Hier presenteren we een directe intrathecale injectietechniek gebruik van 1% lidocaïne waterstofchloride in een virale oplossing om te zorgen voor efficiënte adeno-associated virus levering aan kleine dieren en een scoresysteem te voorspellen transductie efficiëntie in het midden zenuwstelsel volgens de graad van tijdelijke zwakte veroorzaakt door lidocaïne.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Directe intrathecale injectie van recombinante Adeno-geassocieerde virussen in volwassen muizen
* These authors contributed equally
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Intrathecale (IT) injectie van adeno-associated virus (AAV) heeft veel belangstelling in de therapie van het gen van de CNS uit hoofde van haar veiligheid, noninvasiveness en uitstekende transductie werkzaamheid getrokken in het VNV. Eerdere studies hebben aangetoond de therapeutische werkzaamheid van gentherapie AAV-geleverd in neurodegeneratieve aandoeningen door het bestuur. Echter zijn hoge tarieven van onvoorspelbare falen als gevolg van de technische beperking van IT-beheer in kleine dieren gemeld. Hier, wij opgericht een scoresysteem om aan te geven van de omvang van het succes van Lumbaalpunctie in kleine dieren door 1% lidocaïne waterstofchloride toe te voegen in de injectie-oplossing. Verder laten we zien dat de omvang van de tijdelijke zwakte na injectie de signaaltransductie efficiëntie van AAV kan voorspellen. Dus, is dit IT injectie methode kan worden gebruikt voor het optimaliseren van therapeutische proeven in muismodellen van CNS ziekten die grote regio's van de CNS teisteren.
Inleiding
AAV langdurige en wijdverbreide genexpressie in de signaaltransductie CNS met weinig bijwerkingen kan bemiddelen, en daarom is uitgegroeid tot een van de meest veelbelovende voertuigen voor gentherapie om CNS ziekten met inbegrip van Amyotrofische laterale sclerose (ALS), Huntington van te behandelen ziekte (HD), de ziekte van Alzheimer (AD), opslag Lysosomale ziekten (LSD), de ziekte van Gaucher (GD) en neuronale ceroid lipofuscinose (NCL)1. Momenteel werden meer dan 100 AAV serotypen geïsoleerd van mens en dier. Onder deze, ten minste 12 zijn gebruikt in preklinische en klinische proeven, met inbegrip van de meest gebruikte gebruikt gene vectoren zoals AAV1, 2, 4, 5, 6, 8, 9, rAAVrh.8 en rAAVrh.101,2,3,4, 5,6.
Verschillende CNS aandoeningen vereisen verschillende strategieën van de levering van de AAV als gevolg van de verschillende getroffen regio's van de CNS en celtypes. De CNS regio's en de cel typen die AAV kan transduce is afhankelijk van het serotype evenals leveringsmethode. RAAVrh10 heeft bijvoorbeeld aangetoond dat transduce overwegend astrocyten wanneer geleverd door systemische intraveneuze injectie (IV), terwijl het getransduceerde neuronen én glia wanneer geleverd door intrathecale injectie4,7. Bovendien resulteerde parenchym injectie in lokale transductie tot de omgeving van de injectieplaats, overwegende dat de injectie in de cerebrospinale vloeistof (CSF) via intraventricular of intrathecale injectie in wijdverbreide CNS transductie8 resulteerde . Studies hebben ook aangetoond therapeutische werkzaamheid van gentherapie in neurodegeneratieve aandoeningen AAV-geleverd door beheer9,10,11. Ziekten die invloed hebben op gebieden van het centraal zenuwstelsel zoals ALS, intrathecale injectie in het CB gebleken ter dekking van de meeste gebieden die zijn getroffen door de ziekte met een lagere dosis, in vergelijking met een systemische levering methode4,10. Recente studies hebben ook aangetoond dat Lumbaalpunctie kan worden gebruikt voor het injecteren van AAV in Muismodellen voor ALS, die mogelijke verwondingen laminectomie en intrathecale catheterisatie4is gekoppeld vermijdt.
Experimentele directe Lumbaalpunctie werd eerst gebruikt voor agenten, vooral anesthetica, naar het ruggenmerg voor analgesie en verdoving in 188512,,13. In dit verslag illustreren we de lumbale punctie IT injectie methode in volwassen muizen met behulp van 1% lidocaïne hydrochloride, een lokale amide afkomstige verdovingsmiddel, in de injectie-oplossing te evalueren en controleren van de kwaliteit van de injectie. Succesvolle injecties werden gekenmerkt door lidocaïne-geïnduceerde tijdelijke verlamming, overwegende dat mislukte injecties geen dit gedrag vertonen. We ingedeeld het niveau van voorbijgaande zwakte als één van de vijf klassen om te helpen de efficiëntie van de injectie te voorspellen. Tot slot laten we zien dat het niveau van de transductie rAAVrh10 kan worden voorspeld door de rang van verlamming. Daarom is deze methode voor het bezorgen van de intrathecale AAV inzetbaar verbeteren AAV-gemedieerde gen-voor experimentele therapie van CNS ziekten.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
FVB/NJ muizen werden gefokt in de dier faciliteit van sleutel laboratorium van Hebei neurologie. Alle muis experimenten werden goedgekeurd door de tweede ziekenhuis van Hebei medische universiteit ethische Commissie en uitgevoerd volgens de voorschriften van dierlijke Laboratoriumbeheer uitgevaardigd door het ministerie van wetenschap en technologie van de People's Republic van China.
1. bereiding van de stockoplossing van de 20% lidocaïne Hydrochloride
- Weeg 2 g van lidocaïne hydrochloride. Voeg 5 – 6 mL steriel water en vortex zachtjes. Verhoog het volume tot een totaal van 10 mL met steriel water.
- 1.2 Filtreer de stockoplossing door filters van 0,2 micron. Aliquot de stockoplossing, 1 mL per 1,5 mL microcentrifuge buis, en verzegel het met een verzegeling film. Bewaren bij 4 ° C.
2. directe intrathecale AAV levering in wakker muizen
- Veeg het werkgebied steriel gaas met 70% ethanol en voorbereiden van de vereiste leveringen, zoals vermeld in tabel 1.
- Bereiden van 100 µL AAVrh.10/1% lidocaïne hydrochloride complexe door 95 µL van rAAVrh10 stockoplossing (5 x 1012 genoom kopieën/mL) toe te voegen in een steriele 200 µL microcentrifuge buis, en voeg 5 µL van 20% lidocaïne hydrochloride stockoplossing. Meng goed door pipetteren omhoog en omlaag. Sla de virus oplossing op ijs (4 ° C).
Opmerking: 8 µL per muis4 zal worden gebruikt. -
Voorbereiding van de spuit met AAV oplossing voor injectie
- Monteren van een 25 µL Hamilton syringe met een 27 G naald en uitlijnen van de schuine punt van de naald met de volumetrische schaal op de spuit.
- Teken 8 µL met 4 x 1010 genoom kopieën van het virus oplossing voorzichtig in de spuit. Zorg ervoor om luchtbellen te verwijderen.
-
Voorbereiding van de muis
Opmerking: mannelijke of vrouwelijke FVB/NJ muizen (30 – 70 dagen oud) in deze studie werden gebruikt. IT injectie werd geëxploiteerd in de kap.- Steriliseren van het werkgebied in een kap met 70% ethanol. De wakker muis (man of vrouw, 30-70 dagen oud, 13 – 20 g gewicht) zetten een bedpiece in een liggend in de kap. Betrekking hebben op het bovenlichaam met steriel gaas om te kalmeren de muis en voorkomen zijn gebeten.
- Het oplossen van het dier door aangrijpend op passende wijze en stevig op haar bekkengordel met een duim op één kant en wijsvinger/midden vinger aan de andere kant. Houd de huid tussen bilaterale pelvic Gaines (step-ins) strak met de duim en wijsvinger. Houd zachtjes op het bovenlichaam van het dier met de palm.
- Scheren van de vacht op zijn rug tussen de bilaterale pelvic Gaines (step-ins) en steriliseren van het huidoppervlak met een jodide gebaseerde struikgewas en 70% ethanol.
-
Intrathecale injectie12
- Het gevoel van de lat. ruimte langs de middelste lijn tussen de bilaterale pelvic Gaines (step-ins) met een duim of wijsvinger van de andere hand en druk op een kuiltje met een nagel om aan te geven van de L5-L6 lat. ruimte (Zoek de injectieplaats).
- De basis van de staart licht en zachtjes draaien om aan te geven van de middellijn van de wervelkolom. Aanpassen van de naald schuine kant naar het hoofd van het dier vóór injectie (vermeld in stap 2.3.1).
- Zorg ervoor dat de dieren stevig vast en uitlijnen van de naald langs de middellijn van de wervelkolom.
- De naald voorzichtig en verticaal invoegen (of kantelen iets 70-80°) in het snijpunt van inspringen en houd de spuit in een centrale sagittale vlak. Verminderen van de hoek tot ongeveer 30° langzaam wanneer het verbindt het bot en de naald glijden in de lat. ruimte.
Opmerking: Een flick duidelijk plotselinge staart is een teken van succesvolle entree in de intradural ruimte. Zodra de naald de lat. ruimte gaat, zal de naald tip voelt stevig geklemd. De 27 G naald gebruikt in deze studie is geschikt voor IT levering in muizen maar niet ratten. - Injecteer de oplossing van de vector (vermeld in stap 2.2). Start de timer en injecteren 8 µL van de vector-oplossing bij een snelheid van 1 µL/4 s. behouden de naald ongeveer 1 min. na het beëindigen van levering. De naald met zachte rotatie om te voorkomen dat lekkende trekken.
- De tijdelijke zwakte van de muis ledematen onmiddellijk na de levering te evalueren van de injectie kwaliteit4scoren.
Opmerking: De standaard is als volgt:4 Score van 0: geen zwakte; Score van 1: minor zwakte van de ledematen hind zonder gait abnormaliteit; Score van 2: matig zwakte van de ledematen hind met voor de hand liggende gait abnormaliteit; Score van 3: volledige verlamming van de ledematen van hind; Score van 4: volledige verlamming van de ledematen hind, kortademigheid en gematigde zwakte van de fore ledematen; en score 5: volledige verlamming van alle vier ledematen en duidelijk kortademigheid. - Verplaats de muis terug naar de kooi voor het herstel van verlamming.
-
Opruimen
- Spoel de injectiespuit met 1 mL steriel water. Laboratorium benodigdheden sorteren en verzamelen van alle niet-disposable materialen voor gesteriliseerde met autoclaaf sterilisatie. Reinig de Bank met 70% ethanol.
3. de weefsels voorbereiding immunohistochemische kleuring
-
Weefsel collectie
- Anesthetize muizen op 21 dagen na injectie met 3% Chloraalhydraat (0,1 mL/10 g) diep door intraperitoneale injectie.
- Perfuse transcardially met 20 mL ijskoud 0,01 M PBS (NaCl 147 mM; NaH2PO4 1.9 mM; K2HPO4 8.1 mM, pH 7.4) om te beginnen, dan 4% ijskoude paraformaldehyde (in 0,01 M PBS) met pomp (10 mL/min voor 1 min en vervolgens 5 mL/min voor 9 min).
Let op: Paraformaldehyde is kankerverwekkend en giftig. Omgaan alleen in de zuurkast terwijl het dragen van handschoenen.
-
Dissectie van het ruggenmerg en de hersenen
- Herstellen van de ledematen en hoofd van elk dier in een liggend op een vak van schuimstof met de spuit naalden, dan strippen en verwijderen van de huid van het hoofd naar heiligbeen met een schaar.
- Clip van de schedel tussen ogen, naast de middelste route van de schedel en de horizontale lijn op het cerebellum knipt en daarna de schedel aan beide zijden te openen.
- Til het achterhoofdsbeen met een pincet en open het spinale kanaal bilateraal met ophthalmic schaar. Afgesneden van de ribben aan weerszijden en zorgvuldig verwijderen van de bovenste helft van de wervels.
- Lift van de hersenen met gebogen pincet en verbreken van de zenuwen van de schedel basis, dan ontleden zorgvuldig uit de hele hersenen en het ruggenmerg. Na correctie van de weefsels in 4% paraformaldehyde gedurende 24 uur.
-
Voorbereiding van weefsel segmenten
- Cryoprotect de hersenen en cervicale en lumbale ruggenmerg in 30% sacharoseoplossing overnacht bij 4 ° C. Insluiten van het weefsel in optimale snijden temperatuur (OCT) samengestelde en bevriezen snel met vloeibare stikstof.
- Knip het weefsel op 25 µm met behulp van een cryostaat en opslaan van de bevroren secties in 0,01 M PBS bij 4 ° C voor gebruik.
4. Immunohistochemistry
- Voorbehandeling van de vrij zwevende secties in 1% H2O2 voor 10 min, dan wassen in PBS voor 10 min. Incubate in een blokkerende oplossing met serum van 5% en 0,3% niet-ionogene wasmiddel in PBS gedurende 1 uur.
- Incubeer de plakjes met corresponderende primaire antilichamen 's nachts bij 4 ° C. Wassen van de secties in PBST (0,2% Tween 20 in PBS) voor 30 min. (3 keer voor elke 10 min).
- Incubeer de plakjes met bijbehorende Biotine-secundair antilichaam bij kamertemperatuur voor 1 h. wassen in PBST voor 30 min. (3 keer voor elke 10 min).
- Incubeer de secties met affiniteit Biotine peroxidase complex voor 40 min en vlek met achromogenic agent. Monteren van de secties in dia's en goed droog.
- Geniet van de dia's in watervrij ethanol voor 5 min en xyleen gedurende 10 minuten, en vervolgens zegel van de dia's met een montage-medium. Ten slotte, het imago van de dia's met een microscoop voorzien van een charge - coupled apparaat (CCD) op 100 x, 200 x en 400 x vergrotingen.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Muizen toonde verschillende graden van tijdelijke zwakte direct na het injecteren van AAV oplossing in 1% lidocaïne hydrochloride als gevolg van verschillende kwaliteit van intrathecale injectie. Volgens het semi-kwantitatieve 5-grade scoresysteem, we hebben vastgesteld, wij de patronen van de transductie van AAV getest in muizen met verschillende graden van lidocaïne-geïnduceerde ledemaat zwakte (score van 0, n = 2; score 1, n = 1; score 4, n = 4; score 5, n = 3). EGFP immunokleuring van...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Technisch, zijn er verschillende kritische stappen tijdens de injectie van de IT in wakker muizen. Eerste, goede gebaar en firma controle van de muizen gedurende de hele operatie is een voorwaarde voor succesvolle levering. Ten tweede is het moeilijkste punt de lat. ruimte met de naald tip, gevoel als er moet niet te diep invoegen zonder weerstand of invoegen onder dwang onder sterke weerstand in het geval van de dieren verwonden of buigend van de naald-tip. Ten derde, hoewel de tijdelijke verlamming als gevolg van lidoc...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben niets te onthullen.
Dankbetuigingen
Dit werk werd gefinancierd door een subsidie van HEBEI provinciale afdeling van menselijke hulpbronnen en sociale zekerheid (CY201605) en een subsidie van Natural Science Foundation Hebei provincie (H2017206101), en we zijn zeer dankbaar Dr Guangping Gao, die de AAV voor Deze studie.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| FVB/NJ muizen | Charles River Laboratories China | ||
| Lidocaine hydrochloride monohydraat | HEOWNS | 73-78-9 | |
| AAV | Viral Vector Core van het Gene Therapy Center aan de University of Massachusetts Medical School | ||
| 25 µL Hamilton spuit/27-30 G naald | GASTIGHT | 1702 | |
| O.C.T compond | SAKURA | 4583 | |
| H 2O 2 | SHUI HUAN PAI | 170401 | |
| Geitenserum | Solarbio | S9070 | |
| Triton X-100 | LIFE SCIENCES | T8200 | |
| Konijn anti-GFP | Life tech | G10362 | 1:333 verdunning |
| Het tweede antilichaam (geit-anti konijn) | Jackson Immuno Research | 111-005-144 | 1:1.000 verdunning |
| VECTASTAIN ABC REAGENT | Vector Lab | PK-6100 | |
| ImmPACT DAB Peroxidase Substraat Kit | Vector Lab | SK-4105 | |
| Montagemedium voor fluorescentie met DAPI | Vectorshield | H-1200 | |
| NaCl | Yong Da Chemical | ||
| NaH2PO4·2H2O | Yong Da Chemical | ||
| Na2HPO4·12H2O | Yong Da Chemical | ||
| Paraformaldehyde | Yong Da Chemical | 307699 | |
| Adhesie Microscoopglazen | CITOGLAS | 17083 | 25 mm x 75 mm |
| SUPER-SLIP MICRO-GLAS | Electro Microscopy Siences | 72236-60 | 24 mm x 60 mm |
| 15 mL Centrifugeerbuisje | CORNING | 430790 | |
| 96 wel celcultuur cluster | Coster | 3599 | |
| 24 wel celcultuur cluster | Coster | 3524 | |
| 70% Ethanol | WEN ZHI | ||
| Gaas | Wei AN | 05171112 | 8 cm x 10 cm x 12 cm |
| 1 mL spuit | Hong Da | ||
| Microbuisjes | Plasmed | ||
| Micropipet | eppendorf | ||
| Peppet tips | Rainin | ||
| Centrifuge | eppendorf | 5427R | |
| Regerator | Haier | BCD-539WT | |
| Filter | MILLEX GP | R4PA42342 | |
| Pomp | LongerPump | BT-100-2J/YZ1515X | |
| Microscoop | Olympus | BX53 | |
| Freezing-microtoom | Leica | CM1520 |
Referenties
- Murlidharan, G., Samulski, R. J., Asokan, A. Biology of adeno-associated viral vectors in the central nervous system. Frontiers in Molecular Neuroscience. 7, 76(2014).
- Lentz, T. B., Gray, S. J., Samulski, R. J. Viral vectors for gene delivery to the central nervous system. Neurobiology Disease. 48 (2), 179-188 (2012).
- Yang, B., et al. Global CNS transduction of adult mice by intravenously delivered rAAVrh.8 and rAAVrh.10 and nonhuman primates by rAAVrh.10. Molecular Therapy. 22 (7), 1299-1309 (2014).
- Guo, Y., et al. A Single Injection of Recombinant Adeno-Associated Virus into the Lumbar Cistern Delivers Transgene Expression Throughout the Whole Spinal Cord. Molecular Neurobiology. 53 (5), 3235-3248 (2016).
- Hastie, E., Samulski, R. J. Adeno-associated virus at 50: a golden anniversary of discovery, research, and gene therapy success--a personal perspective. Human Gene Therapy. 26 (5), 257-265 (2015).
- Hocquemiller, M., Giersch, L., Audrain, M., Parker, S., Cartier, N. Adeno-Associated Virus-Based Gene Therapy for CNS Diseases. Human Gene Therapy. 27 (7), 478-496 (2016).
- Tanguy, Y., et al. Systemic AAVrh10 provides higher transgene expression than AAV9 in the brain and the spinal cord of neonatal mice. Frontiers in Molecular Neuroscience. 8, 36(2015).
- Federic, T., et al. Robust spinal motor neuron transduction following intrathecal delivery of AAV9 in pigs. Gene Therapy. 19, 852-859 (2012).
- Ayers, J. I., et al. Widespread and efficient transduction of spinal cord and brain following neonatal AAV injection and potential disease modifying effect in ALS mice. Molecular Therapy. 23 (1), 53-62 (2015).
- Li, D., et al. Slow Intrathecal Injection of rAAVrh10 Enhances its Transduction of Spinal Cord and Therapeutic Efficacy in a Mutant SOD1 Model of ALS. Neuroscience. 365, 192-205 (2017).
- Borel, F., et al. Therapeutic rAAVrh10 Mediated SOD1 Silencing in Adult SOD1(G93A) Mice and Nonhuman Primates. Human Gene Therapy. 27 (1), 19-31 (2016).
- Fairbanks, C. A. Spinal delivery of analgesics in experimental models of pain and analgesia. Advanced Drug Delivery Reviews. 55 (8), 1007-1041 (2003).
- Hylden, J. L., Wilcox, G. L. Intrathecal morphine in mice: a new technique. European Journal of Pharmacology. 67, 313-316 (1980).
- Wang, H., et al. Widespread spinal cord transduction by intrathecal injection of rAAV delivers efficacious RNAi therapy for amyotrophic lateral sclerosis. Human Molecular Genetics. 23 (3), 668-681 (2014).
- Wang, Y., et al. scAAV9-VEGF prolongs the survival of transgenic ALS mice by promoting activation of M2 microglia and PI3K/Akt pathway. Brain Research. 1648, Pt A 1-10 (2016).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
