Analyse van Actomyosin dynamiek op lokale cellulaire en weefsel schalen met behulp van timelapse-films van gekweekte Drosophila Eier kamers

Samenvatting

Dit protocol biedt een op Fiji gebaseerde, gebruiksvriendelijke methodologie, samen met eenvoudige instructies waarin wordt uitgelegd hoe u het gedrag van actomyosine in afzonderlijke cellen en gebogen epitheel weefsels betrouwbaar analyseren. Er zijn geen programmeervaardigheden vereist om de tutorial te volgen; alle stappen worden uitgevoerd op een semi-interactieve manier met behulp van de grafische gebruikersinterface van Fiji en bijbehorende plugins.

Samenvatting

Drosophila onrijpe eieren heten Eier kamers, en hun structuur lijkt op primitieve organen die morfologische veranderingen ondergaan van een ronde tot een ellipsoïde vorm tijdens de ontwikkeling. Dit ontwikkelingsproces wordt oögenese genoemd en is cruciaal voor het genereren van functionele volwassen eieren om de volgende vlieggeneratie te beveiligen. Om deze redenen hebben Eier kamers gediend als een ideaal en relevant model om de ontwikkeling van dierlijke organen te begrijpen.

Verschillende in vitro kweek protocollen zijn ontwikkeld, maar er zijn verschillende nadelen aan deze protocollen. De ene omvat de toepassing van verschillende covers die een kunstmatige druk uitoefenen op de afbeelding gemaakt Eier kamers om ze te immobiliseren en om het beeldoppervlak van de omtrek van de geanalyseerde Eier kamers te vergroten. Een dergelijke benadering kan een negatieve invloed hebben op het gedrag van de dunne actomyosine-machine die de kracht genereert om Eier kamers rond hun langere as te draaien.

Dus om deze beperking te overwinnen, cultuur we Drosophila Eier kamers vrij in de media om betrouwbaar actomyosine machines te analyseren langs de omtrek van de Eier kamers. In het eerste deel van het Protocol, bieden we een handmatige Details over het analyseren van de actomyosine machines in een beperkte acquisitie vliegtuig op de lokale cellulaire schaal (maximaal 15 cellen). In het tweede deel van het Protocol bieden we gebruikers een nieuwe plug-in op basis van Fiji waarmee de eenvoudige extractie van een gedefinieerde dunne laag van het omtrek oppervlak van de Eier kamers mogelijk is. Het volgende protocol beschrijft vervolgens hoe te analyseren actomyosine signalen op de weefsel schaal (> 50 cellen). Tot slot, we lokaliseren de beperkingen van deze benaderingen op zowel de lokale cellulaire en weefsel schalen en bespreken van de mogelijke toekomstige ontwikkeling en mogelijke toepassingen.

Inleiding

De voortdurende ontwikkeling van nieuwe beeldvormings-en software technologieën met toepassingen in de biowetenschappen heeft een enorme impact op het begrijpen van de basisprincipes van het leven gegeven. Een van de grootste uitdagingen is de betrouwbare visualisatie van ontwikkelingsprocessen in combinatie met hun Live beeldvorming in verschillende weefsels. Weefsels zijn delen van organen en lichamen en als zodanig zijn de meeste niet gemakkelijk toegankelijk voorbeeld vorming. Daarom zijn protocollen die hun dissectie en in-vitro kweek mogelijk maken, ontwikkeld om biologische gebeurtenissen te visualiseren die de in vivo situatie in een levend lichaam voldoende weerspiegelen.

In de afgelopen decennia heeft de kweek en live beeldvorming van Drosophila Eier kamers, acinar achtige structuren die lijken op primitieve organen, enorm bijgedragen aan het begrijpen van de basisprincipes van primitieve orgaan ontwikkeling^{1 , 2 , 3}. op dit moment zijn er verschillende kweek protocollen beschikbaar, en het gebruik ervan is afhankelijk van de acquisitie tijd, het celtype dat moet worden afgebeeld en hun toegankelijkheid (bijv. binnenste kiembaan versus buitenste somatische lijn)⁴.

Een gemeenschappelijk kenmerk in al deze kweek protocollen is de noodzaak voor de immobilisatie van geanalyseerde Eier kamers die een hoge contractiele activiteit in vloeibare media weergeven. De contractiele activiteit van de Eier kamers wordt voornamelijk veroorzaakt door het spier blad dat een lange reeks verbonden Eier kamers^5,6,7bedekt. Om een goede immobilisatie van jonge Eier kamers te bewerkstelligen, zijn er daarom verschillende benaderingen ontwikkeld, waarbij de Eier kamers met dekstroken^6,8,9 of flexibele dekens⁴worden bedekt^{, 10} of inbedden in een laag smeltpunt, agarose^3,11. Deze benaderingen zijn populair omdat ze ook de beeldvorming van een groter visueel vlak mogelijk maken door de subtiele afvlakking van het omtrek oppervlak van de Eier kamers.

Onlangs is echter aangetoond dat jonge Eier kamers (fase 1-8) rond hun anterieure-posterieure as⁶ draaien en dat deze weefsel beweging wordt aangedreven door een fijn actomyosine-netwerk dicht bij het omtrek oppervlak van deze jonge Eier kamers ¹². Daarom kan kunstmatige verandering van het cellulaire oppervlak veroorzaakt door een subtiele afvlakking van dit weefsel een negatieve invloed hebben op het gedrag van de kracht-genererende actomyosine machines. Het contrapunt is dat als het weefsel van de Eier kamer niet afgevlakt is, microscopische beeldvorming van eiwitten op het omtrek oppervlak van de Eier kamers nog beperkter wordt door de verminderde omvang van het acquisitie vlak.

Daarom hebben we protocollen van Prasad et al.⁹ en het lab van Celeste berg^4,10 gecombineerd en verder aangepast zodat er geen afdekraam/flexibele deken/agarose wordt gebruikt in de ontwikkelde methode. Drosophila Eier kamers zijn vrij gekweekt in media en het protocol hier gepresenteerd geldt alleen omgekeerde microscopie. Het protocol bestaat uit twee delen. Het eerste deel is gericht op de analyse van actomyosine signalen op de lokale cellulaire schaal (tot 15 cellen) binnen de Eier kamers. In het tweede deel richten we ons op het overwinnen van de beperkingen in verband met een klein acquisitie vliegtuig veroorzaakt door het gratis kweken van eier kamers. In dit verband hebben we een nieuwe, op Fiji gebaseerde computationele methode ontwikkeld met een semi-interactieve grafische gebruikersinterface die selectief gedefinieerde lagen van een omtrek weefseloppervlak extraheert en ontvouwt. Dit wordt gevolgd door een protocol dat beschrijft hoe te analyseren actomyosine op de weefsel schaal (dat wil zeggen, > 50 cellen). Aangezien de selectieve extractie van een gedefinieerde dunne laag gebogen epitheelweefsel niet gemakkelijk mogelijk was met behulp van een klassieke z-stack projectie (Figuur 1), dient deze gebruiksvriendelijke methode als een belangrijke voorwaarde om de gedrag van een dun (< 1 μm) actomyosine-netwerk op de weefsel schaal in Drosophila Eier kamers.

Om het protocol te faciliteren, bieden we ook voorbeeld time-lapse movies (Tlm's) en voorbeeldbestanden van fluorescently gelabeld nonmuscle conventioneel myosin II-gedrag (Zie aanvullend bestand 3). Myosin II is een motor proteïne en vertegenwoordigt het actieve contractisch deel van de actomyosine machines. Om myosin II te kunnen afbeelden, gebruiken we Drosophila transgene lijnen die een gemodificeerde regelgevende licht keten van myosin II bevatten, genaamd mrlc:: GFP (Zie tabel met materialen voor details)^12,13. Om celmembranen te visualiseren, is het protocol gebaseerd op commerciële kleurstoffen (Zie tabel met materialen). Dit protocol is niet alleen geschikt voor de analyse van kleine subcellulaire mrlc:: GFP signalen¹² maar ook voor elke vergelijkbare grootte subcellulaire deeltjes rond ± 300 μM, zoals die waargenomen met Life-Act:: GFP^12,14.

Hoewel beide protocollen worden gepresenteerd met behulp van in vitro gekweekte Drosophila Eier kamers, de overname van actomyosine signalen kan ook worden uitgevoerd met behulp van andere weefsels op de optimalisatie van de kweekmedia en afhankelijk van de beschikbaarheid van ofwel fluorescently gelabelde eiwitten met overeenkomstige commerciële kleurstoffen of, bijvoorbeeld, mRNA-micro injecties om voorbijgaande genexpressie profielen te verkrijgen. Evenzo kan het op Fiji gebaseerde protocol voor de extractie van een dunne laag van een omtrek oppervlak meer in het algemeen worden toegepast op ellipsoïde en orgel achtige weefsels.

Protocol

Opmerking: Het volgende protocol bevat instructies voor het analyseren van actomyosine op de lokale cellulaire en de weefsel schaal in Drosophila Eier kamers. De lokale aanpak stelt gebruikers in staat om gedetailleerd actomyosine gedrag te analyseren in maximaal 15 cellen per Eier kamer en vereist de overname van TLMs voor een korte periode (5 – 10 min) met behulp van high-speed imaging en een omgekeerde confocale Microscoop. Daarentegen, de weefsel schaal biedt gebruikers actomyosine informatie in 50 – 100 cellen en vereist de overname van TLMs voor een lange periode van tijd (≥ 30 min) met behulp van lage-snelheid beeldvorming en een omgekeerde draaiende schijf Microscoop (Zie Figuur 2 en Aanbevolen parameters op elke schaal in tabel 1). De beslissing op welke schaal om actomyosine signalen te analyseren is volledig afhankelijk van de wetenschappelijke vraag van de gebruiker. Begeleid test Tlm's moeten helpen om deze beslissing te maken.

1. lokale cellulaire schaal (LCS)

Opmerking: Om te ontleden en beeld in vitro gekweekte Drosophila Eier kamers, volg het protocol beschreven in aanvullende bestand 1. Als u wilt analyseren verworven Tlm's, gaat u verder met het volgende protocol. In het aanvullende bestand 3vindt u koppelingen naar de bijbehorende testbestanden van tlm's.

1. Gegevensverwerking van Tlm's op de lokale cellulaire schaal (LCS)
   1. Bleken correctie van Tlm's om te compenseren voor intensiteit verval van fluorescerende etiketten
      1. Zorg ervoor dat een up-to-date Fiji-toepassing is geïnstalleerd op de computer die wordt gebruikt door de volgende instructies: Fiji > een TLM openen (bijv. TestMovie1. TIF uit het aanvullende bestand 3).
      2. Splits de kleurkanalen door te klikken op afbeelding > kleur > gesplitste kanalen.
      3. Voer een Bleach-correctie uit op beide kanalen met behulp van beeld > pas > bleekmiddel correctie > eenvoudige verhouding > achtergrond intensiteit 0,0.
         Opmerking: Als er onbevredigende resultaten worden verkregen, ontdek dan welke correctiemethoden in deze plugin het beste passen (gebruik bijvoorbeeld histogram matching in plaats van een eenvoudige verhouding).
   2. Celsegmentatie voor het genereren van een celmasker voor Tlm's
      1. Als Fiji nog niet is geopend, opent u het opnieuw (en controleert u of het up-to-date is) na Help > Update > wijzigingen toepassen > OK.
      2. Als dit nog niet is gebeurd, downloadt u de macro Tissuecellsegmentmovie. IJM (van http://adm.irbbarcelona.org/MATLAB/TissueCellSegmentMovie.IJM). Sleep en zet dit script neer in Fiji.
      3. Open het door Bleach gecorrigeerde bestand TLM. TIFF (zie punt 1.1.1). Splits de kanalen van het Bleach-gecorrigeerde bestand met behulp van afbeelding > kleur > gesplitste kanalen.
      4. Voer het geüploade script uit op het actieve celmembraan kanaal van de geselecteerde TLM door op het pictogram uitvoeren in het geopende script te drukken. Stel de Gaussiaanse vervaging in op 2,500 en de gevoeligheid van de celdetectie op -1 en klik op OK. Om een mooi celmasker te krijgen, verander deze parameters hierboven niet. Stel de geschatte ruis tolerantie in tussen 10 – 20 voor Tlm's die zijn aangeschaft met de 63x-doelstelling en klik op OK.
         Opmerking: Voor andere doelstellingen kunnen verschillende parameters nodig zijn. De reiniger de achtergrond in een TLM, de lagere geschatte geluids tolerantie is vereist.
      5. Een gegenereerde celmasker verschijnt in de geanalyseerde TLM en ook in een nieuw venster genaamd Particlestack (G), en bovendien, een klein venster genaamd actie vereist verschijnt. Van het celmasker op de TLM, focus alleen op cellen in het midden van de TLM en selecteer die die volledige en goed gedefinieerde contouren kunnen bieden in de TLM.
      6. Als geselecteerde cellen kunstmatige/extra celconto uren bevatten, gebruikt u het venster samenvoegen met de naam actie vereist in de TLM. Voor de laatste, volg de instructies in het venster.
         Opmerking: Zorg ervoor dat celcontouren goed gedefinieerd zijn en overeenkomen met echte celmembranen in een TLM, aangezien elke onnauwkeurigheid van invloed kan zijn op latere analyses. Extra tweaks en wijzigingen, zoals het verwijderen van ongewenste cellen, kunnen later worden gedaan met behulp van de tool Surface Manager (beschreven in sectie 1.1.3).
      7. Wanneer de geselecteerde cellen in het centrum mooi overeenkomen met de echte celmembranen, bewaar ParticleStack als een. TIFF-bestand na het bestand ≫ Opslaan als > TIFF.
   3. Het gegenereerde celmasker wordt geladen in Surface Manager
      1. Installeer Surface Manager plugin¹⁵ in de gebruikte Fiji Setup. Volg de instructies van Viktorinova et al.¹⁶.
      2. Open Surface Manager met Plug-ins > segmentatie ≫ Surface Manager (3D).
         Opmerking: Het venster Surface Manager bevat verschillende Actieknoppen aan de rechterkant en een leeg venster aan de linkerkant. Om alle actieknoppen te zien, kan het nodig zijn om het venster in de hoogte/breedte te strekken. Houd er rekening mee dat tijdframes worden weergegeven als z-segmenten.
      3. Open het bijbehorende bestand ParticleStack. TIFF in Surface Manager door te klikken op bestand > openen en selecteer de afbeelding die u wilt openen (bijvoorbeeld ParticlesStack1. TIF).
      4. Klik in Surface Manager op de knop overzichts afbeelding lezen en stel de Jacquard-index in op 60%.
         Opmerking: Het laden van het bestand ParticlesStack1. TIF kan enkele minuten duren, afhankelijk van de verwerkingskracht van de computer.
      5. Eenmaal geladen, zal elke cel worden toegewezen met een S-nummer en worden weergegeven in het linker gedeelte van het venster Surface Manager.
         Opmerking: Als u contouren en celnamen voor alle cellen wilt weergeven, vinkt u de selectievakjes alle weer geven en labels weer geven aan onder aan het venster Surface Manager. Het wordt aanbevolen om deze functie te gebruiken zodra de celnummers zijn gecontroleerd op hun juistheid.
      6. Klik op het eerste S-nummer; de geïmporteerde celomtrek van ParticlesStack1. TIF verschijnt op de TLM. Controleer elk geïmporteerd S-nummer voor de kwaliteit van de celcontour gedurende de TLM en verwijder ongewenste cellen die onjuiste celconto uren weergeven. Om dit te doen, Markeer de celomtrek en klik op de knop verwijderen.
         Opmerking: Het is ook mogelijk om te corrigeren voor onnauwkeurige celcontouren en nieuwe celcontouren toe te voegen. Dit wordt beschreven in de sectie discussie.
      7. Sla alle gecorrigeerde cellen op als een RoiSet. zip-bestand door op de knop opslaan op schijf te drukken.
         Opmerking: Als de sessie moet worden onderbroken, is het mogelijk om het RoiSet-bestand later in Surface Manager te laden: Open een TLM in Fiji (bestand > geopend) en selecteer een TLM. Open Surface Manager via Plug-ins > segmentatie ≫ Surface Manager (3D). Laad het bijbehorende RoiSet. zip-bestand door op de knop laden van schijf te klikken en het juiste roiset. zip-bestand te kiezen. Controleer of de geladen celmaskers overeenkomen met de geladen TLM.
   4. Correctie voor weefsel drift in Tlm's
      Opmerking: Tijdens de acquisitie tijd van TLMs kunnen drift effecten worden waargenomen als gevolg van epitheliale rotatie of een ongewenste beweging. In beide gevallen raden we aan om te corrigeren voor elke drift om de handmatige actomyosine-analyse later te vereenvoudigen. Drift correctie is alleen nodig voor de handmatige actomyosine-analyse. Deze zelfstudie vereist up-to-date Fiji-software met de MultiStackReg plugin (https://git.mpi-cbg.de/scicomp/viktorinova_et_al_actomyosin_dynamics/blob/master/Software/Software_installation.md#multistackreg) geïnstalleerd.
      1. Open de bleekmiddel-gecorrigeerde TLM in Fiji via bestand > Open en selecteer de Bleach-gecorrigeerde bestand gemaakt met behulp van de bovengenoemde tutorial.
      2. Splits de kanalen en selecteer degene die de celmembranen identificeert via afbeelding > kleur > gesplitste kanalen.
      3. Gebruik het volgende protocol wanneer de celcontouren niet zichtbaar vloeiend zijn: proces > filters ≫ Gaussiaanse vervaging. Stel het in op ~ 1 – 2 voor een 63x doelstelling en klik op OK en vervolgens op Ja. Klik op proces > binaire > converteren naar masker met behulp van de standaardinstellingen; Klik vervolgens op OK.
      4. Laad de MultiStackReg plugin volgende Plugins > registratie > multistackreg.
      5. Zorg ervoor dat stack 1 is ingesteld op het celmembraan kanaal, actie 1 is ingesteld op uitlijnen en transformatie is ingesteld op vertaling. Vink het selectievakje transformatiebestand opslaan aan en klik op OK.
      6. Open de geselecteerde TLM, de plug-in MultiStackReg en het opgeslagen transformatiebestand met behulp van het bestand > openen en selecteer een TLM. Splits de kleurkanalen met behulp van afbeelding > kleur > gesplitste kanalen.
      7. De invoegtoepassing MultiStackReg laden door te klikken op invoegtoepassingen > registratie > multistackreg. Selecteer transformatiebestand laden als actie 1.
      8. Laat transformatie als stijve lichaam en klik op OK. Selecteer het eerder opgeslagen transformatiebestand en klik nogmaals op OK .
      9. Voeg de beeld kanalen samen en sla de geregistreerde TLM op als een. TIFF-bestand na afbeelding > kleur > kanalen samenvoegen. Sla het bestand op door te klikken op bestand ≫ Opslaan als > TIFF.
         Opmerking: Er zijn alternatieve manieren om te corrigeren voor een weefsel drift in Fiji, namelijk via Plugins > registratie ≫ STACKREG/juiste 3D Drift.
2. Analyse van actomyosine pulsen in oppervlak Manager bij LCS
   Opmerking: Deze protocol stap stelt wetenschappers in staat om te bepalen of actomyosine pulsen aanwezig zijn in het geanalyseerde weefsel en om te begrijpen van het gedetailleerde gedrag, alsmede de directionaliteit van actomyosine signalen.
   1. Open Fiji en zorg ervoor dat een TLM en het bijbehorende celmasker is geopend in Surface Manager.
      Opmerking: Zorg ervoor dat Fiji is geïnstalleerd en up-to-date en de Surface Manager-plugin is geïnstalleerd (stap 1.1.3.1).
   2. Open een TLM met bestand > geopend en selecteer een TLM te openen (bijvoorbeeld TestMovie1_bleach. TIF). Laad de Surface Manager-plug-in via Plug-ins > segmentatie ≫ Surface Manager (3D). Laad het opgeslagen celmasker dat in de tutorial is gemaakt (bijv. ParticlesStack1. TIF) via het bestand > Open en selecteer een Celmasker (bijvoorbeeld ParticlesStack1. TIF). Laad de corresponderende regio van belang (ROI, bijvoorbeeld TestMovie1_RoiSet. zip). Zie Figuur 3a.
   3. Overschakelen naar het kanaal van belang in de geselecteerde TLM.
      Opmerking: Volg de kleurcode die is aangegeven rond de TLM om de kanalen te onderscheiden.
   4. Klik in Surface Manager op de knop Statistieken om het venster te verkrijgen met de naam gemiddelde grijze waarde segment per segment (Figuur 3b). Merk op dat de gemiddelde/mediane intensiteitswaarden van actomyosine-signalen in een bepaald geanalyseerd kanaal binnen de gedefinieerde celcontouren na verloop van tijd worden weergegeven, evenals andere parameters die verband houden met het celgebied en de celvorm.
      Opmerking: De intensiteitswaarden zijn in arbitraty-eenheden (A.U.); het celgebied is in pixels en moet worden omgezet in vierkante micrometers.
   5. Sla de verkregen waarden op als een spreadsheetbestand. Klik op het statistiekvenster, bestand ≫ Opslaan als.
      Opmerking: Het is mogelijk om verkregen statistische waarden later als volgt te controleren: Open het bleekmiddel-gecorrigeerde TLM in Fiji en open Surface Manager. Laad de corresponderende RoiSet. zip in de TLM door op de knop laden van schijf te drukken en het bestand te openen. Het opgeslagen masker met celcontouren wordt geüpload en de namen van de cellen worden weergegeven in het linker Surface Manager-venster. Klik op de knop Statistieken voor statistische waarden.
3. Handmatige analyse van afzonderlijke subcellulaire actomyosine-signalen bij LCS
   Opmerking: Dit protocol vereist de meeste concentratie en is tijdrovend. In het algemeen, een verworven TLM kan comfortabel worden geanalyseerd binnen 1 dag. Dit omvat geen tijd voor vlieg voorbereiding voor hun dissectie, de dissectie zelf, en Image Acquisition.
   1. Open een geselecteerde, bleekmiddel-gecorrigeerde en geregistreerde (drift-gecorrigeerde) TLM in een up-to-date Fiji-applicatie. Gebruik een bleekmiddel gecorrigeerd en drift-gecorrigeerde TLM (bijvoorbeeld TestMovie1_bleach_reg. TIF) als een testvoorbeeld.
   2. Pas de helderheid en het contrast aan om de individuele actomyosine-signalen te zien met behulp van beeld > pas > helderheid/contrast aan .
   3. De Tlm's in dezelfde richting uitlijnen ten opzichte van de weefsel-/lichaamsas. In het geval van eier kamers, lijn de voorste zijde van de Eier kamers altijd links van de afbeelding/subfilm/TLM vóór de analyse.
   4. Verdeel de geselecteerde film in korte subfilms van 30 s en elk tijdproject. Sla niet-tijd geprojecteerde en tijdgeprojecteerde subfilms op met bijbehorende namen. Bewaar de oorspronkelijke bron.
      Opmerking: Subfilms kunnen worden gemaakt van originele Tlm's door eerst ongewenste frames te verwijderen via Image > stacks > slice Remover. Definieer de segmenten die moeten worden verwijderd en stel een increment in. Transformeer naar RGB voordat u de slice Remover gebruikt wanneer increment = 1. Tot tijd-project een subfilm van 30 s, klikt u op afbeelding > stapels > Z-project > maximale intensiteit voor de gedefinieerde frames (segmenten) en klik vervolgens op OK. Sla elke seconde 30 s submovie over om te voorkomen dat actomyosine-signalen 2x in twee daaropvolgende 30 s-subfilms worden geteld.
   5. Plaats een tijdgeprojecteerde afbeelding naast de bijbehorende subfilm van 30 s (Afbeelding 4a, B). Identificeer de signaal lijn op de tijd geprojecteerde submovie. Identificeer de richting van de actomyosine-signaal beweging (0 °-360 °) langs deze lijn in de originele subfilm door de subfilm handmatig af te spelen. Gebruik het gereedschap hoek (in de Fiji-balk) om handmatig de richting van de signaal verplaatsing te meten ten opzichte van de gedefinieerde weefsel-as of een soortgelijk beschikbaar gereedschap.
      Opmerking: Fiji werkt alleen op een schaal van 0 °-180 ° (figuur 4c) en een herberekening van de verkregen waarden op een schaal van 0 ° – 360 ° is vereist. Een signaal lijn komt overeen met het traject van één actomyosine-signaal beweging na verloop van tijd.
   6. Om duplicatie in de analyse van actomyosine-signalen te voorkomen, markeert u de geanalyseerde signaallijnen binnen cellen in de tijd geprojecteerde subfilm (figuur 4b, D).
   7. Analyseer alle geselecteerde cellen in de subfilm van 30 s en sla de verkregen hoeken op.
      Opmerking: Analyseer alleen subcellulaire cytoplasmische actomyosine signalen in cellen met goed gedefinieerde celconto uren in een TLM. Uitsluiten van individuele cellen met minder dan 15 – 20 gedetecteerde signalen in de hele TLM. Negeer actomyosine signalen die over cellen verplaatsen vanwege hun onbekende oorsprong. Een voorbeeld van signaal tellingen voor één geanalyseerde cel in de 30 s subfilm wordt getoond in figuur 4D.
   8. Ga door totdat alle 30 s-lange subfilms van één TLM worden geanalyseerd en bewaar alle gemeten hoeken van actomyosine-signalen van één TLM in een spreadsheetbestand.
   9. Som van alle gemeten hoeken over het relevante aantal Tlm's (afhankelijk van het experiment). Plot het percentage van de richting van geanalyseerde actomyosine signalen, bijvoorbeeld, als een roos diagram met een bereik van 0 ° tot 360 ° met een voorkeurs software.
      Opmerking: Om statistisch significante resultaten te behalen, worden vijf tot tien onafhankelijke Eier kamers van elk stadium van de Eier kamer aanbevolen om te worden geanalyseerd.

2. weefsel schaal

Opmerking: Om te ontleden en beeld in vitro gekweekte Drosophila Eier kamers, volg het protocol in aanvullend bestand 2. Als u wilt analyseren verworven Tlm's, gaat u verder met het volgende protocol hieronder. Begeleid test dossiers van Tlm's worden geplaatst in het aanvullende bestand 3.

1. Selectieve oppervlakte extractie van gebogen epitheel weefsels
   Opmerking:Dit protocol stelt gebruikers in staat om selectief een dunne laag van actomyosine in een gebogen epitheelweefsel te extraheren na verloop van tijd. Deze protocol stap is gebruiksvriendelijk en gebaseerd op een intuïtieve grafische interface. Het is mogelijk om comfortabel te analyseren (oppervlak te extraheren) verschillende Tlm's. gebruik TestMovie2. czi (van deAanvullend bestand 3) als voorbeeld van een test-TLM.
   1. Open een up-to-date Fiji-toepassing (fiji > Help ≫ bijwerken > wijzigingen toepassen > OK).
   2. Zorg ervoor dat de Ellipsoid Surface projection plugin¹⁵ is geïnstalleerd. Volg Viktorinova et al. ¹⁶.
   3. Open een TLM en exporteer het als een XML/HDF5-bestand door te klikken op Plugins ≫ bigdataviewer > huidige afbeelding exporteren als XML/hdf5-bestand.
      Opmerking: Het is vereist voor het definiëren van een exportpad. De besparing zelf kan enkele minuten duren en is afhankelijk van de lengte van de TLM.
   4. Open het geëxporteerde bestand in het ellipsoïde oppervlak projectie door te klikken op Plugins ≫ bigdataviewer ≫ ellipsoid oppervlak projectie > Selecteer XML-bestand.
      Opmerking: Een nieuw venster met Sagittaal uitzicht op de Eier kamer en een dialoog om de gebruiker door de verwerking te begeleiden zal verschijnen. Meer informatie over navigeren in de segment weergave vindt u op https://imagej.net/BigDataViewer.
   5. Het dialoogvenster met de naam eierstokken projectie heeft verschillende tabs. Definieer in het eerste dialoogvenster met de naam omsluitend kader de x-en y-randen van een Eier kamer in de TLM samen met de z-breedte van het begrenzingsvak (d.w.z. de diepte van een z-stack/Eier kamer) en druk op set (figuur 5a).
   6. Als u randen wilt definiëren, sleept u knoppen naast x, y en z of definieert u de getalcoördinaten in de vakken x, y en z. Zorg ervoor dat de grenzen royaal genoeg zijn om het deel van de Eier kamer van belang in de oppervlakte extractie te krijgen. De geselecteerde delen van de Eier kamer zijn roze gemarkeerd.
   7. Schakel over naar het tabblad met de naam Find-blobs in de projectie van het venster eierstokken. Definieer de Sigma en de minimale piekwaarde; Druk vervolgens op Compute om te identificeren van de actomyosine-signalen (afbeelding 5b), die wordt weergegeven als groene blobs. Probeer deze stap opnieuw met verschillende parameters totdat er voldoende punten (rond 100) zijn gevonden.
      Opmerking: Sigma 1 \ u20123 met minimale piekwaarde 20 \ u2012100 werkt het beste om actomyosine signalen van stage-6 tot-8 Eier kamers te identificeren. Het identificeren van actomyosine-signalen is een cruciale stap en is afhankelijk van de signaalkwaliteit en de grootte ervan. Het is belangrijk om te bevestigen van de juiste grootte van de bestaande blobs. Geen zichtbare groene vlekken/blobs in de afbeelding betekent dat de volgende stap niet zal werken. Blader door de geselecteerde z-vlakken om blobs te zien.
   8. Als u de ellipsoïde wilt ontwerpen, gaat u verder met het tabblad ' fit ellipsoïde'. Stel willekeurige samples in op 10.000, buiten/binnen cut-off afstand tot 1 \ u201210, en klik vervolgens op Compute (Figure 5c).
      Opmerking: Hoe lager de cut-off afstand, hoe preciezer de gewenste ellipsoïde zal zijn. Hierna wordt het tabblad projectie automatisch geopend en wordt de definitie van de oppervlakte extractie toegestaan. De instellingen moeten worden geoptimaliseerd.
   9. Ga verder met het tabblad projectie (afbeelding 5d). Stel een minimale en maximale projectie afstand in (d.w.z. de breedte van het gewenste ellipsoïde). Het is vereist om een minimale en maximale projectie afstand in te stellen, zodat de roze gedefinieerde ellipsoïde regio de gehele buitenlaag van de Eier kamer omvat. Definieer de segment afstand (1 wordt aanbevolen).
      Opmerking: Voorbeelden van een onjuiste en optimale ellipsoïde pasvorm die resulteert in onjuiste en optimale projectie parameters worden weergegeven in Figuur 6a, C. De dunne omtrek van de rente kan later worden gedefinieerd. Zorg ervoor dat de roze regio van de ellipsoïde met de gedefinieerde breedte op de Eier kamer zichtbaar is voordat u op Compute drukt. Het is belangrijk dat de gewenste ellipsoïde (roze enkele lijn) mooi past bij het ellipsoïde oppervlak van een Eier kamer om de beste resultaten te behalen. Als de ellipsoïde fit niet goed is, rangschikt u verschillende instellingen tot de gewenste oppervlakte extractie is verkregen.
      1. Stel een uitvoer breedte (≥ 800) en de hoogte (≥ 400) van de ellipsoïde in. Instellen vanaf welk tijdstip op welk tijdstip de oppervlakte extractie moet worden gemaakt (d.w.z. de lengte van de TLM-extractie definiëren). Kies een sferische of een cilindrische projectie. Flip Z en uitlijnen Y indien nodig.
      2. Druk op Compute om een oppervlakte extractie te verkrijgen voor beide kanalen in nieuwe Vensters met de naam Image. Pas de helderheid en het contrast van de verkregen beeld Vensters aan om de geprojecteerde actomyosine-signalen te kunnen zien, door te klikken op afbeelding ≫ > helderheid/contrast aan te passen .
         Opmerking: Een voorbeeld vergelijking van een projectie als gevolg van een onjuiste en optimale ellipsoïde pasvorm wordt weergegeven in Figuur 6b, D.
   10. Als de oppervlakte extractie er goed uitziet, slaat u de afbeeldingen (beide kanalen afzonderlijk) op als. TIFF. Sla het logboekbestand ook op voor toekomstig gebruik van de manier waarop het oppervlak van deze specifieke Eier kamer is geëxtraheerd.
       Opmerking: Dit is met name belangrijk informatie als de geëxtraheerde dunne laag moet worden teruggegeven aan de oorspronkelijke uitgevouwen vorm (alleen voor ontwikkel ontwikkelaars).
   11. Voeg de kanalen samen met een voorkeurskleur code in Fiji.
       Opmerking: Indien nodig, project geselecteerde z-stack lagen met actomyosine signalen. De projectie van geselecteerde z-stack lagen is vereist wanneer de verwervings focus enigszins in de tijd verandert in een TLM. Voor de beste resultaten, project maximaal één tot twee z-stack lagen.
   12. Sla de resultaten op als. TIFF-bestanden.
       Opmerking: Representatieve voorbeelden van dunne lagen (selectieve basale en apicale oppervlakte) die het myosin II (MRLC:: GFP) signaal van de follikel epitheel van de controle en fat2 Mutante Eier kamers kunnen worden gevonden in Figuur 8.
2. Gegevensverwerking van een selectief geëxtraheerd weefseloppervlak
   1. Bleken-Corrigeer de Tlm's om het intensiteit verval van de fluorescerende etiketten te compenseren.
      1. Open Fiji. Open een TLM (bijvoorbeeld TestMovie2_extraction. TIF uit het aanvullende bestand 3) met behulp van bestand > geopend. Selecteer de afbeelding om deze te openen.
      2. Splits de kleurkanalen en converteer ze zo nodig naar 16-bits afbeeldingen door te klikken op afbeelding > kleur > gesplitste kanalen. Converteer de kanalen naar 16-bits afbeeldingen (van 32-bits afbeeldingen) met afbeelding > type > 16-bits.
      3. Voer een Bleach-correctie uit op beide kanalen met behulp van beeld > pas > bleekmiddel correctie > eenvoudige verhouding > achtergrond intensiteit 0,0.
         Opmerking: Als er onbevredigende resultaten worden verkregen, is het nodig om te onderzoeken welke correctiemethoden in deze plugin het beste passen (bijvoorbeeld, gebruik histogram matching in plaats van een eenvoudige verhouding).
      4. Voeg de kanalen van de twee door Bleach gecorrigeerde afbeeldingen samen door te klikken op afbeelding > kleur > kanalen samenvoegen. Sla de samengevoegde afbeelding op als een. TIFF-bestand door te klikken op bestand ≫ Opslaan als > TIFF.
         Opmerking: Pas zo nodig het contrast en de helderheid van de kanalen aan.
   2. Celsegmentatie voor het genereren van een celmasker voor Tlm's
      1. Als Fiji nog niet is geopend, opent u het opnieuw (en controleert u of het up-to-date is door te klikken op Help > Update > wijzigingen toepassen > OK).
      2. Als dit nog niet is gebeurd, downloadt u de macro TissueCellSegmentMovie. IJM (http://adm.irbbarcelona.org/matlab/TissueCellSegmentMovie.ijm).
      3. Sleep en zet dit script neer in Fiji. Open het door Bleach gecorrigeerde bestand (bijv. TestMovie2_bleach. TIF uit het aanvullende bestand 3, zie ook 2.2.1).
      4. Splits de kanalen van het door Bleach gecorrigeerde bestand door op afbeelding > kleur > gesplitste kanalente klikken. Pas het membraan kanaal aan om te zorgen voor duidelijke celconto uren door te klikken op afbeelding ≫ > helderheid/contrast aan te passen .
      5. Voer het geüploade script uit op het actieve celmembraan kanaal van de geselecteerde TLM door op het pictogram uitvoeren in het geopende script te drukken. Stel Gaussiaanse vervaging in op 1,500. Stel de gevoeligheid voor celdetectie in op-1 en klik op OK. Stel geschatte geluids tolerantie in op ~ 8 voor tlm's die zijn aangeschaft met de 40x-doelstelling en klik op OK.
         Opmerking: Om een mooi celmasker te krijgen, verander deze parameters hierboven niet. Voor andere doelstellingen kunnen verschillende parameters nodig zijn. De reiniger de achtergrond in een TLM, de lagere geschatte geluids tolerantie is vereist.
      6. Een gegenereerde celmasker verschijnt in de geanalyseerde TLM en ook in een nieuw venster genaamd Particlestack (G). Bovendien verschijnt een klein venster met de naam actie vereist . Van het celmasker op de TLM, focus alleen op cellen in het midden van de TLM en selecteer die die volledige en goed gedefinieerde contouren kunnen bieden in de TLM.
      7. Als geselecteerde cellen kunstmatige/extra celconto uren bevatten, gebruikt u het venster samenvoegen met de naam actie vereist in de TLM. Voor de laatste, volg de instructies in het venster.
         Opmerking: Zorg ervoor dat celcontouren goed gedefinieerd zijn en overeenkomen met echte celmembranen in een TLM, aangezien elke onnauwkeurigheid van invloed kan zijn op latere analyses. Extra tweaks en wijzigingen, zoals het verwijderen van ongewenste cellen, kunnen later worden gedaan met behulp van de Surface Manager tool (beschreven in de tutorial hieronder).
      8. Wanneer geselecteerde cellen in het midden mooi overeenkomen met de echte celmembranen, slaat u de ParticleStack op als een. TIFF-bestand na bestand ≫ Opslaan als > TIFF. Ga verder met het laden van het gegenereerde celmasker en de actomyosine-analyse in oppervlakte beheer zoals eerder uitgevoerd in de paragrafen 1.1.3 en 1,2 (ook gedetailleerd beschreven in de paragrafen 2.2.3 en 2,3).
   3. Het gegenereerde celmasker wordt geladen in Surface Manager
      1. Als de Surface Manager-invoegtoepassing al is geïnstalleerd in de Fiji-instellingen die worden gebruikt, gaat u verder met stap 2. Zo niet, volg Viktorinova et al.¹⁶. Voor ontwikkel ontwikkelaars, alleen de broncode is ook beschikbaar¹⁵.
      2. Open Surface Manager door te klikken op Plug-ins > segmentatie ≫ Surface Manager (3D).
         Opmerking: Het venster Surface Manager bevat verschillende Actieknoppen aan de rechterkant en een leeg venster aan de linkerkant. Om alle actieknoppen te zien, kan het nodig zijn om het venster in de hoogte/breedte te strekken. Houd er rekening mee dat tijdframes worden weergegeven als z-segmenten.
      3. Open het corresponderende bestand ParticleStack. TIF in Surface Manager via bestand > openen en selecteer de afbeelding die u wilt openen (bijvoorbeeld ParticleStack2. TIF uit het aanvullende bestand 3).
      4. Klik in Surface Manager op de knop overzichts afbeelding lezen en stel de Jacquard-index in op 60%.
         Opmerking: Het laden van een ParticleStack. TIF-bestand kan enkele minuten duren, afhankelijk van de kracht van de computer.
      5. Eenmaal geladen, zal elke cel worden toegewezen met een S-nummer en zal verschijnen in het linker deel van de Surface Manager venster (afbeelding 7A).
         Opmerking: Als u contouren en celnamen voor alle cellen wilt weergeven, vinkt u de selectievakjes alle weer geven en labels weer geven aan onder aan het venster Surface Manager. Het wordt aanbevolen om deze functie te gebruiken zodra de celnummers zijn gecontroleerd op hun juistheid.
      6. Klik op het eerste S-nummer; de geïmporteerde celomtrek van ParticleStack. TIF wordt weergegeven op de TLM. Controleer elk geïmporteerd S-nummer voor de kwaliteit van de celcontour gedurende de TLM en verwijder ongewenste cellen die onjuiste celconto uren weergeven. Om dit te doen, Markeer de celomtrek en klik op de knop verwijderen.
         Opmerking: Het is ook mogelijk om te corrigeren voor onnauwkeurige celcontouren en nieuwe celcontouren toe te voegen. Dit wordt beschreven in de sectie discussie.
      7. Sla alle gecorrigeerde cellen op als een RoiSet. zip-bestand door op de knop opslaan op schijf te drukken.
         Opmerking: Als de sessie moet worden onderbroken, is het mogelijk om het bestand RoiSet. zip later in Surface Manager te laden: Open een TLM in Fiji via bestand > openen en selecteer een TLM. Open Surface Manager als volgt: Plug-ins > segmentatie ≫ Surface Manager (3D). Laad de corresponderende RoiSet. zip door op de knop laden van schijf te klikken en het juiste roiset. zip-bestand te kiezen (bijv. TestMovie2_RoiSet. zip). Controleer of de geladen celmaskers overeenkomen met de geladen TLM.
3. Analyse van actomyosine pulsen in oppervlakte Manager
   Opmerking: Open Fiji en zorg ervoor dat een TLM en het bijbehorende celmasker is geopend in Surface Manager. Zorg ervoor dat Fiji is geïnstalleerd en up-to-date en de Surface Manager-invoegtoepassing (https://git.mpi-cbg.de/tomancaklab/surface_manager) is geïnstalleerd.
   1. Open een TLM met bestand > geopend en selecteer een TLM te openen (bijvoorbeeld TestMovie2_bleach. TIF). Laad de Surface Manager-plug-in via Plug-ins > segmentatie ≫ Surface Manager (3D). Laad het opgeslagen celmasker dat in de tutorial is gemaakt (bijv. ParticlesStack2. TIF) via het bestand > Open en selecteer een Celmasker (bijvoorbeeld ParticlesStack2. TIF). Laad de corresponderende ROI (bijv. TestMovie2_RoiSet. zip).
   2. Overschakelen naar het kanaal van belang in de geselecteerde TLM.
      Opmerking: Volg de kleurcode die is aangegeven rond de TLM om onderscheid te maken tussen de kanalen.
   3. Klik in Surface Manager op de knop Statistieken om het venster te verkrijgen met de naam gemiddelde grijze waarde segment per segment (afbeelding 7b). Merk op dat de gemiddelde/mediane intensiteitswaarden van actomyosine-signalen in een bepaald geanalyseerd kanaal binnen de gedefinieerde celcontouren na verloop van tijd worden weergegeven, evenals andere parameters die verband houden met het celgebied en de celvorm.
      Opmerking: De intensiteitswaarden zijn in A.U.; het celgebied is in pixels en moet worden omgezet in vierkante micrometers.
   4. De verkregen waarden opslaan als een spreadsheetbestand: Klik op het statistiekvenster, bestand ≫ Opslaan als.
      Opmerking: Het is mogelijk om de verkregen statistische waarden later te controleren, als volgt. Open het bleekmiddel-gecorrigeerde TLM in Fiji. Open Surface Manager. Laad de corresponderende RoiSet. zip in de TLM door op de knop laden van schijf te drukken en het bestand te openen. Het opgeslagen masker met celcontouren wordt geüpload en de namen van de cellen worden weergegeven in het linker Surface Manager-venster. Klik op de knop Statistieken voor statistische waarden.
      Opmerking: Met betrekking tot een Handmatige analyse van individuele subcellulaire actomyosine signalen, het is niet mogelijk om het uitvoeren van een handmatige analyse van subcellulaire actomyosine signalen op de weefsel schaal. Optimalisatie is vereist voor de analyse van individuele actomyosine-signalen op de semi-weefsel schaal, zoals aangegeven in de sectie discussie.

Resultaten

Dit protocol stelt wetenschappers in staat om het gedrag van actomyosine netwerken in epitheliale weefsels te onderzoeken. Dit is alleen mogelijk wanneer een gedetailleerde analyse van actomyosine gedrag op de lokale cellulaire schaal (een paar cellen) wordt gecombineerd met een soortgelijke analyse op de weefsel schaal (veel cellen). Epitheliale weefsels zijn echter vaak gebogen en de extractie van een dun laagje van deze weefsels was voorheen niet gemakkelijk mogelijk, zoals weergegeven...

Discussie

Kritieke stappen en probleemoplossing voor de dissectie en het kweken van eier kamers

Als er te veel vliegen in een kleine injectieflacon worden geplaatst, kan het vlieg voedsel modderig worden na 2 – 3 dagen als gevolg van grote hoeveelheden voeden larven en volwassen vliegen gevangen in het vlieg voedsel. In een dergelijk geval, Flip de rest van deze vliegt in een nieuwe flacon met vers voedsel en krimpen hun aantal. In het bijzonder, uitsluiten vrouwtjes die vastzaten in he...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Schneider Medium	Gibco	21720-024	[+]-Glutamine
Penicillin/Streptomycin	Gibco	15140-122	[+] 10.000 Units/mL Penicillin [+] 10.000 µg/mL Streptomycin
Fetal Bovine Serum	Sigma	F135	Heat inactivated
Insulin Solution Human	Sigma	I9278
50 mL Falcon tubes	Eppendorf		sterile
Millex-GV filter	Millipore	SLGV033NS	33 mm
Glass Bottom Microwell Dishes	MatTek Corporation	P35G-1.5-14-C	35 mm Petri dish, 14 mm Microwell, No. 1.5 cover glass
Forceps	A. Dumont & Fils		#55
CellMask Deep Red (cell membrane dye)	Invitrogen	C10046
FM4-64 (cell membrane dye)	ThermoFisher/Invitrogen	T13320
Depression dissection slide	Fisher Scientific	12-560B
Microscopische apparatuur
Steromicroscope	bijv. Zeiss		Stemi SV 6
Omgekeerde confocale microscoop	bijv. Zeiss/Olympus
Spinning disc microscoop	bijv. Zeiss/Andor
Microscopisch glas/dekglas	bijv. Thermo Scientific/Menzel Glas
Cactus gereedschap
Wironit naaldhouder	Hammacher	9160020
Cactus stekel	Echinocactus grusonii/vatcactus
Drosophila stammen gebruikt in het manuscript
AX3/AX3; sqh-MRLC::GFP/sqh-MRLC::GFP			Zie Rauzi et al.: Planar polarized actomyosin contractile flows control epithelial junction remodeling. Nature 2010, Vol. 468, pag. 1110-1115.
AX3/AX3; sqh-MRLC::GFP/sqh-MRLC::GFP; fat258D/fat2103C			Zie Viktorinova et al.: Epithelial rotation is preceded by planar symmetry breaking of actomyosin and protects epithelial tissue from cell deformations. PLoS Genetics 2017, Vol. 13, Issue 11, pag. e1007107.