Hier presenteren we een protocol waarbij genetisch gekoppelde spectraal verschillende photoactivatable en fluorescente proteïnen. Deze TL proteïne Chimaera toestaan kwantificering van de PA-FP-breuk thats photoactivated als tl, dat wil zeggen, de efficiëntie van de photoactivation. Het protocol blijkt dat verschillende vervoerswijzen photoactivation verschillende photoactivation efficiëntieverbeteringen opleveren.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Hoe te kwantificeren van de Fractie van Photoactivated fluorescerende eiwitten in Bulk en in levende cellen
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Photoactivatable en -converteerbare fluorescente proteïnen (PA-FPs) hebben in fluorescentie live-cel microscopie is gebruikt voor het analyseren van de dynamiek van cellen en eiwit ensembles. Tot nu toe geen methode beschikbaar te kwantificeren in bulk geweest en in levende cellen hoeveel van de PA-FPs uitgedrukt zijn photoactivated te lichten.
Hier presenteren we een protocol met betrekking tot interne heersers, dat wil zeggen, genetisch waaraan spectraal onderscheiden (photoactivatable) fluorescente proteïnen, ratiometrically kwantificeren van de Fractie van alle PA-FPs, uitgedrukt in een cel die zijn ingeschakeld als TL. Met behulp van dit protocol, laten we zien dat de verschillende vervoerswijzen photoactivation verschillende photoactivation efficiëntie opgeleverd. Korte high-power photoactivation met een confocale laser scanning microscoop (CLSM) resulteerde in tot viermaal lagere photoactivation efficiëntie dan honderden low-level vorderingen toegepast door CLSM of een korte puls toegepast door widefield verlichting. Terwijl het protocol heeft hier zijn geïllustreerd voor (PA-) GFP en Cherry (PA-), kan het in principe worden toegepast op elk spectraal verschillende photoactivatable of photoconvertible TL proteïne paar en een experimentele opstelling.
Inleiding
In 2002, werden de eerste breed toepasbare photoactivatable (PA-GFP1) en photoconvertible (Kaede2) fluorescente proteïnen beschreven. Deze optische markeerstift fluorescente proteïnen wijzigen hun spectrale eigenschappen bij bestraling met UV-licht, dat wil zeggen, ze helder (photoactivatable fluorescerende eiwitten, dat wil zeggen, PA-FPs) of hun kleur (photoconvertible wijzigen FPs). Tot op heden, zijn verschillende omkeerbaar en onomkeerbare photoactivatable en photoconvertible fluorescerende eiwitten ontwikkelde3,4. In ensemble of bulk studi....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
1. plasmide bouw
- Twee kleuren fusion sondes te genereren. Gebruik een vector van zoogdiercellen expressie (Zie Tabel van materialen) in welke mCherry112 en13 van de PA-mCherry1 zijn ingevoegd met de beperking sites AgeI en BsrGI.
- Aangepaste oligo-nucleotiden aan het versterken van de monomere varianten van eGFP en PA-eGFP met de A206K mutatie, dat wil zeggen, mEGFP en PA-mEGFP14 zonder een stop codon als een fragment SalI-BamHI bestellen Gebruik van de primer N-terminal 5'-AAT TAA CAG TCG ACG ATG GTG AGC AAG GGC GAG G 3' en ....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Het hier gepresenteerde protocol toont de kwantificering van de ratiometric van de Fractie van fluorescente proteïnen toe die photoactivated als tl (Figuur 1). Deze fractie verschilt afhankelijk van de wijze van photoactivation.
Een typisch resultaat met behulp van korte tijd high-power photoactivation met een confocale laser scanning microscoop (CLSM) wordt weergegeven in Figuu.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Tot nu toe bestond geen methode om te bepalen in de bulk van de Fractie van de PA-FPs uitgedrukt in levende cellen die photoactivated als tl. Het gepresenteerde protocol kan worden gebruikt voor elk paar spectraal verschillende fluorescente proteïne. Terwijl geïllustreerd hier voor de onomkeerbare PA-FPs PA-GFP en PA-Cherry, is deze aanpak in principe van toepassing op photoconvertible eiwitten zo goed. De spectraal verschillende fluorescente proteïne, echter moet worden geselecteerd zorgvuldig om te minimaliseren van sp.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben niets te onthullen.
Dankbetuigingen
Wij wil het Dorigo laboratorium en de neurowetenschappen Imaging Service aan Stanford University School of Medicine bedanken voor het verstrekken van apparatuur en ruimte voor dit project.
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| pEGFP-N1 mammaalse celexpressievector | Clontech | ||
| DMEM zonder fenol rood | Thermo Fisher Scientific | 11054020 | |
| Trypsine zonder fenol rood | Thermo Fisher Scientific | 15400054 | |
| L-Glutamine (200 mM) | Thermo Fisher Scientific | 25030081 | |
| HEPES | Thermo Fisher Scientific | 15630080 | |
| LabTek 8-kamer kamers #1.0 | Thermo Fisher Scientific | 12565470 | |
| Fugene 6 | Promega | E2691 |
Referenties
- Patterson, G. H., Lippincott-Schwartz, J. A photoactivatable GFP for selective photolabeling of proteins and cells. Science. 297 (5588), 1873-1877 (2002).
- Ando, R., Hama, H., Yamamoto-Hino, M., Mizuno, H., Miyawaki, A.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
