Hier presenteren we een protocol voor het lymfkliertest in vivo labelen van glomerulaire cel oppervlakte eiwitten met biotine. Dit protocol bevat informatie over hoe perfuse muis nieren, het isoleren van de glomeruli, en het uitvoeren van endogene immunoprecipitation van de proteïne van belang.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Isolatie van de Glomeruli en In Vivo Labeling van glomerulaire cel oppervlakte-eiwitten
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Proteïnurie vloeit voort uit de verstoring van het glomerulaire filter dat is samengesteld uit de fenêtré endotheel, glomerulaire kelder-membraan en podocytes met hun gleuf pessarium. De fijne structuur van de glomerulaire filter, met name de gleuf membraan, dat is afhankelijk van het samenspel van verschillende cel oppervlakte-eiwitten. Het bestuderen van deze cel-oppervlakte-eiwitten tot nu toe beperkt gebleven voor in vitro studies of histologische analyse. Hier presenteren we een lymfkliertest in vivo biotinylation labeling methode, waarmee de studie van de oppervlakte eiwitten glomerulaire cel onder fysiologische en pathofysiologische omstandigheden. Dit protocol bevat informatie over hoe perfuse muis nieren, het isoleren van de glomeruli, en het uitvoeren van endogene immunoprecipitation van een proteïne van belang. Halve kwantificatie van glomerulaire cel oppervlakte overvloed is beschikbaar met deze nieuwe methode, en alle eiwitten toegankelijk voor Biotine perfusie en immunoprecipitation kan worden bestudeerd. Bovendien, kan isolatie van de glomeruli met of zonder biotinylation verdere analyse van de glomerulaire RNA en eiwitten, evenals primair glomerulaire celkweek (dat wil zeggen, primaire podocyte celcultuur).
Inleiding
Proteïnurie is een kenmerk van de glomerulaire letsel en meestal begeleidt verstoring van de glomerulaire filter1. Het glomerulaire filter is samengesteld uit de fenêtré endotheel, glomerulaire kelder-membraan en podocytes. De delicate moleculaire structuur van de glomerulaire filter is zeer dynamisch en onderhevig is aan cel oppervlakte-proteïne handel in beide gezonde en zieke nieren2,3,4,5,6 . Endocytose van cel oppervlakte-eiwitten is gebleken te zijn essentieel voor de overlevin....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Muizen zijn verkregen als een in-house ras uit de lokale dierenverzorgers faciliteit of Janvier Labs in Frankrijk. De onderzoeken werden uitgevoerd volgens de richtsnoeren in de gids voor de verzorging en het gebruik van proefdieren (Amerikaanse nationale instituten van gezondheid publicatie nr. 85-23, herziene versie van 1996). Alle dierproeven werden uitgevoerd volgens de relevante institutionele goedkeuringen (deelstaatregering LANUV verwijst naar nummer AZ:84-02.04. 2016.A435).
1. bereiding van de apparatuur, instrumenten en oplossingen
- Bereiden 1 L fosfaatgebufferde zoutoplossing aangevuld met 1 mM magnesiumchloride (MgCl
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Om te isoleren glomeruli nauwkeurig, moet er eerst lymfkliertest nieren met PBSCM perfuse. Perfusie met PBSCM draait nieren bleke(Figuur 1). Embolisatie kan leiden van de glomeruli met magnetische kralen zijn zichtbaar als bruine puntjes op het oppervlak van de nier (Figuur 1B). Isolatie van de glomeruli met de magneet catcher kan besmetting met renale tubuli (Figuur 1
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
De onderhavige methode kan succesvolle Isolatievan glomeruli te onderzoeken glomerulaire RNA of eiwit. Daarnaast kunnen glomerulaire primaire celculturen worden uitgevoerd vanaf de geïsoleerde glomeruli. Als biotine wordt vereffend voor glomerulaire isolatie, kan etikettering van glomerulaire cel oppervlakte eiwitten worden uitgevoerd. Met deze methode in vivo glomerulaire cel oppervlakte-proteïne mensenhandel kan worden bestudeerd, en semi-kwantificatie van eiwit overvloed is mogelijk. De belangrijkste stappen .......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben niets te onthullen.
Dankbetuigingen
De auteurs bedanken Blanka Duvnjak voor haar uitzonderlijke technische bijstand. Dit werk werd gesteund door de Deutsche Forschungsgemeinschaft (www.dfg.de) WO1811/2-1 aan de M.W. en IQ QU280/3-1 De funder had geen rol in de studie ontwerp, gegevensverzameling, gegevensanalyse, besloten tot bekendmaking en voorbereiding van het manuscript.
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Motic SMZ168 BL | Motic | SMZ168BL | microscoop voor muizenchirurgie |
| KL1500LCD | Pulch en Lorenz microscopie | 150500 | licht voor muizenchirurgie |
| Rompun (Xylazin) 2% | Bayer | PZN:01320422 | anesthesie |
| Microfederschere | Braun, Aesculap | FD100R | fijne schaar, voor snede in de aorta |
| Durotip Feine Scheren | Braun, Aesculap | BC210R | voor buiksnede |
| Anatomische Pinzette | Braun, Aesculap | BD215R | voor chirurgie tot het openen van de buik |
| Präparierklemme | Aesculap | BJ008R | voor chirurgie |
| Seraflex | Serag Wiessner | IC108000 | zijdedraad |
| Ketamine 10% | Medistar | anesthesie | |
| Rompun (Xylazin) 2% | Bayer | anesthesie | |
| Fine Bore Polythene Tubing ID 0.28mm OD 0.61mm | Portex | 800/100/100 | Katheter |
| Fine Bore Polythene Tubing ID 0.58mm OD 0.96mm | Portex | 800/100/200 | Katheter |
| Harvard apparatus 11 Plus | Harvard Apparatus | 70-2209 | seringspomp |
| EZ-link Sulfo-NHC-LC-Biotin | Thermo Scientific | 21335 | biotine |
| Dynabeads Untouched Mouse T-cells | Invitrogen | 11413D | om glomeruli te emboliseren |
| Collagenase A | Roche | 10103578001 | om nierweefsel te verteren |
| DynaMag-2 | Invitrogen | 123.21D | Magnetische catcher |
| 100µm cel kleuring | Greiner-bio | 542000 | voor glomerulaire isolatie |
| Axiovert 40 CFL | Zeiss | niet beschikbaar | om glomerulaire zuiverheid te bevestigen |
| TissueRuptor | Quiagen | 9002755 | Weefselhomogenisator |
| CHAPS | Sigma-Aldrich | C3023 | voor lysisbuffer |
| Tris-HCL | Sigma-Aldrich | T5941 | voor lysisbuffer |
| NaCl | VWR chemicals | 27810295 | voor lysisbuffer |
| NaF | Sigma-Aldrich | 201154 | voor lysisbuffer |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E5134 | voor lysisbuffer |
| ATP | Sigma-Aldrich | 34369-07-8 | voor lysisbuffer |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo Scientific | 23225 | Volg de instructies van de fabrikant |
| nephrin antilichaam | Progen | GP-N2 | voor westernblot |
| Polyclonal goat anti-podocalyxin antilichaam | R&D Systems | AF15556-SP | voor westernblot |
| Streptavidin Agarose Resin | Thermo Scientific | 20347 | voor immunoprecipitatie |
| Protein A sepharose CL-4B | GE Healthcare | 17096303 | voor immunoprecipitatie |
| polyclonal rabbit anti-p57 antilichaam | SCBT | sc-8298 | voor Immunohistochemie |
| muis monoklonaal anti-beta actine antilichaam, clone AC-74 | Sigma-Aldrich | A2228 | Western blot ladingscontrole |
| rabbit anti-p44/42 | celsignalering | 4695 | voor westernblot |
| Pierce High sensitivity streptavidin-HRP | Thermo Scientific | 21130 | voor westernblot |
| polyclonal muis ICAM-2 antilichaam | R&D Systems | AF774 | voor westernblot |
| polyclonal muis anti-VE-cadherin | R&D Systems | AF1002 | voor westernblot |
Referenties
- Jefferson, J. A., Alpers, C. E., Shankland, S. J. Podocyte biology for the bedside. American Journal of Kidney Disease. 58 (5), 835-845 (2011).
- Konigshausen, E., et al. Angiotensin II increases glomerular permeability by beta-arrestin mediated nephrin en....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
