Hier presenteren we een protocol waarbij genetisch gekoppelde spectraal verschillende photoactivatable en fluorescente proteïnen. Deze TL proteïne Chimaera toestaan kwantificering van de PA-FP-breuk thats photoactivated als tl, dat wil zeggen, de efficiëntie van de photoactivation. Het protocol blijkt dat verschillende vervoerswijzen photoactivation verschillende photoactivation efficiëntieverbeteringen opleveren.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Hoe te kwantificeren van de Fractie van Photoactivated fluorescerende eiwitten in Bulk en in levende cellen
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Photoactivatable en -converteerbare fluorescente proteïnen (PA-FPs) hebben in fluorescentie live-cel microscopie is gebruikt voor het analyseren van de dynamiek van cellen en eiwit ensembles. Tot nu toe geen methode beschikbaar te kwantificeren in bulk geweest en in levende cellen hoeveel van de PA-FPs uitgedrukt zijn photoactivated te lichten.
Hier presenteren we een protocol met betrekking tot interne heersers, dat wil zeggen, genetisch waaraan spectraal onderscheiden (photoactivatable) fluorescente proteïnen, ratiometrically kwantificeren van de Fractie van alle PA-FPs, uitgedrukt in een cel die zijn ingeschakeld als TL. Met behulp van dit protocol, laten we zien dat de verschillende vervoerswijzen photoactivation verschillende photoactivation efficiëntie opgeleverd. Korte high-power photoactivation met een confocale laser scanning microscoop (CLSM) resulteerde in tot viermaal lagere photoactivation efficiëntie dan honderden low-level vorderingen toegepast door CLSM of een korte puls toegepast door widefield verlichting. Terwijl het protocol heeft hier zijn geïllustreerd voor (PA-) GFP en Cherry (PA-), kan het in principe worden toegepast op elk spectraal verschillende photoactivatable of photoconvertible TL proteïne paar en een experimentele opstelling.
Inleiding
In 2002, werden de eerste breed toepasbare photoactivatable (PA-GFP1) en photoconvertible (Kaede2) fluorescente proteïnen beschreven. Deze optische markeerstift fluorescente proteïnen wijzigen hun spectrale eigenschappen bij bestraling met UV-licht, dat wil zeggen, ze helder (photoactivatable fluorescerende eiwitten, dat wil zeggen, PA-FPs) of hun kleur (photoconvertible wijzigen FPs). Tot op heden, zijn verschillende omkeerbaar en onomkeerbare photoactivatable en photoconvertible fluorescerende eiwitten ontwikkelde3,4. In ensemble of bulk studies, zijn optische markeerstiften gebruikt om de dynamiek van hele cellen of eiwitten, en de connectiviteit van subcellular compartimenten te studeren. Bovendien gebaseerd optische markeerstiften ingeschakeld single-molecuul super-resolution beeldvormende technieken zoals PALM5 en FPALM6.
Hoewel de foto-chemische tijdens processen photoactivation of -conversie zijn beschreven voor vele optische markeerstiften en zelfs kristallografische structuren voor en na photoactivation / - conversie beschikbaar7 zijn aangebracht , 8, het onderliggendefysieke mechanisme van de foto van photoactivation en -conversie is niet volledig begrepen. Bovendien, tot nu toe slechts ruwe schattingen bestaan uit de efficiëntie van photoactivation en -conversie, dat wil zeggen, de Fractie van fluorescente proteïnen uitgedrukt dat is eigenlijk photoconverted of photoactivated als tl. In vitro ensemble studies hebben gemeld kwantificering van de verschuiving in de absorptiespectra en het bedrag voor native en geactiveerd proteïne in een gel9,10,11.
Hier presenteren we een protocol waarbij fluorescent proteïne Chimaera om te beoordelen van de Fractie van photoactivated fluorescerende eiwitten in bulk en in levende cellen. Wanneer werkt met genetisch gecodeerde fluorescerende eiwitten, de absolute hoeveelheid eiwit uitgedrukt varieert van cel naar cel en is onbekend. Als één cel uiting van een PA-FP een helderder signaal na photoactivation dan een andere cel toont, kunnen niet worden onderscheiden als dit helderder signaal te wijten aan hogere uitdrukking van het PA-KP of een efficiënter photoactivation van het PA-KP is. Om te standaardiseren op het niveau van de expressie in cellen, introduceren we interne heersers van genetisch gekoppelde spectraal verschillende fluorescente proteïnen. Door koppeling van de genetische gegevens van een photoactivatable TL proteïne aan een spectraal verschillende altijd-op fluorescente proteïnen, interne linialen worden gemaakt die zal nog steeds worden uitgedrukt aan een onbekende totaalbedrag maar in een vaste en bekende relatieve hoeveelheid 1: 1. deze strategie staat de kwantitatieve karakterisering van verschillende UV-licht photoactivation regelingen, dat wil zeggen, de beoordeling van de relatieve hoeveelheid PA-FPs die kan worden photoactivated door de verschillende modi van photoactivation, en daardoor vergunningen definiëren van photoactivation regelingen die effectiever dan anderen zijn. Bovendien kan deze strategie in beginsel de beoordelingvan de absolute kwantificering van de photoactivated PA-FP breuk. Te dien einde is het belangrijk om te beseffen dat de gepresenteerde ensemble studies intensiteit gebaseerde waardoor de analyse meer complexe zijn zoals uiteengezet in dit protocol. Parameters bepalen de gemeten fluorescerende intensiteit, d.w.z., verschillende moleculaire helderheid, absorptie en emissie spectra en FRET effecten moeten worden overwogen bij het vergelijken van de fluorescentie intensiteiten van verschillende fluorescente proteïnen.
De kwantificering van de intensiteit gebaseerde van de gepresenteerde ratiometric van photoactivation-efficiëntie wordt geïllustreerd voor PA-GFP en PA-kers in levende cellen, maar is in principe breed toepasbare en kan worden gebruikt voor een photoactivatable fluorescerende eiwit onder experimentele conditie.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
1. plasmide bouw
- Twee kleuren fusion sondes te genereren. Gebruik een vector van zoogdiercellen expressie (Zie Tabel van materialen) in welke mCherry112 en13 van de PA-mCherry1 zijn ingevoegd met de beperking sites AgeI en BsrGI.
- Aangepaste oligo-nucleotiden aan het versterken van de monomere varianten van eGFP en PA-eGFP met de A206K mutatie, dat wil zeggen, mEGFP en PA-mEGFP14 zonder een stop codon als een fragment SalI-BamHI bestellen Gebruik van de primer N-terminal 5'-AAT TAA CAG TCG ACG ATG GTG AGC AAG GGC GAG G 3' en de C-terminal primer 5'-AAT ATA TGG ATC CCG CTT GTA CAG CTC GTC CAT GC 3' en dit SalI-BamHI -fragment invoegen de site meerdere klonen van de expressie-vector. Dit zal leiden tot de vijf aminozuur linker RNPPV tussen de groene en rode fluorescerende proteïne. We noemen het fluorophore Chimaera GFP — Cherry, PA-GFP — Cherry en GFP — PA-Cherry voor de rest van dit artikel.
Opmerking: De koppeling van fluorophores en oprichting van interne linialen te beoordelen van de efficiëntie van de photoactivation kunnen worden gedaan met elk paar spectraal verschillende fluorophore, bijvoorbeeld superfolder PA-GFP 15/ PA-TagRFP 16, enz. Veel van de photoactivatable fluorescerende eiwitten zijn afgeleid van GFP. Vandaar, kan de volgorde van de primer hierboven worden gebruikt voor vele fluorescente proteïnen voor de bouw van een hersenschim van de fluorophore in een vector van zoogdiercellen expressie.
2. cel cultuur en transfectie
- Gebruik ofwel standaard cellijn zoals HeLa, NRK, Cos-7 of een specifieke cellijn moet worden gebruikt voor specifieke photoactivation experimenten. Gebruik DMEM (aangevuld met 10% foetale runderserum en 2 mM glutamine) en trypsine zonder fenol rood (Zie Tabel van materiaal) te verminderen achtergrond fluorescentie.
- Loskoppelen van de cellen van een confluente cultuur met trypsine, het aantal cellen in celsuspensie met behulp van een Neubauer kamer en zaad 5.000-10.000 cellen per putje. Anderzijds gebruiken 1 druppel uit een Pipetteer 2 mL van een 10-mL celsuspensie van een confluente celcultuur gegroeid in de kolf van een T-25-celkweek of 3 druppels van een 5-mL celsuspensie uit een confluente cultuur geteeld in de kolf van een T-12,5-celkweek.
- Groeien van cellen in 8-well kamers met #1.0 dekking glas (Zie Tabel of Materials) voor fluorescentie live-cel microscopie.
- Transfect cellen 24u na beplating met behulp van commerciële reagentia (Zie Tabel van materialen) per distributeur van protocol met het GFP-kers, PA-GFP — Cherry en GFP — PA-Cherry Chimaera.
- Afbeelding cellen na een totaal van 20 h post transfectie voor eiwit expressie, vouwen en rijping.
3. beeldvorming en Photoactivation
- De cellen van de afbeelding in een bevochtigde en verwarmde milieu kamer bij 37 graden Celsius. De cel media bij fysiologische pH buffer te maken van het CO2-onafhankelijke, 20 mM HEPES toevoegen of CO2 gas ingesteld op 5% stroom te gebruiken.
- Eerst, het beeld van cellen uiten het GFP-Cherry construct. Parameters instellen die tijd geïntegreerde laser intensiteit per pixel in een confocal image, dat wil zeggen, pixel Nadruktijd in microseconden, akoestisch-optische afstembare filter (AOTF) transmissie in procent, en digitale zoom definiëren.
Opmerking: Via een 60 x objectieve en een digitale zoom van 3 x beeldvorming van een cel in zijn geheel, terwijl het verstrekken van voldoende vergroting maakt het mogelijk. Ingesteld pixel Nadruktijd op 2-4 µs en AOTF transmissie voor de 488-nm en 561-nm laser zodat beelden een goed signaal-/ ruisverhouding zonder enige bleken tonen en geen pixels die fluorescentie intensiteit verzadiging aangeeft. - Beeld, met behulp van de set laser kracht, transmissie van AOTF, pixel Nadruktijd en digitale zoom, 15-20 cellen uiten GFP — Cherry.
- Vervolgens afbeelding met dezelfde set laser kracht, nadruktijd pixel, AOTF transmissie en digitale zoom cellen uiten GFP — PA-Cherry en PA-GFP — Cherry. Zoek voor het uitdrukken van cellen in het groene kanaal of de rode kanaal, respectievelijk. Vermijd lange blootstelling van de cellen tijdens de zoektocht voor het uitdrukken van cellen om niet bleken de fluorescente proteïnen.
- Een mini tijdreeksen met een afbeelding van de pre-activering en drie Activering achteraf afbeeldingen instellen. De beelden van de Activering achteraf zal helpen identificeren van potentiële voorbijgaande donkere Staten als gevolg van de blootstelling aan UV-licht.
Opmerking: In onze handen, veranderingen in het gedetecteerde fluorescentie intensiteit als gevolg van transiënte donkere Staten waren < 1% en kan worden verwaarloosd, maar de donkere Staten beoordeeld moeten worden voor elke experimentele opstelling. - Om te bepalen photoactivation-efficiëntie, dat wil zeggen, de Fractie van de PA-FPs die aanstaat als fluorescerende, in de specifieke photoactivation-experimenten die zijn al vastgesteld, dezelfde photoactivation instellingen toepassen op 15-20 cellen die de interne linialen geïntroduceerd hier uiten en ga verder met beeldanalyse (punt 4). Als het begint te photoactivation experimenten opzetten, vinden hier een paar verschillende instellingen op basis van onze experimentele ervaring met PA-GFP en PA-Cherry; Wijzig indien nodig.
- Momentane photoactivation van PA-GFP en PA-Cherry met behulp van een confocale laser scanning microscoop (CLSM), van toepassing 90 μW van 405 nm laserlicht in 3 of 5 iteraties, respectievelijk.
Opmerking: Met onze microscopische set-up, met behulp van een 38% AOTM transmissie en een 2 µs pixel nadruktijd, we gemeten deze 405-nm laser macht in lijn-scan modus op het objectief. Met deze instellingen, kunnen ongeveer 8% en 16% van de PA-GFP en PA-Cherry uitgedrukt worden photoactivated als tl. De volledige titratie-serie met behulp van CLSM momentane photoactivation geweest publiceerde eerder17. - Als een hogere Fractie van photoactivated PA-GFP en PA-Cherry fluorophores voordelige BV is te bereiken van een hogere signaal-/ ruisverhouding en photoactivation niet hoeft te worden onmiddellijk, toepassen 40 μW van 405 nm laser licht met een 2 µs pixel Nadruktijd en 6% AOTF transmissie voor 450 iteraties. Vervolgens photoactivation zal nemen tot 4 min. in tegenstelling tot slechts 1-2 seconden zal, maar photoactivation-efficiëntie voor PA-GFP 29% in plaats van 8%, waardoor een hogere signaal-ruisverhouding.
- Momentane photoactivation van PA-GFP en PA-Cherry met behulp van een confocale laser scanning microscoop (CLSM), van toepassing 90 μW van 405 nm laserlicht in 3 of 5 iteraties, respectievelijk.
- Als een mozaïek digitale verlichting systeem waarin micro spiegel arrays in een ruimtelijke lichtmodulator beschikbaar is, kan de 405-nm laserlicht worden gebruikt voor widefield-photoactivation. Dit zorgt voor efficiënt photoactivation binnen milliseconden.
Opmerking: Met 1.6 mW laser macht zoals gemeten aan de objectief en een belichtingstijd van 250 ms, 29% van de PA-GFP kan worden photoactivated als tl. - Afbeelding met eventuele parameters instellen photoactivation 15-20 cellen uiten van PA-GFP — Cherry en GFP — PA-Cherry, respectievelijk.
- Aangezien pH, reactieve zuurstof soorten en andere omgevingsfactoren invloed kunnen zijn op photoactivation-efficiëntie, kan het belangrijk zijn te beoordelen van de efficiëntie van de photoactivation van de PA-FPs in de respectieve subcellular micromilieu waar de proteïne van belang is gelegen. Door het koppelen van de Chimaera fluorophore aan de proteïne van belang, zoals de auteurs hebben gedaan met het plasmamembraan eiwit VSVG 18, kan photoactivation-efficiëntie worden beoordeeld in het specifieke subcellular compartiment van belang.
4. beeld van de analyse en de algoritme voor Ratiometric intensiteit gebaseerde kwantificering van Photoactivation efficiëntie
- Beeldanalyse kan worden gedaan met de opensource beeldverwerking platformen ImageJ of Fiji. Het bepalen van de intensiteit van de fluorescentie achtergrond in niet-transfected cellen in het groen (B1) en rode (B2) kanaal. Vermijd perinuclear of gebieden tonen verhoogde auto-fluorescentie.
- Om te bepalen van de intensiteit van de fluorescentie in een transfected cel, een overzicht van de cel lichaam met het freehand selecties gereedschap. Nogmaals, Vermijd perinuclear of wat voor andere gebieden tonen van auto-fluorescentie.
- Aftrekken van de achtergrond van de intensiteit van de fluorescentie gemeten in elk kanaal.
Ik,G = IGreen_measured -B1
IkR = IRed_measured -B2 - Gebruik het GFP-Cherry construct corrigeren voor donor-blussen door fluorescentie resonance energy transfer (FRET) te berekenen van de verhouding rood-met-groen (RtoGr). De efficiëntie van de FRET E was vastbesloten om te worden 0.3 in eerdere experimenten voor het GFP-Cherry constructie met behulp van de dezelfde aminozuur linker tussen de twee fluorophores18.
RtoGr = (ikRed_measured – B2) / (ikGreen_measured -B-1)
RtoGrcorr = RtoGr * (1-E)
Opmerking: In deze intensiteit gebaseerde benadering, donor blussen voor mEGFP en PA-mGFP mogelijk anders gegeven mogelijk verschillende spectrale eigenschappen die niet gekenmerkt. Het tempo van de FRET (kET) en de afstand Foerster (R0) is afhankelijk van het quantumrendement van de donor die niet voor mEGFP en PA-mGFP is vastgesteld. - Gebruik de GFP — PA-Cherry construct te beoordelen van de Fractie van photoactivated PA-Cherry. De intensiteit van de verwachte fluorescentie van PA-Cherry bepalen door te vermenigvuldigen met de intensiteit van de gemeten ongelest groene fluorescentie van het GFP — PA-Cherry construeren voorafgaande aan de photoactivation met de gecorrigeerde rood-met-groen-ratio (RtoGrcorr ).
IkRed_expected = (IGreen_measured -B1) * RtoGrcorr
Opmerking: Zoals hierboven aangegeven, de moleculaire helderheid van de FP altijd-op en de photoactivatable FP kan afwijken. Zie het onderwerp voor meer informatie over de wijze waarop deze verschillen. - Berekenen van de efficiëntie van de photoactivation PA-Cherry als een breuk van de gemeten rode fluorescentie intensiteit na photoactivation en de intensiteit van de verwachte fluorescentie in het rode kanaal.
(FPA-Cherry) = (ikRed_measured – B2) / ikRed_expected - Gebruik van de PA-GFP — Cherry construct te beoordelen van de Fractie van photoactivated PA-GFP. Bepalen van de intensiteit van de verwachte fluorescentie van PA-GFP door het verdelen van de intensiteit van de gemeten rode fluorescentie van de PA-GFP — Cherry construeren voorafgaande aan de photoactivation door de rood-met-groen-ratio (RtoGr). De RtoGr hoeft hier niet te worden gecorrigeerd voor de donor blussen, omdat GFP en PA-GFP zijn onderworpen aan donor blussen tot hetzelfde bedrag.
IkGreen_expected = (ikRed_measured – B2) / RtoGr - Berekenen van de efficiëntie van de photoactivation PA-GFP als een breuk van de gemeten groene fluorescentie intensiteit na photoactivation en de intensiteit van de verwachte fluorescentie in het groene kanaal.
(FPA-GFP) = (ikGreen_measured – B1) / ikGreen_expected
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Het hier gepresenteerde protocol toont de kwantificering van de ratiometric van de Fractie van fluorescente proteïnen toe die photoactivated als tl (Figuur 1). Deze fractie verschilt afhankelijk van de wijze van photoactivation.
Een typisch resultaat met behulp van korte tijd high-power photoactivation met een confocale laser scanning microscoop (CLSM) wordt weergegeven in Figuu...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Tot nu toe bestond geen methode om te bepalen in de bulk van de Fractie van de PA-FPs uitgedrukt in levende cellen die photoactivated als tl. Het gepresenteerde protocol kan worden gebruikt voor elk paar spectraal verschillende fluorescente proteïne. Terwijl geïllustreerd hier voor de onomkeerbare PA-FPs PA-GFP en PA-Cherry, is deze aanpak in principe van toepassing op photoconvertible eiwitten zo goed. De spectraal verschillende fluorescente proteïne, echter moet worden geselecteerd zorgvuldig om te minimaliseren van sp...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben niets te onthullen.
Dankbetuigingen
Wij wil het Dorigo laboratorium en de neurowetenschappen Imaging Service aan Stanford University School of Medicine bedanken voor het verstrekken van apparatuur en ruimte voor dit project.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| pEGFP-N1 mammaalse celexpressievector | Clontech | ||
| DMEM zonder fenol rood | Thermo Fisher Scientific | 11054020 | |
| Trypsine zonder fenol rood | Thermo Fisher Scientific | 15400054 | |
| L-Glutamine (200 mM) | Thermo Fisher Scientific | 25030081 | |
| HEPES | Thermo Fisher Scientific | 15630080 | |
| LabTek 8-kamer kamers #1.0 | Thermo Fisher Scientific | 12565470 | |
| Fugene 6 | Promega | E2691 |
Referenties
- Patterson, G. H., Lippincott-Schwartz, J. A photoactivatable GFP for selective photolabeling of proteins and cells. Science. 297 (5588), 1873-1877 (2002).
- Ando, R., Hama, H., Yamamoto-Hino, M., Mizuno, H., Miyawaki, A. An optical marker based on the UV-induced green-to-red photoconversion of a fluorescent protein. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (20), 12651-12656 (2002).
- Renz, M., Lippincott-Schwartz, J. Ch. 9. The Fluorescent Protein Revolution Series in Cellular and Clinical Imaging. Day, R. N., Davidson, M. W. , CRC Press. 201-228 (2014).
- Shcherbakova, D. M., Sengupta, P., Lippincott-Schwartz, J., Verkhusha, V. V. Photocontrollable fluorescent proteins for superresolution imaging. Annual Review of Biophysics. , 303-329 (2014).
- Betzig, E., et al. Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution. Science. 313 (5793), 1642-1645 (2006).
- Hess, S. T., Girirajan, T. P., Mason, M. D. Ultra-high resolution imaging by fluorescence photoactivation localization microscopy. Biophysical Journal. 91 (11), 4258-4272 (2006).
- Henderson, J. N., et al. Structure and mechanism of the photoactivatable green fluorescent protein. Journal of the American Chemical Society. 131 (12), 4176-4177 (2009).
- Subach, F. V., et al. Photoactivation mechanism of PAmCherry based on crystal structures of the protein in the dark and fluorescent states. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (50), 21097-21102 (2009).
- Wiedenmann, J., et al. EosFP, a fluorescent marker protein with UV-inducible green-to-red fluorescence conversion. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (45), 15905-15910 (2004).
- Habuchi, S., Tsutsui, H., Kochaniak, A. B., Miyawaki, A., van Oijen, A. M. mKikGR, a monomeric photoswitchable fluorescent protein. PLoS One. 3 (12), e3944(2008).
- McKinney, S. A., Murphy, C. S., Hazelwood, K. L., Davidson, M. W., Looger, L. L. A bright and photostable photoconvertible fluorescent protein. Nature Methods. 6 (2), 131-133 (2009).
- Shaner, N. C., et al. Improved monomeric red, orange and yellow fluorescent proteins derived from Discosoma sp. red fluorescent protein. Nature Biotechnology. 22 (12), 1567-1572 (2004).
- Subach, F. V., et al. Photoactivatable mCherry for high-resolution two-color fluorescence microscopy. Nature Methods. 6 (2), 153-159 (2009).
- Zacharias, D. A., Violin, J. D., Newton, A. C., Tsien, R. Y. Partitioning of lipid-modified monomeric GFPs into membrane microdomains of live cells. Science. 296 (5569), 913-916 (2002).
- Slocum, J. D., Webb, L. J. A Double Decarboxylation in Superfolder Green Fluorescent Protein Leads to High Contrast Photoactivation. Journal of Physical Chemistry Letters. 8 (13), 2862-2868 (2017).
- Subach, F. V., Patterson, G. H., Renz, M., Lippincott-Schwartz, J., Verkhusha, V. V. Bright monomeric photoactivatable red fluorescent protein for two-color super-resolution sptPALM of live cells. Journal of the American Chemical Society. 132 (18), 6481-6491 (2010).
- Renz, M., Wunder, C. Internal rulers to assess fluorescent protein photoactivation efficiency. Cytometry A. , (2017).
- Renz, M., Daniels, B. R., Vamosi, G., Arias, I. M., Lippincott-Schwartz, J. Plasticity of the asialoglycoprotein receptor deciphered by ensemble FRET imaging and single-molecule counting PALM imaging. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (44), E2989-E2997 (2012).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
