supernatant blijft in de buis om te voorkomen dat het verlies van de glomeruli. Deze procedure snel en voorkom buisvormige structuren zinken naar de bodem van de buis te laten uitvoeren.
    Opmerking: De procedure wassen zal langer duren anders.
  3. Neem de tube 2 mL van magneet catcher en voeg 1 mL van PBSCM, pipet op en neer (zeer belangrijk), dan vortex.
  4. De buis terug te zetten in de magneet catcher en opnieuw te beginnen met stap 5.2.
  5. Herhaal de stappen wassen totdat de zuiverheid van de glomeruli 90% heeft bereikt. Onderzoeken hiervoor een representatieve hoeveelheid van het supernatans dat onder een microscoop (40-100 X).
    Opmerking: De Glomeruli wordt weergegeven als ronde structuren met bruin magnetische kralen. Langgerekte structuren zijn buisvormige fragmenten en gratis magnetische kralen als bruin ronde stippen. Puin van de cel kan worden weergegeven als omvangrijk structuren.
  6. Als zuiverheid is bereikt, de telling van de glomeruli te schatten door ontbinding van de glomeruli in 1 mL PBSCM. Na het mengen, neem een aliquoot deel van 10 μL en tellen van de glomeruli onder de Microscoop. Het aantal glomeruli met de volgende vergelijking berekenen: definitieve aantal glomeruli = aantal glomeruli in 10 μL aliquoot x 100.
  7. Succesvolle Isolatievan glomeruli leidt tot een bereik van 10.000-40.000 glomeruli.

6. eiwit extractie en Immunoprecipitation (IP)

  1. Verzamelen glomeruli door centrifugeren bij 4 ° C bij 6800 x g gedurende 5 min. de bovendrijvende vloeistof verwijderen tijdens het gebruik van een magneet catcher en resuspendeer de pellet in ijskoude lysis-buffermengsel (bv., 30.000 glomeruli in 300 μL; CHAPS, zie stap 1.11). Meng de monsters met de homogenizer van een weefsel op de hoogste snelheid voor 30 s en lyse hen op het ijs gedurende 30 minuten.
  2. Onoplosbaar materiaal verwijderen door centrifugeren bij 15.000 x g gedurende 30 min. voor 4 ° C. Pipetteer het supernatant waarin de cel lysate in een nieuwe 1,5 mL-buis. Gooi de pellet.
  3. De eiwitconcentratie van het supernatans dat meten met behulp van een bicinchoninic (BCA)-op basis van de methode volgens de instructies van de fabrikant. Een succesvolle lysis van 30.000 glomeruli levert aan een glomerulaire eiwit bedrag van 700-1000 µg/mL. Aanpassen aan gelijke eiwit bedragen met lysis-buffermengsel.
  4. Neem een aliquoot deel van 10% van het totale volume voor glomerulaire lysate en voeg 2 x Laemmli + dithiothreithol (DTT) voordat de incubatie gedurende 5 min bij 95 ° C.
  5. Incubeer voor IP, de rest van de lysate met daar agarose kralen 's nachts bij 4 ° C op een overhead shaker.
  6. Centrifugeer agarose kralen bij 1000 x g gedurende 3 min bij 4 ° C, de bovendrijvende vloeistof verwijderen en toevoegen van 800 μL van lysis buffer te wassen de kralen voor binding aan aspecifieke eiwitten.
  7. Herhaal de wash 3 keer en het supernatant volledig verwijderen.
  8. Voeg 30 μL van 2 x Laemmli + DTT en Incubeer bij 95 ° C gedurende 5 min.
  9. De lysate laden en IP-sondes op een 10% SDS gel en voert u de gel SDS V 70 voor 30 min en vervolgens bij 20 mA per gel voor 1,5 h. vlek daarna de gel voor 2 h bij 200 mA op een membraan van het nitrocellulose.
  10. Het blokkeren van het membraan van het nitrocellulose's nachts bij 4 ° C met 5% bovien serumalbumine (BSA) in het wassen van de buffer.
  11. Incubeer het membraan met de antistoffen van belang 's nachts bij 4 ° C. Wassen met buffer 3 keer gedurende 5 minuten op een shaker wassen en het membraan met de HRP-gelabeld secundair antilichaam gedurende 1 uur bij kamertemperatuur incuberen. Herhaal de stap wassen.
  12. Visualiseer de lysate en immunoprecipitation sondes op het membraan met behulp van een super resolutie chemiluminescentie agent met een CCD-camera.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Om te isoleren glomeruli nauwkeurig, moet er eerst lymfkliertest nieren met PBSCM perfuse. Perfusie met PBSCM draait nieren bleke(Figuur 1). Embolisatie kan leiden van de glomeruli met magnetische kralen zijn zichtbaar als bruine puntjes op het oppervlak van de nier (Figuur 1B). Isolatie van de glomeruli met de magneet catcher kan besmetting met renale tubuli (Figuur 1

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De onderhavige methode kan succesvolle Isolatievan glomeruli te onderzoeken glomerulaire RNA of eiwit. Daarnaast kunnen glomerulaire primaire celculturen worden uitgevoerd vanaf de geïsoleerde glomeruli. Als biotine wordt vereffend voor glomerulaire isolatie, kan etikettering van glomerulaire cel oppervlakte eiwitten worden uitgevoerd. Met deze methode in vivo glomerulaire cel oppervlakte-proteïne mensenhandel kan worden bestudeerd, en semi-kwantificatie van eiwit overvloed is mogelijk. De belangrijkste stappen ...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs bedanken Blanka Duvnjak voor haar uitzonderlijke technische bijstand. Dit werk werd gesteund door de Deutsche Forschungsgemeinschaft (www.dfg.de) WO1811/2-1 aan de M.W. en IQ QU280/3-1 De funder had geen rol in de studie ontwerp, gegevensverzameling, gegevensanalyse, besloten tot bekendmaking en voorbereiding van het manuscript.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Motic SMZ168 BLMoticSMZ168BLmicroscoop voor muizenchirurgie
KL1500LCDPulch en Lorenz microscopie150500licht voor muizenchirurgie
Rompun (Xylazin) 2%BayerPZN:01320422anesthesie
MicrofederschereBraun, AesculapFD100Rfijne schaar, voor snede in de aorta
Durotip Feine ScherenBraun, AesculapBC210Rvoor buiksnede
Anatomische PinzetteBraun, AesculapBD215Rvoor chirurgie tot het openen van de buik
PräparierklemmeAesculapBJ008Rvoor chirurgie 
SeraflexSerag WiessnerIC108000zijdedraad
Ketamine 10%Medistaranesthesie
Rompun (Xylazin) 2%Bayeranesthesie
Fine Bore Polythene Tubing ID 0.28mm OD 0.61mmPortex800/100/100Katheter
Fine Bore Polythene Tubing ID 0.58mm OD 0.96mmPortex800/100/200Katheter
Harvard apparatus 11 PlusHarvard Apparatus70-2209seringspomp
EZ-link Sulfo-NHC-LC-BiotinThermo Scientific21335biotine
Dynabeads Untouched Mouse T-cellsInvitrogen11413Dom glomeruli te emboliseren
Collagenase ARoche10103578001om nierweefsel te verteren
DynaMag-2Invitrogen123.21DMagnetische catcher
100µm cel kleuringGreiner-bio542000voor glomerulaire isolatie
Axiovert 40 CFLZeissniet beschikbaarom glomerulaire zuiverheid te bevestigen
TissueRuptorQuiagen9002755Weefselhomogenisator
CHAPSSigma-AldrichC3023voor lysisbuffer
Tris-HCLSigma-AldrichT5941voor lysisbuffer
NaClVWR chemicals27810295voor lysisbuffer
NaFSigma-Aldrich201154voor lysisbuffer
EDTASigma-AldrichE5134voor lysisbuffer
ATPSigma-Aldrich34369-07-8voor lysisbuffer
Pierce BCA Protein Assay KitThermo Scientific23225Volg de instructies van de fabrikant
nephrin antilichaamProgenGP-N2voor westernblot
Polyclonal goat anti-podocalyxin antilichaamR&D SystemsAF15556-SPvoor westernblot
Streptavidin Agarose ResinThermo Scientific20347voor immunoprecipitatie
Protein A sepharose CL-4BGE Healthcare17096303voor immunoprecipitatie
polyclonal rabbit anti-p57 antilichaamSCBTsc-8298voor Immunohistochemie
muis monoklonaal anti-beta actine antilichaam, clone AC-74Sigma-AldrichA2228Western blot ladingscontrole
rabbit anti-p44/42celsignalering4695voor westernblot
Pierce High sensitivity streptavidin-HRPThermo Scientific21130voor westernblot
polyclonal muis ICAM-2 antilichaamR&D SystemsAF774voor westernblot
polyclonal muis anti-VE-cadherinR&D SystemsAF1002voor westernblot

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Jefferson, J. A., Alpers, C. E., Shankland, S. J. Podocyte biology for the bedside. American Journal of Kidney Disease. 58 (5), 835-845 (2011).
  2. Konigshausen, E., et al. Angiotensin II increases glomerular permeability by beta-arrestin mediated nephrin endocytosis. Scientific Reports. 6, 39513(2016).
  3. Quack, I., et al. beta-Arrestin2 mediates nephrin endocytosis and impairs slit diaphragm integrity. Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 103 (38), 14110-14115 (2006).
  4. Quack, I., et al. PKC alpha mediates beta-arrestin2-dependent nephrin endocytosis in hyperglycemia. Journal of Biological Chemitry. 286 (15), 12959-12970 (2011).
  5. Swiatecka-Urban, A. Endocytic Trafficking at the Mature Podocyte Slit Diaphragm. Frontiers in Pediatrics. 5, 32(2017).
  6. Swiatecka-Urban, A. Membrane trafficking in podocyte health and disease. Pediatric Nephrology. 28 (9), 1723-1737 (2013).
  7. Soda, K., et al. Role of dynamin, synaptojanin, and endophilin in podocyte foot processes. The Journal of Clinical Investigation. 122 (12), 4401-4411 (2012).
  8. Kestila, M., et al. Positionally cloned gene for a novel glomerular protein--nephrin--is mutated in congenital nephrotic syndrome. Molecular Cell. 1 (4), 575-582 (1998).
  9. Martin, C. E., Jones, N. Nephrin Signaling in the Podocyte: An Updated View of Signal Regulation at the Slit Diaphragm and Beyond. Frontiers in Endocrinology (Lausanne). 9, 302(2018).
  10. Nielsen, J. S., McNagny, K. M. The role of podocalyxin in health and disease. Journal of the American Society of Nephrology. 20 (8), 1669-1676 (2009).
  11. Yasuda, T., Saegusa, C., Kamakura, S., Sumimoto, H., Fukuda, M. Rab27 effector Slp2-a transports the apical signaling molecule podocalyxin to the apical surface of MDCK II cells and regulates claudin-2 expression. Molecular Biology of the Cell. 23 (16), 3229-3239 (2012).
  12. Tossidou, I., et al. Podocytic PKC-alpha is regulated in murine and human diabetes and mediates nephrin endocytosis. Public Library of Science One. 5 (4), 10185(2010).
  13. Qin, X. S., et al. Phosphorylation of nephrin triggers its internalization by raft-mediated endocytosis. Journal of the American Society of Nephrology. 20 (12), 2534-2545 (2009).
  14. Waters, A. M., et al. Notch promotes dynamin-dependent endocytosis of nephrin. Journal of the American Society of Nephrology. 23 (1), 27-35 (2012).
  15. Zhang, X., Simons, M. Receptor tyrosine kinases endocytosis in endothelium: biology and signaling. Arteriosclerosis Thrombosis and Vascular Biology. 34 (9), 1831-1837 (2014).
  16. Maes, H., Olmeda, D., Soengas, M. S., Agostinis, P. Vesicular trafficking mechanisms in endothelial cells as modulators of the tumor vasculature and targets of antiangiogenic therapies. Federation of European Biochemical Societies Journal. 283 (1), 25-38 (2016).
  17. Satchell, S. C., et al. Conditionally immortalized human glomerular endothelial cells expressing fenestrations in response to VEGF. Kidney International. 69 (9), 1633-1640 (2006).
  18. Takemoto, M., et al. A new method for large scale isolation of kidney glomeruli from mice. American Journal of Pathology. 161 (3), 799-805 (2002).
  19. Liu, X., et al. Isolating glomeruli from mice: A practical approach for beginners. Experimental and Therapeutic Medicine. 5 (5), 1322-1326 (2013).
  20. Haase, R., et al. A novel in vivo method to quantify slit diaphragm protein abundance in murine proteinuric kidney disease. Public Library of Science One. 12 (6), 0179217(2017).
  21. Satoh, D., et al. aPKClambda maintains the integrity of the glomerular slit diaphragm through trafficking of nephrin to the cell surface. Journal of Biochemistry. 156 (2), 115-128 (2014).
  22. Tomas, N. M., et al. Thrombospondin type-1 domain-containing 7A in idiopathic membranous nephropathy. New England Journal of Medicine. 371 (24), 2277-2287 (2014).
  23. Daniels, G. M., Amara, S. G. Selective labeling of neurotransmitter transporters at the cell surface. Methods in Enzymology. 296, 307-318 (1998).
  24. Ougaard, M. K. E., et al. Murine Nephrotoxic Nephritis as a Model of Chronic Kidney Disease. International Journal of Nephrology. 2018, 8424502(2018).
  25. Salant, D. J., Darby, C., Couser, W. G. Experimental membranous glomerulonephritis in rats. Quantitative studies of glomerular immune deposit formation in isolated glomeruli and whole animals. Journal of Clinical Investigation. 66 (1), 71-81 (1980).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Glomerular IsolationIn Vivo BiotinylationCell Surface Protein LabelingKidney PerfusionMagnetic Bead PurificationGlomerular Cell Surface ProteinsNephrin Podocalyxin AnalysisImmunoprecipitation MethodProtein Trafficking StudyPrimary Podocyte Culture

Gerelateerde artikelen