Dit artikel beschrijft een eenvoudige methode ter voorbereiding van kleine dierlijke hersenen van micro-CT beeldvorming, in welke letsels kunnen worden gekwantificeerd en elektroden gelegen met hoge precisie in de context van de hele hersenen.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Een Micro-CT-gebaseerde methode voor het karakteriseren van laesies en vinden van elektroden in kleine dierlijke hersenen
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Laesie en elektrode locatie verificatie zijn traditioneel gedaan via histopathologisch onderzoek van gebeitst hersenen segmenten, een tijdrovende procedure waarvoor handmatige schatting. Hier beschrijven we een eenvoudige methode voor de kwantificering van de laesies en lokaliseren van elektroden in de hersenen die is minder moeizaam en meer gedetailleerde resultaten oplevert. Hele hersenen zijn gekleurd met osmium tetroxide, ingebed in hars en beeld met een micro-CT-scanner. De scans resulteren in 3D digitale delen van de hersenen met resoluties en virtuele sectie diktes afhankelijk van de grootte van de steekproef (12-15 en 5-6 µm per voxel voor rat en Zebravink hersenen, respectievelijk). Dagbouw of diepe letsels kunnen gekarakteriseerd worden, en enkele schutterijofficieren, tetrode arrays, elektrolytische laesies en silicium sondes kunnen ook worden gelokaliseerd. Vrije en propriëtaire software kan onderzoekers te onderzoeken het monstervolume van een vliegtuig en segment het volume handmatig of automatisch. Omdat deze methode hele hersenvolume genereert, kunnen laesies en elektroden worden gekwantificeerd om een veel hogere mate dan in de huidige methoden, die zal helpen bij het standaardiseren van vergelijkingen binnen en tussen studies.
Inleiding
Neurowetenschappers hebben vertrouwd op laesies voor een lange tijd om te begrijpen van de relatie tussen functie en locatie in de hersenen. Bijvoorbeeld, waren ons begrip van de hippocampus als onmisbaar voor leren en geheugen en van de prefrontale cortex als sleutel voor impuls controle beide producten van serendipitous laesies in mensen1,2. Het gebruik van diermodellen, echter neurowetenschappers om de kracht van letsels door verder te gaan dan serendipity heeft toegestaan, en de functie van talloze hersengebieden heeft zijn toegelicht door middel van systematische studies van de structuur-functie relaties ....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Alle zorg en experimentele manipulatie van dieren werden herzien en goedgekeurd door het Harvard institutionele dier zorg en gebruik Comité. De perfusie hier beschreven is specifiek voor ratten, maar de procedure is van toepassing op alle dieren met kleinere of vergelijkbaar formaat hersenen.
1. perfusie
- Bereiden 1 x-fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS). Voor een rat (leeftijd: 0,5-1,5 jaar oud, gewicht: 250 en 600 g), 800 – 1000 mL zou voldoende moeten zijn. Hiermee kunt u dat 400 mL perfuse het dier en een extra 400 mL, Verdun de fixeerspray.
- De bestaande uit 2% (g/v) paraformaldehyde (PFA) en 2,5% (m/v) Glutaaraldehy....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Traditioneel, hersenen zijn gesegmenteerd en gekleurd om te kwantificeren laesies en zoek elektroden, maar deze methode is foutgevoelig, arbeidsintensief, en meestal vereist een schatting van de resultaten. Door de gehele hersenen voorbereiden micro-CT beeldvorming, de kans op beschadiging van de monsters is sterk verminderd, kenmerken van belang in de context van de gehele hersenen kunnen worden geanalyseerd en de methode leent zich voor parallelle verwerking van vele monsters, aanzienli.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
De volgende kritische stappen bij het protocol zijn: ten eerste, het gebruik van een combinatie van PFA en GA naar de perfuse van het dier en vervolgens na het monteren van de hersenen was primordiaal voor het bereiken van overeenstemming volledige osmium penetratie van het weefsel. Hoewel wij dit niet expliciet testen, is een plausibele verklaring dat PFA fixatie omkeerbare15, overwegende dat GA fixatie niet omkeerbaar16,17 is. Omdat een .......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben niets te onthullen.
Dankbetuigingen
De auteurs bedanken Greg Lin en Arthur McClelland voor hun expertise met de micro-CT machine, David Richmond Hunter Elliott ter naar de spiegelbeeld en Data analyse Core (IDAC) aan de Harvard Medical School voor hun advies voor beeldverwerking en William Liberti in Boston Universiteit genadig voorzien van een Zebravink hersenen. Dit werk werd uitgevoerd onder in het midden voor nanoschaal systemen (CNS), een lid van de nationale nanotechnologie gecoördineerde infrastructuur netwerk (NNCI), die wordt ondersteund door de National Science Foundation onder NSF award nr. 1541959. CNS is een onderdeel van de Harvard-universiteit. Dit werk werd gesteund door de Richard en Su....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Paraformaldehyde (PFA) | Electron Microscopy Sciences (EMS) | 15710 | 2% (w/v/) in 1X PBS |
| Glutaraldehyde (GA) | EMS | 16220 | 2.5% (w/v) GA in 1x PBS |
| OsO4 | EMS | 19190 | Werk in afzuigkap |
| Ethanol | Decon Labs | Koptec | 140, 190, 200 proof |
| Aceton | EMS | 10015 | Glas-gedistilleerd |
| Durcupan ACM hars | Sigma-Aldrich | 44610 | A, B, C en D componenten, hars voor inbedding |
| Instelbare mallen | Ted Pella | 27114 | Aanbevolen |
| milliQ water (ultrapuur water) | Millipore Sigma | QGARD00R1 (of gerelateerde zuiveringssysteem) | Aanbevolen |
| Parafilm (paraffinefolie) | Millipore Sigma | P7793 | Aanbevolen paraffinefolie |
| Micro-CT scanner | Nikon Metrology Ltd., Tring, UK | X-Tek HMS ST 225 | Gebruikt door auteurs |
| Software voor het visualiseren en analyseren van micro-CT scans: | |||
| Volume Graphics | VG Studio Max | Gebruikt door auteurs | |
| FEI / Thermo Scientific | Avizo | Gebruikt door auteurs | |
| FEI / Thermo Scientific | Amira | Vergelijkbaar met Avizo | |
| Mark Sutton & Russell Garwood | Spiers | Gratis, http://spiers-software.org/ | |
| Pixmeo Sarl | Osirix Lite | Gratis, https://www.osirix-viewer.com/ | |
| Open Source | FIJI | Gratis, https://fiji.sc/ | |
| Adobe | Photoshop | Goed voor het analyseren van één slice tegelijk |
Referenties
- Scoville, W., Milner, B. Loss of recent memory after bilateral hippocampal lesions. Journal of Neuropsychiatry and Clinical Neuroscience. 12, 103-113 (2000).
- Damasio, H., Grabowski, T., Frank, R., Galaburda, A. M., Damasio, A. R. The return of Phineas Gage: clues about the brain from the skull of a famous patient. Science. 264 (5162), 1102-1105 (1994)....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
