Dit protocol beschrijft een fluorescentie schommelingen spectroscopie gebaseerde aanpak om te onderzoeken van interacties tussen eiwitten bemiddelen cel interacties, d.w.z. eiwitten gelokaliseerd in cel kruispunten, rechtstreeks in levende cellen. Wij bieden gedetailleerde richtsnoeren op kalibreren van het instrument, data-acquisitie en analysemethoden, inclusief correcties mogelijk artefact bronnen.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Een fluorescentie schommelingen spectroscopie Assay voor eiwit-eiwitinteractie op cel contacten
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Een scala aan biologische processen omvat cel interacties, meestal gemedieerd door eiwitten die op het raakvlak tussen naburige cellen samenwerken. Van belang zijn slechts weinig testen staat specifiek indringende dergelijke interacties rechtstreeks in levende cellen. Hier presenteren we een test voor het meten van de binding van eiwitten geeft uiting aan de oppervlakken van naburige cellen, op cel contacten. Deze test bestaat uit twee stappen: vermenging van cellen uiten van de proteïnen van belang gesmolten aan verschillende fluorescente proteïnen, gevolgd door fluorescentie schommelingen spectroscopie metingen op cel-cel contacten met behulp van een confocale laser scanning microscoop. We aantonen de haalbaarheid van deze test in een biologisch relevante context door het meten van de interacties van de amyloïde precursor-achtige eiwitten 1 (APLP1) over de cel-cel kruispunten. Wij bieden gedetailleerde protocollen op de data-acquisitie met behulp van fluorescentie gebaseerde technieken (scannen van fluorescentie cross-correlatie spectroscopie, cross-correlatie nummer en helderheid analyse) en het vereiste instrument kalibraties. Verder bespreken we kritische stappen in de data-analyse en hoe te identificeren en corrigeren van externe, vals signaal variaties, zoals die als gevolg van photobleaching of cel verkeer.
In het algemeen, de voorgestelde bepaling is van toepassing op elke homo- of heterotypic eiwit-eiwit interactie op cel contacten, tussen de cellen van de dezelfde of verschillende typen en op een commerciële confocale laser scanning microscoop kan worden uitgevoerd. Een belangrijke voorwaarde is de stabiliteit van het systeem, dat volstaan moet om de sonde diffusive dynamiek van de proteïnen van belang over enkele minuten.
Inleiding
Veel biologische processen zich voordoen op de sites van cel-cel interacties, bijvoorbeeld cel-cel adhesie1,2,3, cel-cel fusion4 en cellulaire erkenning5. Dergelijke gebeurtenissen zijn vooral belangrijk bij de ontwikkeling van meercellige organismen en voor cel-cel communicatie, bijvoorbeeld tijdens de immuunrespons. Deze processen zijn meestal gemedieerd door eiwitten die zijn gelokaliseerd aan het oppervlak, dat wil zeggen, op het plasma-membraan (PM) van naburige cellen en specifieke interacties op....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
1. monstervoorbereiding: Assay van het mengen van de cel
Opmerking: Het volgende protocol beschrijft de mengen procedure voor Adherente cellen. Het kan worden gewijzigd voor de cellen gekweekt in suspensie.
- Zaad van een voldoende aantal cellen in een 6-well-plate, bijvoorbeeld 800.000 HEK 293T cellen (geteld met een Neubauer tellen kamer), een dag voor Transfectie. Het nummer kan worden aangepast afhankelijk van de tijd tussen zaaien en transfectie en aangepast voor andere celtypes. Voorbereiden voor het uitvoeren van een eenvoudige experiment (dat wil zeggen, eiwitten van belang en negatieve controle), ten minst....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Een eerste test voor de eiwit-eiwit interactie assay, dat wil zeggen, mengen van cellen uiten spectraal verschillende fluorescente proteïnen, gevolgd door sFCCS/ccN & B metingen (Figuur 1), moet worden uitgevoerd op eiwitten die naar verwachting niet werken bij de cel contact (dat wil zeggen, een negatieve controle). Daarom HEK 293T cellen, uiting van myristoylated-palmitoylated-mEYFP (myr-palm-mEYFP) of -mCardinal waren gemengd en sFCCS wer.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
De experimentele procedure die hier beschreven staat het onderzoek van eiwit-eiwitinteractie trans interacties bij cel contacten, fluorescentie schommelingen spectroscopie technieken, namelijk sFCCS en ccN & B. Deze methodes omvatten een statistische analyse van de schommelingen van de fluorescentie die wordt uitgestoten door twee spectraal gescheiden FPs gesmolten tot de expressie gebrachte eiwitten van belang bij een contact van twee naburige cellen, elk één of de andere fusieproteïne uitdrukken. De aanwezighe.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben niets te onthullen.
Dankbetuigingen
Dit werk werd gedeeltelijk ondersteund door de Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) verlenen van 254850309. De auteurs bedanken Madlen Luckner voor kritische lezing van het manuscript.
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
```html
```
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| DMEM groeimedium | PAN-Biotech | P04-01548 | |
| DPBS zonder: Ca2+ en Mg2+ | PAN-Biotech | P04-36500 | |
| DPBS met: Ca2+ en Mg2+ | PAN-Biotech | P04-35500 | |
| Trypsine EDTA | PAN-Biotech | P10-023100 | |
| TurboFect Transfectiereagens | Thermo Fisher Scientific | R0531 | |
| HEK 293T cellen | DSMZ | ACC 635 | |
| Alexa Fluor 488 NHS Ester | Thermo Fisher Scientific | A20000 | |
| Rhodamine B | Sigma-Alderich | 83689-1G | |
| Plasmid DNA | Addgene | NA | Zie referentie 12 (Dunsing et. al., MBoC 2017), voor een gedetailleerde beschrijving van alle plasmiden |
| 6-well plate | Starlab | CC7672-7506 | |
| 35-mm glazen bodem schotels | CellVis | D35-14-1.5-N | |
| Zeiss LSM780 confocal | Carl Zeiss | NA | |
| MATLAB softwarepakket | MathWorks | 2015b | |
| Neubauer celtellingskamer | Marienfeld | 640110 |
Referenties
- Alberts, B., Johnson, A., Lewis, J., Raff, M., Roberts, K., Walter, P. Molecular biology of the cell. , Garland Science. (2002).
- Tepass, U., Truong, K., Godt, D., Ikura, M., Peifer, M. Cadherins in embryonic and neural morphogenesis. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 1 (2), 91-100 (2000).
- Harris, T. J. C., Tepass, U.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
