Method Article

Een Micro-CT-gebaseerde methode voor het karakteriseren van laesies en vinden van elektroden in kleine dierlijke hersenen

DOI:

10.3791/58585

⸱

November 8th, 2018

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Molecular and Cellular Biology, Harvard University, 2Center for Brain Science, Harvard University, 3Department of Organismic and Evolutionary Biology, Harvard University, 4Institute of Science and Technology Austria

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit artikel beschrijft een eenvoudige methode ter voorbereiding van kleine dierlijke hersenen van micro-CT beeldvorming, in welke letsels kunnen worden gekwantificeerd en elektroden gelegen met hoge precisie in de context van de hele hersenen.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Laesie en elektrode locatie verificatie zijn traditioneel gedaan via histopathologisch onderzoek van gebeitst hersenen segmenten, een tijdrovende procedure waarvoor handmatige schatting. Hier beschrijven we een eenvoudige methode voor de kwantificering van de laesies en lokaliseren van elektroden in de hersenen die is minder moeizaam en meer gedetailleerde resultaten oplevert. Hele hersenen zijn gekleurd met osmium tetroxide, ingebed in hars en beeld met een micro-CT-scanner. De scans resulteren in 3D digitale delen van de hersenen met resoluties en virtuele sectie diktes afhankelijk van de grootte van de steekproef (12-15 en 5-6 µm per voxel voor rat en Zebravink hersenen, respectievelijk). Dagbouw of diepe letsels kunnen gekarakteriseerd worden, en enkele schutterijofficieren, tetrode arrays, elektrolytische laesies en silicium sondes kunnen ook worden gelokaliseerd. Vrije en propriëtaire software kan onderzoekers te onderzoeken het monstervolume van een vliegtuig en segment het volume handmatig of automatisch. Omdat deze methode hele hersenvolume genereert, kunnen laesies en elektroden worden gekwantificeerd om een veel hogere mate dan in de huidige methoden, die zal helpen bij het standaardiseren van vergelijkingen binnen en tussen studies.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Neurowetenschappers hebben vertrouwd op laesies voor een lange tijd om te begrijpen van de relatie tussen functie en locatie in de hersenen. Bijvoorbeeld, waren ons begrip van de hippocampus als onmisbaar voor leren en geheugen en van de prefrontale cortex als sleutel voor impuls controle beide producten van serendipitous laesies in mensen1,2. Het gebruik van diermodellen, echter neurowetenschappers om de kracht van letsels door verder te gaan dan serendipity heeft toegestaan, en de functie van talloze hersengebieden heeft zijn toegelicht door middel van systematische studies van de structuur-functie relaties ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Alle zorg en experimentele manipulatie van dieren werden herzien en goedgekeurd door het Harvard institutionele dier zorg en gebruik Comité. De perfusie hier beschreven is specifiek voor ratten, maar de procedure is van toepassing op alle dieren met kleinere of vergelijkbaar formaat hersenen.

1. perfusie

  1. Bereiden 1 x-fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS). Voor een rat (leeftijd: 0,5-1,5 jaar oud, gewicht: 250 en 600 g), 800 – 1000 mL zou voldoende moeten zijn. Hiermee kunt u dat 400 mL perfuse het dier en een extra 400 mL, Verdun de fixeerspray.
  2. De bestaande uit 2% (g/v) paraformaldehyde (PFA) en 2,5% (m/v) Glutaaraldehy....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Traditioneel, hersenen zijn gesegmenteerd en gekleurd om te kwantificeren laesies en zoek elektroden, maar deze methode is foutgevoelig, arbeidsintensief, en meestal vereist een schatting van de resultaten. Door de gehele hersenen voorbereiden micro-CT beeldvorming, de kans op beschadiging van de monsters is sterk verminderd, kenmerken van belang in de context van de gehele hersenen kunnen worden geanalyseerd en de methode leent zich voor parallelle verwerking van vele monsters, aanzienli.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De volgende kritische stappen bij het protocol zijn: ten eerste, het gebruik van een combinatie van PFA en GA naar de perfuse van het dier en vervolgens na het monteren van de hersenen was primordiaal voor het bereiken van overeenstemming volledige osmium penetratie van het weefsel. Hoewel wij dit niet expliciet testen, is een plausibele verklaring dat PFA fixatie omkeerbare15, overwegende dat GA fixatie niet omkeerbaar16,17 is. Omdat een .......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben niets te onthullen.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs bedanken Greg Lin en Arthur McClelland voor hun expertise met de micro-CT machine, David Richmond Hunter Elliott ter naar de spiegelbeeld en Data analyse Core (IDAC) aan de Harvard Medical School voor hun advies voor beeldverwerking en William Liberti in Boston Universiteit genadig voorzien van een Zebravink hersenen. Dit werk werd uitgevoerd onder in het midden voor nanoschaal systemen (CNS), een lid van de nationale nanotechnologie gecoördineerde infrastructuur netwerk (NNCI), die wordt ondersteund door de National Science Foundation onder NSF award nr. 1541959. CNS is een onderdeel van de Harvard-universiteit. Dit werk werd gesteund door de Richard en Su....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Paraformaldehyde (PFA)Electron Microscopy Sciences (EMS)157102% (w/v/) in 1X PBS
Glutaraldehyde (GA)EMS162202.5% (w/v) GA in 1x PBS
OsO4EMS19190Work in fume hood
EthanolDecon LabsKoptec140, 190, 200 proof
AcetoneEMS10015Glass-distilled
Durcupan ACM resinSigma-Aldrich44610A, B, C and D components, resin for embedding
Disposable moldsTed Pella27114Suggested
milliQ water (ultrapure water)Millipore SigmaQGARD00R1 (or related purifier)Suggested
Parafilm (paraffin film)Millipore SigmaP7793Suggested paraffin film
Micro-CT scannerNikon Metrology Ltd., Tring, UKX-Tek HMS ST 225Used by authors
Software for visualizing and analyzing micro-CT scans:
Volume GraphicsVG Studio MaxUsed by authors
FEI / Thermo ScientificAvizoUsed by authors
FEI / Thermo ScientificAmiraSimilar to Avizo
Mark Sutton & Russell GarwoodSpiersFree, http://spiers-software.org/
Pixmeo SarlOsirix LiteFree, https://www.osirix-viewer.com/
Open SourceFIJIFree, https://fiji.sc/
AdobePhotoshopGood for analyzing one slice at a time

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Scoville, W., Milner, B. Loss of recent memory after bilateral hippocampal lesions. Journal of Neuropsychiatry and Clinical Neuroscience. 12, 103-113 (2000).
  2. Damasio, H., Grabowski, T., Frank, R., Galaburda, A. M., Damasio, A. R. The return of Phineas Gage: clues about the brain from the skull of a famous patient. Science. 264 (5162), 1102-1105 (1994)....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Micro CT ImagingLesion CharacterizationElectrode LocalizationOsmium Tetroxide StainingBrain Tissue Preparation3D Volume AnalysisVirtual SectioningSmall Animal BrainsResin EmbeddingTissue Dehydration

Related Articles