Methodenartikel

Visualisering en opvolging van endogene Mrna's in levende Drosophila melanogaster Eier kamers

DOI:

10.3791/58545

⸱

4 juni 2019

 ,  ,  , 
1Biological Sciences Department Hunter College, City University of New York, 2Program in Molecular, Cellular, and Developmental Biology, Graduate Center, City University of New York

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hier presenteren we een protocol voor de visualisatie, detectie, analyse en tracking van endogene mRNA-handel in levende Drosophila melanogaster Eier kamer met behulp van moleculaire bakens, draaiende schijf confocale microscopie en open-source analyse Software.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Fluorescentie-gebaseerde beeldvormingstechnieken, in combinatie met ontwikkelingen in lichte microscopie, hebben een revolutie teweeggebracht in de manier waarop celbiologen Live-celbeeldvormings onderzoeken uitvoeren. De methoden voor het opsporen van Rna's zijn sterk toegenomen sinds de seminale studies de locatiespecifieke mRNA-lokalisatie hebben gekoppeld aan de genexpressie verordening. Dynamische mRNA-processen kunnen nu worden gevisualiseerd via benaderingen die Mrna's detecteren, in combinatie met microscopie-opstellingen die snel genoeg zijn om het dynamische bereik van moleculair gedrag vast te leggen. De moleculaire baken technologie is een hybridisatie gebaseerde benadering die in staat is om de endogene transcripten in levende cellen direct te detecteren. Moleculaire bakens zijn haarspeld vormige, intern quenched, single-nucleotide discriminerende nucleïnezuur sondes, die alleen fluoresceren bij hybridisatie tot een unieke doel sequentie. In combinatie met geavanceerde fluorescentiemicroscopie en hoge resolutie beeldvorming, kunnen ze een ruimtelijke en temporele tracking van intracellulaire beweging van Mrna's uitvoeren. Hoewel deze technologie de enige methode is die in staat is om endogene transcripten te detecteren, hebben celbiologen deze technologie nog niet volledig omarmd vanwege moeilijkheden bij het ontwerpen van dergelijke sondes voor Live-celbeeldvorming. Een nieuwe softwaretoepassing, Pinmol, zorgt voor een verbeterd en snel ontwerp van sondes die het meest geschikt zijn om efficiënt te hybridiseren naar mRNA-doelgebieden binnen een levende cel. Bovendien, hoge resolutie, real-time beeld verwerving en huidige, open source beeldanalyse software zorgen voor een verfijnde data-output, wat leidt tot een fijnere evaluatie van de complexiteit van de dynamische processen die betrokken zijn bij de levenscyclus van de mRNA.

Hier presenteren we een uitgebreid protocol voor het ontwerpen en leveren van moleculaire bakens in Drosophila melanogaster Eier kamers. Directe en zeer specifieke detectie en visualisatie van endogene maternale Mrna's wordt uitgevoerd via draaiende schijf confocale microscopie. Imaging gegevens worden verwerkt en geanalyseerd met behulp van objectdetectie en tracking in Icy software om informatie te verkrijgen over de dynamische verplaatsing van Mrna's, die worden vervoerd en gelokaliseerd in gespecialiseerde gebieden binnen de eicel.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Celbiologie studies die dynamische gebeurtenissen visualiseren met ruimtelijke en temporele resolutie zijn mogelijk gemaakt door de ontwikkeling van fluorescentie-gebaseerde Live Cell Imaging technieken. Momenteel wordt in vivo mRNA-visualisatie verkregen via technologieën die zijn gebaseerd op RNA aptamer-eiwit interacties, RNA aptamer-geïnduceerde fluorescentie van organische kleurstoffen en nucleïnezuur sondegloeien1,2, 3. ze bieden allemaal een hoge specificiteit, gevoeligheid en signaal-naar-achtergrond ratio. RNA aptamer-gecentreerde benaderingen vereisen echter uitgebreide genetische manipulatie, waarbij een transgen is ontworpen om een RNA uit te drukken met kunstmatige structurele motieven die nodig zijn voor eiwitten of organische kleurstof binding. Het MS2/MCP-systeem vereist bijvoorbeeld de co-expressie van een transgen dat een RNA-constructie met meerdere tandem herhalingen van de bindings sequentie voor de bacteriofaag ms2 Coat protein (MCP) en een ander transgen codeert met een fluorescerende proteïne gesmolten tot MCP4,5. De toevoeging van dergelijke secundaire structurele motieven aan het RNA, samen met een volumineus fluorescendig gelabeld eiwit, heeft bezorgdheid geuit dat inheemse RNA-processen kunnen worden beïnvloed6. Een technologie die deze bezorgdheid behandelt en extra unieke voordelen biedt, is de op nucleïnezuur gebaseerde benadering, moleculaire bakens (MBs). MBS zorgen voor de multiplex detectie van endogene mrna's, discriminatie van enkelvoudige nucleotide variaties, en snelle kinetiek van hybridisatie met target mRNA7,8. MBs zijn oligonucleotide-sondes die in een afgestelde haarspeld plooi achterblijven voordat ze een fluorogene conformationele verandering ondergaan zodra ze hun doelen hybridiseren (figuur 1c)9. Verschillende groepen hebben succes gehad met het gebruik van MBS om zowel niet-Codeer rna's (microRNAs en lncrnas) te detecteren10,11,12,13, RNA retrovirussen14 en dynamische DNA-eiwitten interacties15. Ze zijn met succes gebruikt voorbeeld vorming in verschillende organismen en weefsels, zoals zebravis embryo's16, neuronen13, tumorweefsel17, differentiërende cardio myocytes18, en salmonella 19.

Hier beschrijven we de ontwerp-, leverings-en detectie benadering voor endogene Mrna's in Living D. melanogaster Eier kamers in combinatie met een microscopie set-up die snel genoeg is om het dynamische bereik van actief moleculair transport vast te leggen. De D. melanogaster Eier kamer heeft gediend als een ideaal multicellulair modelsysteem voor een breed scala aan ontwikkelingsstudies, van vroege kiembaan stamcel deling en maternale genexpressie tot de generatie van het segmentale Body plan20, 21. Eier kamers zijn gemakkelijk geïsoleerd, groot en doorschijnend en kunnen uren van ex- vivo -analyse weerstaan, waardoor ze zeer vatbaar zijn voor Imaging-experimenten. Veel werk heeft zich geconcentreerd op de asymmetrische lokalisatie van moederlijke transcripten aan discrete subcellulaire regio's voordat ze actief werden vertaald. In het bijzonder moet de lokalisatie van Oskar mRNA en de daaropvolgende vertaling ervan op de achterste pool van de eicel op een strak geregelde wijze plaatsvinden om een dodelijk bicaudale embryo-fenotype22te vermijden. Oskar mRNA wordt getranscribeerd in de 15 kiembaan cellen, verpleegkundige cellen genoemd, en actief getransporteerd door cytoplasmische bruggen, zogenaamde ring grachten, in de eicel, de germlijncel die het volwassen ei wordt en is uiteindelijk bevruchte (Figuur 1a ). De aanzienlijke hoeveelheid informatie die al beschikbaar is met betrekking tot de dynamische werving en uitwisseling van eiwit factoren van en naar Oskar mrnp, samen met zijn lange-afstand intracellulaire reizen, maken van Oskar een voorkeurs kandidaat om te studeren de vele processen van de mRNA-levenscyclus. MBs zijn instrumentaal in het onthullen van Details over het proces van mRNA lokalisatie en het ontcijferen van de verordening en functie van eiwit factoren die controle mRNA transport tijdens Drosophila oogenesis. In het bijzonder, door het microinjecteren van MBS in verpleeg cellen en het uitvoeren van Live Cell Imaging experimenten, is het volgen van endogene mrna's mogelijk8,23.

De roadmap die hier wordt gepresenteerd, biedt de stappen van een compleet proces, van het uitvoeren van een live-celbeeldvormings experiment met MBs, het verkrijgen van Imaging gegevens tot het uitvoeren van data-analyse om endogene mRNA in zijn native cellulaire omgeving te volgen. De stappen kunnen worden aangepast en verder geoptimaliseerd om te voldoen aan de behoeften van onderzoekers die werken met andere weefsels/celtypen binnen hun eigen lab-instelling.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. ontwerp van MBs voor Live-Celbeeldvorming

  1. Vouw de doel-RNA-sequentie om de secundaire structuur van het mRNA-doelwit te voorspellen met behulp van de "RNA-vorm" van de mfold -server (http://unafold.RNA.Albany.edu/?q=mfold/RNA-Folding-Form).
    1. Plak/upload de doel volgorde in het fasta-formaat, selecteer 5 of 10% sub-optimaliteit (structuren met een vrije energie van vouwen binnen 5 of 10% van de MFE-waarde, respectievelijk) en pas het maximum aantal berekende vouwen dienovereenkomstig aan (bijv. groter voor 10% sub-optimaliteit).
      Opmerking: de opname van suboptimale secundaire structuren bij het ontwerpen van MBs maakt het mogelijk om regio's binnen het beoogde mRNA te identificeren die flexibeler of stijver kunnen zijn dan zoals voorspeld voor de minimale vrije energie (MFE)-structuur alleen, wat de algemeen ontwerp van MBs geschikt voor Live-celbeeldvorming.
    2. Selecteer een "onmiddellijke taak" voor mRNA-doelen van 800 nucleotiden (NT), of een "batchtaak" voor mRNA lengtes tussen 801 en 8.000 NT. Sla het "SS-Count" bestand op als eenvoudig tekstbestand.
  2. Gebruik de "SS-Count" bestand verkregen in stap 1,1 als input voor de pinmol programma (https://bratulab.WordPress.com/software/) met de gewenste parameters, voor het ontwerpen van verschillende MBS voor de mRNA target (Zie tutorials beschrijven gebruik van pinmol programma 24 op https://bratulab.WordPress.com/tutorial-pinmol-Mac/).
    1. Bepaal de specificiteit van geselecteerde Mb's door BLAST-analyse uit te voeren: gebruik "blastn" met de juiste database (bijv. voor Oskar mRNA-specifieke mb's gebruiken de "refseq-RNA" database en het Drosophila melanogaster organisme).
    2. Identificeer een Weefselspecifieke uitdrukking van het mRNA-doel (bijv. voor Oskar mRNA flybase ≫ expressie gegevens met hoge doorvoer ≫ Flyatlas Anatomy Microarray of MODENCODE Anatomy RNA-Seq; http://flybase.org/reports/FBgn0003015) en vergelijk met elke positieve BLAST hits. Elimineer sondes die > 50% cross-homologie met andere Mrna's tonen die ook worden uitgedrukt in het weefsel/de cel van belang.
  3. Selecteer de combinatie van de en dorstlesser die geschikt is voor het instellen van de microscopie die beschikbaar is voor het uitvoeren van Live-celbeeldvorming (bijv. Cy5/BHQ2)25.

2. MB synthese, zuivering, en karakterisering

  1. Gebruik in-House synthese en zuivering zoals eerder beschreven7, of diensten van commerciële aanbieders, voor het synthetiseren en zuiveren van één tot vijf MBS (zie bovenstaande noot), met behulp van de volgende etiketterings schema: [5 ' (Fluorophore)-(C3 of C6 linker)-(2 '-O -METHYL MB sequentie)-(quencher) 3 ']. Purify MBs met behulp van omgekeerde fase HPLC, in huis of gebruik van de diensten van de commerciële aanbieder.
    Opmerking: De fosforamidites die voor geautomatiseerde sonde synthese worden gebruikt, moeten de 2 '-O-methyl-ribonucleotide-modificatie hebben. Men kan ook chimeras van afwisselend vergrendeld-nucleïnezuur (LNA) en 2 '-O-methyl-modificaties gebruiken om de stabiliteit van een hybride tussen een kortere MB en het beoogde mRNA26te verhogen.
  2. Synthetiseren van DNA-oligonucleotiden die overeenkomen met de volgorde van de beoogde RNA-regio en dus complementair zijn aan de sonde regio van MBs, voor gebruik in in vitro karakterisatie (zie stappen 2,3 tot 2,5; bovenstaande noot). Maximaliseer hybridisatie van de MB met het DNA-oligonucleotide doelwit nabootsen, door het opnemen van elk uiteinde van het DNA doelwit vier extra nucleotiden, zoals gevonden in de target mRNA sequentie.
    Opmerking: een striktere karakterisering van de MB-efficiëntie om de beoogde sequentie te detecteren kan worden uitgevoerd met behulp van in vitro gesynthetiseerde RNA-doelen in plaats van complementaire DNA-oligonucleotiden8.
  3. Voer thermische denaturatie van de MB alleen uit, meet de smelttemperatuur (TM) en bevestig dat de MB de gewenste haarspeld vorm op fysiologische temperatuur aanneemt. We hebben TM waarden waargenomen tussen 60 en 90 °C.
  4. Voer thermische denaturatie van de MB uit in aanwezigheid van het DNA-oligonucleotide-doel en meet de MB: DNA target Hybrid TM, zoals eerder beschreven7. Een TM tussen 55 en 60 °C is gewenst voor de MB: DNA Hybrid.
  5. Voer in vitro hybridisatie reacties uit met het corresponderende DNA oligonucleotide doelwit en bepaal de efficiëntie van MB: DNA hybride vorming op fysiologische temperatuur, zoals eerder beschreven7. Snelle hybridisatie kinetiek met de DNA-doel nabootsen is gewenst, maar MBs die geen hoge hybridisatie efficiëntie met DNA-doelen vertonen, kunnen een betere prestatie hebben met het doelwit mRNA in vitro en/of in vivo.

3. dissectie en bereiding van individuele Eier kamers voor micro injectie

  1. Voer nieuw uitgekomen, gedekt vrouwtjes voor 2-3 dagen met verse gist pasta.
  2. Anesthetize vliegt op een CO2 -pad en, met behulp van fijne pincet (Dumont #5), Transfer 1-2 vrouwtjes in een druppel Halo carbon olie 700 op een glazen afdekplaat.
  3. Met behulp van een paar pincet, oriënteer de vlieg met de rugzijde onder een stereomicroscoop. Ontleden de vrouwelijke buik door een kleine incisie aan het achterste uiteinde te maken en zachtjes het paar eierstokken in de olie te persen.
  4. De eierstokken uitplanten op een olie druppel op een nieuwe dekslip. Houd één eierstok met één pincet vast terwijl u de jongste stadia van de ovariole met de andere pincet afknijk. Oskar mRNA is actief gelokaliseerd op en na mid-oogenesis (stadia > 7), en jongere Eier kamers (stadia < 7) zijn moeilijker te injecteren en overleven niet zo lang. Sleep langzaam op de Afdekstrook (met een neerwaartse beweging) totdat afzonderlijke ovariolen of Eier kamers zijn geïsoleerd en verticaal zijn uitgelijnd. Andere afzonderlijke Eier kamers door de ongewenste stadia van de Eier ketting ovariole te verplaatsen.
    Opmerking: Zorg ervoor dat individueel gekaarde Eier kamers niet in de olie drijven en dat ze zich aan de Afdekstrook houden. Dit is belangrijk voor zowel succesvolle micro Injection als Image Acquisition.

4. micro injectie van MBs in de verpleeg cellen van de Eier kamers

  1. Bereid de MB-oplossing met behulp van één moleculair baken (bijv. osk2216Cy5) of een mix van twee Mb's die gericht zijn op verschillende Mrna's en die zijn gelabeld met spectraaal verschillende fluor Foren (bijvoorbeeld osk2216Cy5 en drongo1111Cy3). Gebruik een concentratie van 200-300 ng/μL per MB in HybBuffer (50 mM tris-HCl-pH 7,5, 1,5 mM MgCl2 en 100 mm NaCl). Voor een cocktail van vier mb's gelabeld met dezelfde de die gericht zijn op dezelfde mRNA op 200 ng/μL elk in hybbuffer (bijvoorbeeld osk82, osk1236, osk2216). Draai de MB-oplossing direct vóór het laden van de naald voor micro injectie.
  2. Selecteer de doelstelling. Een 40x-olie doelstelling wordt aanbevolen voor het vinden van een geschikte Eier kamer en voor het uitvoeren van micro injectie.
  3. Monteer de dekslip met ontleed Eier kamer op de Microscoop. Breng het doel in de focus positie en Identificeer een Eier kamer in een mid-to-late ontwikkelingsfase, die goed is georiënteerd voor micro injectie (d.w.z., met de AàP-as loodrecht op de naaldpunt om gemakkelijke injectie binnen een verpleegkundige mogelijk te maken cel proximale tot de eicel).
  4. Plaats een naald (commercieel of voorbereid in huis27) met ~ 1 μL MB oplossing (Zie stap 4,1) en sluit deze aan op de micro injector. Voor micro injecties in D. melanogaster Eier kamers, oriënteer de naald (Zie tabel van de materialen) onder een hoek < 45 ° tot de Microscoop fase (bv. 30 °) om te voorkomen dat verschillende verpleeg cellen worden geprikt.
  5. Stel de injector in met een injectiedruk van 500-1000 hPa en een compensatie druk van 100-250 hPa (Zie tabel met materialen).
  6. Verplaats het podium langzaam om een gebied van de olie druppel leegte van de Eier kamers op het gezichtsveld te brengen.
  7. Gebruik de micromanipulator-joystick om de naald zachtjes in de olie druppel te laten vallen en de punt in de richting van de omtrek van het gezichtsveld te brengen.
  8. Voer een ' clean ' functie uit om de lucht van de punt van de naald te verwijderen en om ervoor te zorgen dat er stroom van de naald is.
  9. Breng de naald naar de thuispositie en concentreer u op de Eier kamer om microgeïnjecteerd te worden, breng de naald dan weer in de focus en plaats deze in de buurt van de rand van de Eier kamer.
  10. Voer een fijnafstelling uit van de Z-positie van de doelstelling, zodat het membraan dat de follikel cellen van verpleeg cellen scheidt, scherp is.
  11. Steek de naald in een verpleeg cel en voer een injectie uit voor 2-5 s.
  12. Verwijder voorzichtig de naald en trek deze in de startpositie.
  13. Verander de doelstelling naar de gewenste vergroting voorbeeld verwerving (60-63x of 100x), focus op de Eier kamer en begin met acquisitie.

5. acquisitie van gegevens met behulp van een draaiende schijf confocale Microscoop Setup

Opmerking: Zie de tabel met materialen voor onze specifieke instellingen.

  1. Het acquisitie protocol instellen om een XYZCt-stapel van 8-16-bits afbeeldingen op te nemen (XYZ = volume, C = Channel, t = time).
  2. Selecteer laserlijnen voor de gewenste kanalen (bijv. 641 nm laser voor Cy5 en 491 nm voor GFP) en verkrijg de kanalen opeenvolgend: eerst het fluorescentie signaal in elk kanaal en verander vervolgens de Z-positie, om een goede colokalisatie analyse mogelijk te maken.
  3. Selecteer de Z-stap (bijvoorbeeld 0,3 μm) en de boven-en onderz-grenswaarden (bijv. -2 μm tot 2 μm).
  4. Voer de aanschaf tijd en de bemonsteringsfrequentie in (bijvoorbeeld elke 15-30 s voor maximaal 1 uur).
  5. Overname starten.

6. verwerking, gegevensanalyse om tracking-en Colokalisatie-informatie te verkrijgen en voorbereiding van video bestanden

  1. Beeldverwerking
    1. Download, pak en open Icy, een open community platform voor bioimage informatica (http://Icy.bioimageanalysis.org/)
    2. Open de XYZCt stack verworven in stap 5: Image/sequence > bestand > geopend.
    3. Converteer stack naar ImageJ: ImageJ > tools > converteren naar IJ, hebben de modus vrijstaand ingeschakeld.
    4. Maak een substack (een selectie van een reeks Z-stappen en tijdpunten die verder moet worden geanalyseerd): ImageJ > Image > Stacks > tools > Substack maken...; Selecteer de gewenste kanalen, Z-stappen en tijdpunten.
    5. Substack opslaan als TIFF-bestand: ImageJ >-bestand > opslaan als > TIFF...; Gebruik dit bestand voor de volgende stappen.
    6. Gesplitste kanalen: ImageJ > Afbeelding > Kleur > gesplitste kanalen.
    7. Achtergrond aftrekken met behulp van een achtergrond stack: ImageJ > process > Image Calculator..., of met de optie rolling ball: ImageJ > proces > achtergrond aftrekken..., selecteer de Rolling Ball RADIUS. Bekijk de afbeelding voor de geselecteerde straal voordat u ' accepteren ' selecteert.
      Opmerking: achtergrond signaal zal voornamelijk voortvloeien uit het onjuist blusen van de flurorophore. De signaal: achtergrond ratio (S:B) wordt vaak gebruikt als indicator voor de "helderheid" van een MB, en wordt gemeten uit in vitro hybridisatie experimenten van de MB en DNA doel oligonucleotide. Bijvoorbeeld, MBs osk1236 en osk2216 hebben een S:B van ~ 81 en ~ 120, respectievelijk.
    8. De helderheid en het contrast voor elk kanaal aanpassen: ImageJ > Afbeelding > > Helderheid/contrast aanpassen, selecteer toepassen.
    9. Sla elk kanaal op als een afzonderlijk TIFF-bestand: ImageJ >-bestand > opslaan als > TIFF....
    10. Voeg de twee kanalen samen: ImageJ > Afbeelding > Kleur > kanalen samenvoegen...; Selecteer de kanalen. Sla de nieuwe stapel op als een nieuw TIFF-bestand (Zie stap 6.1.8).
  2. Detectie en tracering van vlekken
    1. Converteer terug naar Icy: ImageJ > tools > omzetten naar Icy.
    2. Een schaalbalk wordt automatisch op de stapel geplaatst bij conversie naar Icy, als de plug-in schaalbalk is geïnstalleerd [zoeken met plug-ins > Setup > Online plugin]. Bewerk indien nodig de schaalbalk via het Inspector-venster (rechterkant van het scherm) > laag tabblad > naam > schaalbalk.
    3. Schakel het pictogram ' oog ' voor schaalbalk van het tabblad laag uit > naam om de schaalbalk uit de oorspronkelijke stapel te verwijderen. Het kan opnieuw worden geactiveerd op de laatste stapel.
    4. Sla de nieuwe verwerkte stapel op door een screenshot te maken met het pictogram "camera" in de menubalk van het afbeeldingsvenster, "Maak een screenshot van de huidige weergave" en sla het bestand > op als > TIFF....
    5. Bepaal de gevoeligheid van de spot, als de parameters voor de spot gevoeligheid al zijn vastgesteld Ga naar stap 6.2.7.
    6. Vlekken detecteren: Selecteer het venster met de te analyseren afbeelding of stapel, detectie & Tracking > detectie > Spot detector en vul de instellingsparameters in:
      1. Voor invoer, selecteer "currentSequenceInputDetection" (standaard).
      2. Voor pre-processing selecteert u ' kanaal 0 ' (standaard) of gewenst kanaal doorkruis verwijzing naar het nummer in het Inspector-venster > tabblad reeks.
      3. Voor detector, selecteer "Detecteer Bright spot on dark background;" gebruik "Forceer gebruik van 2D-wavelets voor 3D" alleen als er niet genoeg Z-slices in de stapels zijn om de analyse uit te voeren. Selecteer "scale (s)" en "sensitivity" voor elke schaal (Voeg meer weegschalen toe voor grotere vlekken). De schaal en gevoeligheid (hoe groter het getal de meer gevoelige is de detectie, een maximum van 140 wordt gesuggereerd door Icy) zijn trial and error variabelen, dat moet achteraf visueel worden gecontroleerd en besloten op.
      4. Voor regio van belang, gebruik "ROIfromSequence" (standaard).
      5. Voor het filteren gebruikt u ' NoFiltering ' (standaard) of selecteert u ' SizeFiltering ' om het ' bereik van geaccepteerde objecten (in pixels) ' te definiëren.
      6. Uitvoer: Selecteer XLS-of XML-uitvoerinstelling (Selecteer XML-indeling bij gebruik van 2007 MS Excel of eerder en er zijn > 65.000 plaatsen). Als de spot detector resultaten worden gebruikt voor de tracking-analyse, ook selecteren "exporteren naar zwembad".
      7. Herhaalde detectie van vlekken met behulp van verschillende schaal/gevoeligheids waarden totdat alle of de meeste van de vlekken zijn gedetecteerd. Noteer alle laatste parameters.
      8. Voor colokalisatie analyse, herhalings detectie voor het andere kanaal.
    7. Als u vlekken wilt bijhouden, selecteert u detectie & Tracking > Tracking > Spot Tracking > de spot detector uitvoeren met parameters uit stap 6.2.6., of gebruik "Selecteer detectieresultaten hier" pull-down menu om een bestaande gegevensset te selecteren (voor dit, keep spot detector venster Open vanaf stap 6.2.5). Druk op de knop "Ramings parameters" en selecteer de gewenste doel beweging in het pop-upvenster parameters raming (bijvoorbeeld "is zowel diffusief als gericht"). Druk op de knop "run tracking".
    8. Herhaal detectie en tracering voor andere kanalen bij het volgen van vlekken van meerkanaalsstapels, volgende stappen 6.2.6 en 6.2.7, te beginnen met de stack die is gegenereerd op basis van stap 6.2.7.
    9. Als u tracks wilt visualiseren, selecteert u detectie & Tracking > Tracking > track manager – dit venster wordt automatisch geopend na voltooiing van een tracking-run. Voor "Color track processor" selecteert u "Enable" en kiest u de gewenste kleurweergave voor de tracks. Relevante track processors zijn toegankelijk via de "track processor toevoegen..." pull-down menu (Selecteer bijvoorbeeld "track processor time clip", schakel het venster "track Clipper" in en kies het gewenste aantal detecties dat moet worden weergegeven voor en na het huidige tijdpunt.)
    10. Informatie over tracks opslaan als een XML-trackbestand: detectie & Tracking > Tracking > track Manager > bestand > opslaan als....
    11. Sla resultaten op door een screenshot te maken met het pictogram "camera" in de menubalk van het afbeeldingsvenster, "Maak een screenshot van de huidige weergave". Screenshots kunnen worden genomen met de gedetecteerde vlekken en/of de tracks gewoon door het activeren/deactiveren van de bijbehorende Eye icon (s) gevonden in Inspector venster > laag tabblad > naam > overlay wrapper.
    12. Installeer de TimeStamp overlay plugin: plugins > Setup > Online plugin > TimeStamp overlay > installeren.
    13. Tijdstempel toevoegen: plugins > TimeStamp overlay (nieuw). Volg de instructies in het pop-upvenster (rechtsonder in het scherm) voor aanwijzingen over het plaatsen en opmaken van de tijdstempel. Het tijdsinterval kan worden toegevoegd/gewijzigd in het Inspector-venster > sequence-tabblad > sequence-eigenschappen > bewerken.
    14. Sla resultaten op door een ander screenshot te maken. Afbeelding opslaan als 1) TIFF-formaat, en 2) als AVI-formaat; voor AVI-indeling eerst converteren naar RGB-rendering (afbeelding/volgorde > Rendering > RGB-afbeelding).
    15. Afbeelding roteren naar gewenste oriëntatie: Inspector-venster > sequence-tabblad > Canvas > rotatie.
    16. Sla de geroteerde afbeelding op door "Maak een screenshot van de huidige weergave". Zorg ervoor dat het pictogram "oog" voor de schaalbalk is uitgeschakeld, omdat het ook met de afbeelding zal draaien.
    17. ROI kiezen en bijsnijden: Selecteer interessegebied > 2D-ROI > Kies ROI-vorm en vervolgens ROI maken/tekenen op de afbeelding; Afbeelding/sequentie > vlak (XY) > snel bijsnijden.
  3. Colokalisatie-analyse
    1. Een colokalisatie-protocol voorbereiden; verschillende voorbeelden zijn beschikbaar op de Icy website (http://icy.bioimageanalysis.org/protocol/List) (Zie aanvullende materialen).
    2. Colokalisatie protocol laden: Hulpprogramma's > Scripting > protocollen > laden, en parameters in de interactie blokken aanpassen (bijvoorbeeld in de "wavelet detectie" blok gebruik parameters bepaald in stap 6.2.6.).
    3. Meet de grootte van een deeltje in pixels, bepaal de afstand van de colokalisatie en voer het in "Colocalizer"-blok als "maximale afstand".
      Opmerking: De grootte van het deeltje in pixels is afhankelijk van het detectiesysteem. Als u de grootte wilt meten, zoomt u in op één deeltje en telt u handmatig de pixels die de breedte van het signaal beslaan. Gemiddelde van de metingen van ten minste drie deeltjes. De maximale afstand die moet worden ingesteld voor colokalisatie is de grootte van het deeltje in pixels (dit staat voor de maximale som van de straal van twee deeltjes die aanraken).
    4. Indien gewenst, selecteert u een of meer ROIs voor colokalisatie analyse: regio van belang > 2D ROI > Kies ROI vorm > ROI op afbeelding tekenen.
    5. Opbrengst ROI (s): afbeelding/volgorde > vlak (XY) > snel uitsnijden.
    6. Uitvoeren colokalisatie: protocollen editor venster > gekozen protocol tabblad > uitvoeren. Het laatste blok in het venster van de protocollen-editor bevat het algehele colokalisatie percentage op basis van spot detectie, terwijl de informatie op elk tijdstip kan worden gevonden in het Inspector-venster > tabblad uitvoer.
    7. Spoor cogelokaliseerde en enkelvoudige deeltjes op door stap 6.2.7 (track spots) te volgen.
    8. Opslaan zoals beschreven in stap 6.2.16.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Met behulp van Pinmolkunnen verschillende MBS worden ontworpen voor één mRNA-doel (Figuur 1b-C). Na synthese en zuivering, de geselecteerde MBs worden gekenmerkt en vergeleken met behulp van in vitro analyse.

figure-results-1
Figuur 1: techniek en weefsel beschrijving voor Live-celbeeldvorming van en...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Live visualisatie van endogene mRNA-handel in Drosophila Egg Chambers vertrouwt op het gebruik van specifieke, efficiënte en Nuclease-resistente MBS, die nu gemakkelijk met pinmol -software kunnen worden ontworpen. MBs zijn specifieke probes ontworpen voor het detecteren van unieke sequenties binnen een doel mRNA (bij voorkeur regio's vrij van secundaire structuur), waardoor een zeer opgeloste detectie van een transcript. De enige beperking bij het aannemen van deze techniek/protocol voor andere weefsel...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben geen belangenconflict te onthullen.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

We danken Salvatore A.E. Marras (Public Health Research Institute Center, Rutgers University) voor de synthese, etikettering en zuivering van moleculaire bakens, en Daniel St Johnston (het Gurdon Institute, University of Cambridge) voor de Oskar-ms2/ MCP-GFP transgene Fly Stock. Dit werk werd gesteund door een National Science Foundation CAREER Award 1149738 en een professionele staff Congress-CUNY Award voor DPB.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
SpectrofluorometerFluoromax-4 Horiba-Jobin Yvonn/aPhoton counting spectrofluorometer
Quartz cuvetFireflysci (former Precision Cells Inc.)701MFL
Dumont #5 pincetWorld Precision Instruments501985Dunne pincetten zijn erg belangrijk om de individuele eicellen te scheiden
Halocarbon olie 700Sigma-AldrichH8898
Dekglas Nr.1 22 mm x 40 mmVWR48393-048
DissectiemicroscoopLeica MZ6 Leica Microsystems Inc.n/a
CO2 vruchtenvlieg anesthesie padGenesee Scienific59-114
Tris-HCL pH 7.5Sigma-Aldrich1185-53-1
MagnesiumchlorideSigma-Aldrich7791-18-6
NaClSigma-Aldrich7647-14-5
Spinning disc confocale microscoopLeica DMI-4000B omgekeerde microscoop uitgerust met Yokogawa CSU 10 spinning disc Leica Microsystems Inc.n/a
Hamamatsu C9100-13 ImagEM EMCCD cameraHamamatsun/a
PatchMan NP 2 MicromanipulatorEppendorf Inc.920000037
FemtoJet MicroinjectorEppendorf Inc.920010504
Injectienaald: Femtotips IIEppendorf Inc.930000043
Laadtip: 20 μL MicroloaderEppendorf Inc.930001007
Micro Dekglazen nr. 1 of 1.5, 22 mm x 40 mmVWR48393-026; 48393-172
Droge gistElke supermarktn/a
Computer, > 20 GB RAMHoewel verwerking op de meeste computers kan worden uitgevoerd, zullen hogere mogelijkheden de snelheid van de verwerking verhogen

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Tyagi, S. Imaging intracellular RNA distribution and dynamics in living cells. Nature Methods. 6 (5), 331-338 (2009).
  2. Bao, G., Rhee, W. J., Tsourkas, A. Fluorescent probes for live-cell RNA detection. Annual Reviews of Biomedical Engineering. 11, 25-47 (2009).
  3. Mannack, L. V., Eising, S., Rentmeister, A. Current techniques for visualizing RNA in cells. F1000Research. 5, (2016).
  4. Larson, D. R., Zenklusen, D., Wu, B., Chao, J. A., Singer, R. H. Real-time observation of transcription initiation and elongation on an endogenous yeast gene. Science. 332 (6028), 475-478 (2011).
  5. Bertrand, E., et al. Localization of ASH1 mRNA particles in living yeast. Molecular Cell. 2 (4), 437-445 (1998).
  6. Garcia, J. F., Parker, R. MS2 coat proteins bound to yeast mRNAs block 5' to 3' degradation and trap mRNA decay products: implications for the localization of mRNAs by MS2-MCP system. RNA. 21 (8), 1393-1395 (2015).
  7. Bratu, D. P. Molecular beacons: Fluorescent probes for detection of endogenous mRNAs in living cells. Methods in Molecular Biology. 319, 1-14 (2006).
  8. Bratu, D. P., Cha, B. J., Mhlanga, M. M., Kramer, F. R., Tyagi, S. Visualizing the distribution and transport of mRNAs in living cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the Unites States of America. 100 (23), 13308-13313 (2003).
  9. Tyagi, S., Kramer, F. R. Molecular beacons: probes that fluoresce upon hybridization. Nature Biotechnology. 14 (3), 303-308 (1996).
  10. Chen, M., et al. A molecular beacon-based approach for live-cell imaging of RNA transcripts with minimal target engineering at the single-molecule level. Scientific Reports. 7 (1), 1550(2017).
  11. Liu, Y., et al. Multiplex detection of microRNAs by combining molecular beacon probes with T7 exonuclease-assisted cyclic amplification reaction. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 409 (1), 107-114 (2017).
  12. Baker, M. B., Bao, G., Searles, C. D. In vitro quantification of specific microRNA using molecular beacons. Nucleic Acids Research. 40 (2), e13(2012).
  13. Ko, H. Y., et al. A color-tunable molecular beacon to sense miRNA-9 expression during neurogenesis. Scientific Reports. 4, 4626(2014).
  14. Vet, J. A., et al. Multiplex detection of four pathogenic retroviruses using molecular beacons. Proceedings of the National Academy of Sciences of the Unites States of America. 96 (11), 6394-6399 (1999).
  15. Li, J., Cao, Z. C., Tang, Z., Wang, K., Tan, W. Molecular beacons for protein-DNA interaction studies. Methods in Molecular Biology. 429, 209-224 (2008).
  16. Li, W. M., Chan, C. M., Miller, A. L., Lee, C. H. Dual Functional Roles of Molecular Beacon as a MicroRNA Detector and Inhibitor. Journal of Biological Chemistry. 292 (9), 3568-3580 (2017).
  17. Kuang, T., Chang, L., Peng, X., Hu, X., Gallego-Perez, D. Molecular Beacon Nano-Sensors for Probing Living Cancer Cells. Trends in Biotechnology. 35 (4), 347-359 (2017).
  18. Ban, K., et al. Non-genetic Purification of Ventricular Cardiomyocytes from Differentiating Embryonic Stem Cells through Molecular Beacons Targeting IRX-4. Stem Cell Reports. 5 (6), 1239-1249 (2015).
  19. Hadjinicolaou, A. V., Demetriou, V. L., Emmanuel, M. A., Kakoyiannis, C. K., Kostrikis, L. G. Molecular beacon-based real-time PCR detection of primary isolates of Salmonella Typhimurium and Salmonella Enteritidis in environmental and clinical samples. BMC Microbiology. 9, 97(2009).
  20. McLaughlin, J. M., Bratu, D. P. Drosophila melanogaster Oogenesis: An Overview. Methods in Molecular Biology. 1328, 1-20 (2015).
  21. Bastock, R., St Johnston, D. Drosophila oogenesis. Current Biology. 18 (23), R1082-R1087 (2008).
  22. Rongo, C., Gavis, E. R., Lehmann, R. Localization of oskar RNA regulates oskar translation and requires Oskar protein. Development. 121 (9), 2737-2746 (1995).
  23. Mhlanga, M. M., et al. In vivo colocalisation of oskar mRNA and trans-acting proteins revealed by quantitative imaging of the Drosophila oocyte. PLoS One. 4 (7), e6241(2009).
  24. Bayer, L. V., Omar, O. S., Bratu, D. P., Catrina, I. E. PinMol: Python application for designing molecular beacons for live cell imaging of endogenous mRNAs. bioRxiv. , (2018).
  25. Marras, S. A., Kramer, F. R., Tyagi, S. Efficiencies of fluorescence resonance energy transfer and contact-mediated quenching in oligonucleotide probes. Nucleic Acids Research. 30 (21), e122(2002).
  26. Bratu, D. P., Catrina, I. E., Marras, S. A. Tiny molecular beacons for in vivo mRNA detection. Methods in Molecular Biology. 714, 141-157 (2011).
  27. Dean, D. A. Preparation (pulling) of needles for gene delivery by microinjection. Cold Spring Harbor. 2006 (7), (2006).
  28. Alami, N. H., et al. Axonal transport of TDP-43 mRNA granules is impaired by ALS-causing mutations. Neuron. 81 (3), 536-543 (2014).
  29. Jackson, S. R., et al. Applications of Hairpin DNA-Functionalized Gold Nanoparticles for Imaging mRNA in Living Cells. Methods in Enzymology. 572, 87-103 (2016).
  30. Zimyanin, V. L., et al. In vivo imaging of oskar mRNA transport reveals the mechanism of posterior localization. Cell. 134 (5), 843-853 (2008).
  31. Catrina, I. E., Marras, S. A., Bratu, D. P. Tiny molecular beacons: LNA/2'-O-methyl RNA chimeric probes for imaging dynamic mRNA processes in living cells. ACS Chemical Biology. 7 (9), 1586-1595 (2012).
  32. Chen, A. K., Behlke, M. A., Tsourkas, A. Efficient cytosolic delivery of molecular beacon conjugates and flow cytometric analysis of target RNA. Nucleic Acids Research. 36 (12), e69(2008).
  33. Nitin, N., Santangelo, P. J., Kim, G., Nie, S., Bao, G. Peptide-linked molecular beacons for efficient delivery and rapid mRNA detection in living cells. Nucleic Acids Research. 32 (6), e58(2004).
  34. Chen, A. K., Behlke, M. A., Tsourkas, A. Avoiding false-positive signals with nuclease-vulnerable molecular beacons in single living cells. Nucleic Acids Research. 35 (16), e105(2007).
  35. Bevilacqua, P. C., Ritchey, L. E., Su, Z., Assmann, S. M. Genome-Wide Analysis of RNA Secondary Structure. Annual Review of Genetics. 50, 235-266 (2016).
  36. Mhlanga, M. M., Vargas, D. Y., Fung, C. W., Kramer, F. R., Tyagi, S. tRNA-linked molecular beacons for imaging mRNAs in the cytoplasm of living cells. Nucleic Acids Research. 33 (6), 1902-1912 (2005).
  37. Eliceiri, K. W., et al. Biological imaging software tools. Nature Methods. 9 (7), 697-710 (2012).
  38. Bolte, S., Cordelieres, F. P. A guided tour into subcellular colocalization analysis in light microscopy. Journal of Microscopy. 224 (Pt 3), 213-232 (2006).
  39. Trcek, T., et al. Drosophila germ granules are structured and contain homotypic mRNA clusters. Nature Commununications. 6, 7962(2015).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Moleculaire beaconmRNA detectielive cell imagingspinning disc confocale microscopieDrosophila eikamertracking van endogeen mRNAIcy softwareanalysespot detectie trackingmicroinjectietechniekfluorescentiemicroscopie

Gerelateerde artikelen