Methodenartikel

Biocytin herstel en 3D-reconstructies van gevulde Hippocampal CA2 interneuronen

11K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/58592

⸱

20 november 2018

 ,  , 
1Department of Pharmacology, University College London

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

Het protocol hier geschetste beschrijft de immunofluorescentie analyse, biocytin herstel en kwalitatief hoogwaardige reconstructies van hippocampal CA2 interneuronen na de intracellulaire elektrofysiologische opnames in vitro waardoor neuronale karakterisering en uiteindelijk prima neuronale anatomie worden bestudeerd.

Samenvatting

Informatie is van belang voor een groot aantal fundamenteel en klinisch wetenschappelijke vragen hoe corticale netwerkactiviteit verwerkt. Het protocol hier beschreven identificeert de elementaire bouwstenen van deze circuits. De diepgaande studies van corticale gebieden zorgt uiteindelijk voor andere wetenschappers met de circuit componenten die nodig zijn voor een goed begrip van hoe de hersenen verwerft, verwerkt en opgeslagen informatie en wat misgaat in ziekte, terwijl het elektrofysiologische en morfologische gegevens worden veel gebruikt door computationele neurowetenschappers in de bouw van model-netwerken die onderzoeken van informatieverwerking. Het protocol hier geschetst wordt beschreven hoe biocytin gevulde cellen opgenomen in de CA2-regio van de hippocampus worden hersteld en vervolgens herbouwd in 3D. Bovendien is het protocol beschreven de demonstratie van calcium bindend-proteïne of peptide inhoud in opgenomen interneuronen.

Inleiding

De cortex en hippocampus zijn structuren voor dergelijke complexiteit dat de classificatie van neuronale subtypen1,2,3,4, kaarten van de verbindingen tussen hen5,6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 en hoe deze circuits ondersteunt cognitieve functies12,13,14,15 zijn nog steeds onder intense studie en het onderwerp van voortdurende debat. Bijvoorbeeld, om te begrijpen van de details en de complexiteit van de circuits en te coördineren van gegevens die zijn verkregen uit vele verschillende studies, het is zeer nuttig om te kunnen worden gedefinieerd en worden de onderdelen beschreven, maar het blijft een zaak van debat hoe veel verschillende klassen van neuronen bestaan, of zelfs of het is mogelijk om te bepalen van alle neuronen als behorend tot een specifieke klasse. Computerhulpmiddelen die kunnen bouwen en testen van schakelingen met verschillende gradaties van complexiteit worden ontwikkelde16,17,18, maar de kern van deze inspanningen is de behoefte aan gedetailleerde studies van de celtypes en de eigenschappen van de verbindingen tussen hen. Een grote hoeveelheid informatie over het lokale circuit van de neocortex van volwassen ratten heeft al zijn verzameld via het protocol beschreven hier10,19,20,21, 22. Hoewel het "bedradingsschema" verre van compleet is, duidelijke patronen of regels naar voren zijn gekomen. Bovendien, hoewel sommige details verschillen, deze regels gelden naar twee soorten zoogdieren (rat en katten) en over verschillende neocortical regio's, waardoor de ontwikkeling van bouwstenen die dreigen te worden eveneens van toepassing op menselijke neocortex. De hier beschreven techniek wordt gebruikt om uit te breiden ons begrip van de functionele kaart van corticale circuits door het identificeren van de presynaptische en postsynaptisch neuronen die betrokken zijn bij verbindingen in de regio's die niet in detail onderzocht hebben, met behulp van een protocol waarmee uitstekende weefsel instandhouding en opmerkelijk kleuring herstel in volwassen hersenweefsel. Met deze methode zijn gegevens over het lokale circuit in CA2 en neuronale eigenschappen in dit subveld verzameld door het combineren van intracellulaire elektrofysiologische opnamen (gepaarde opnames met scherpe microelectrodes) met biocytin vullen, immunofluorescentie, histologisch procedures en zeer gedetailleerd neuronale reconstructies, waardoor directe vergelijking met de naburige CA regio's23,24,25.

De techniek die in dit artikel beschreven is ontwikkeld in de jaren voor gedetailleerde neuronale anatomie, waardoor de juiste indeling van de cellen en de hoge kwaliteit en nauwkeurige reconstructies van beide hun dendritische en axonale arbors, gegevens die kunnen worden gecorreleerd met elektrofysiologische gegevens verzameld uit gekoppelde opnamen met behulp van scherpe elektroden. Het histologische protocol is geoptimaliseerd om de ultrastructuur van de neuronen te behouden en verkrijgen van uitstekende herstel van dendritische (inclusief stekels) én axonale arbors. Bijvoorbeeld, geeft het beginsel van de dubbele fixatie techniek door in de eerste plaats onder te dompelen in een kleefpoeders oplossing en ten tweede na vaststelling in osmium tetroxide een goed contrast voor de lichte microscopie van26. Een kleine hoeveelheid Glutaaraldehyde en pikrinezuur oplossing worden toegevoegd aan de kleefpoeders oplossing ter verbetering van antilichaam penetratie en het behoud van de cellen ultrastructuur zoals in een eerdere studie27wordt voorgesteld. De permeabilization van de segmenten van de hersenen met behulp van de methode van de vries-dooi in combinatie met cryo-bescherming met sacharose, in plaats van een traditioneel wasmiddel, biedt ook een optimaal behoud van de weefsels voor gedetailleerde morfologische analyse van de opgenomen cellen. Bovendien, is de visualisatie met name van zeer fijne structuren verbeterd doordat achtergrondkleuring, met de incubations met waterstof peroxide (H2O2) en natriumboorhydride (NaBH4). Het toevoegen van nikkel chloride (NiCl2) aan de horseradish peroxidase (HRP) verhoogt reactie op het verkrijgen van een zwarte pigment reactieproduct ook u het contrast.

Het volgende protocol beschrijft de procedures gebruikt om na te gaan van uitstekende weefsel instandhouding en zeer gedetailleerde neuronale 3D-reconstructies na intracellulaire opnames in vitro. De beschrijving van de voorbereiding van het segment, intracellulaire gepaarde opnamen met behulp van scherpe elektroden en latere histologische procedures gebruikt in ons laboratorium geweest eerder gemelde28. Hoewel het protocol is van toepassing op de cellen intracellulair gevuld met biocytin in dikke sneden van 450 – 500 μm, kan hetzelfde protocol worden gebruikt na geheel-cel opnames. Echter, het gebruik van dunner segmenten zal resulteren in minder volledig reconstructies van de cellen.

Protocol

Alle procedures in deze studie gebruikt werden uitgevoerd volgens de voorschriften van het Britse Bureau van het huis met betrekking tot de dierlijke wetenschappelijke Procedures Act 1986.

1. bepaling van het Calcium bindend proteïne of eiwitgehalte van interneuronen en visualisatie van de Biocytin na elektrofysiologische opnames en het vullen van de Biocytin

Opmerking: Aan het eind van de elektrofysiologische opnamen, segmenten met biocytin gevulde cellen zijn vaste 's nachts vóór histologische procedures. De kleefpoeders oplossing zullen worden vervangen door een enkele verandering van 0,1 M fosfaatbuffer de volgende ochtend, als de rest van de procedure wordt uitgevoerd op een andere dag, om te voorkomen dat weefselschade. Vers van de oplossing van de fixatie (4% paraformaldehyde, 0,2% verzadigd pikrinezuur oplossing, 0,025% Glutaaraldehyde oplossing in 0,1 M fosfaatbuffer (PB)) op de dag van de opnames voor de beste resultaten moet geschieden.

  1. Aan het eind van de elektrofysiologische opname, zorgvuldig halen het segment met de opgenomen cel(len) met een penseel en plaatst u deze in een pot met kunstmatige cerebrale spinale vloeistof (ACSF).
    Opmerking: Details van het protocol dat wordt gebruikt voor de voorbereiding van het segment en intracellulaire opnamen met behulp van scherpe elektroden geweest eerder28beschreven.
  2. In een zuurkast, zorgvuldig pick-up van het segment van de hersenen met een penseel en rol het op een klein stukje filtreerpapier van prima kwaliteit. Plaats van een ander stuk bevochtigd filtreerpapier op het segment en plaats de twee stukken van natte papieren filter in een kleine plastic pot met 5-10 mL van oplossing kleefpoeders en winkel in de koelkast 's nachts bij 4 ° C.
  3. Bereid een oplossing van gelatine in gedestilleerd water. Breng 20 mL gedestilleerd water in een bekerglas op een hete plaat en verwarm het tot 60 ° C. Voeg geleidelijk 2.4 g van gelatine aan het water, wachten tot het is opgelost en laat ze afkoelen tot 35-40 ° C vóór gebruik ter voorkoming van weefselbeschadiging.
  4. Vervang de kleefpoeders oplossing met 2 mL 0,1 M PB. Plaats van het segment in een petrischaal en eventuele overtollige weefsel weggesneden met een scalpel mes. Plaats de bijgesneden weefsel in een petrischaal (diameter van 9 cm, hoogte van 1,4 cm), ervoor te zorgen dat het ligt plat zonder plooien of kreukels en verwijderen van de overtollige buffer met behulp van een droge penseel.
  5. Dekking van het weefsel met de warme gelatine-oplossing en plaats de petrischaal op een diepgevroren blok snel afkoelen van de oplossing.
  6. Met behulp van een hoek-poise lamp voor contrast, kijk door de kant van de schotel en houden het segment platte lichte druk van een fijn penseel gebruiken totdat de gelatine begint te stellen.
    Opmerking: De gelatine kan worden opnieuw gesmolten als het weefsel niet plat ligt. Eventuele onvolkomenheden op het oppervlak van de gelatine die veroorzaakt door het verwijderen van de verfkwast zoals het stolt kunnen worden verwijderd door het smelten van de bovenlaag zachtjes door het bewegen van de lamp van de lamp dicht onder de oppervlakte voor een paar seconden.
  7. De schotel van instelling gelatine naar de koelkast en laat bij 4 ° C gedurende 30-60 min.
  8. In een zuurkast, gesneden uit een kleine blok (~ 1 x 1 cm) met het gelatine-embedded weefsel van de schotel met behulp van een scalpel blad, opheffing van het blok met behulp van een kleine spatel en breng dit zorgvuldig in het zelfde maar verse kleefpoeders oplossing gebruikt om te herstellen van de segmenten voor ten minste 30 min. bij 4 ° C .
  9. Spoel de gelatine blok in 5 mL 0,1 M PB driemaal, droog het met behulp van een stukje weefsel van papier en stok de blok kant omhoog (dat wil zeggen, met het weefsel aan de bovenkant) op een vibratome chuck met behulp van lijm.
  10. Verwijder overtollige lijm met een stuk filtreerpapier en gebruik van een scalpel blad af te snijden de hoeken van het blok, waardoor de vorm van een diamant.
  11. Afdeling van het segment bij 50 µm dikte met behulp van een vibratome en plaats van elke sectie zorgvuldig in een glazen ampul met 10% sucrose.
  12. Zorgvuldig Neem een sectie uit het flesje, leg deze plat in een petrischaal deksel. Met behulp van een Microscoop ontleden en een verse scalpel blad, verwijderen van de gelatine van rond de sectie en de sectie terugkomen met een flacon met 2 mL vers 10 gewichtspercenten sacharose
    Opmerking: Het is cruciaal voor het verwijderen van zo veel gelatine als mogelijk is in dit stadium om weefsel krimp tijdens de uitdroging stap (stap 1.37).
  13. Cryo-bescherming van de secties in 0,1 M PB gebaseerde sacharose-glycerol oplossing bij kamertemperatuur door het broeden ze gedurende 10 minuten in een 10% sacharoseoplossing, 20 min in 20% sucrose - 6% glycerol oplossing tweemaal en ten slotte 30 min in 30% sucrose - 12% glycerol oplossing tweemaal onder constante agitatie.
  14. Plaats de secties plat op een kleine rechthoek van aluminiumfolie met behulp van een penseel. Verwijder alle overtollige vocht uit de secties en zorgvuldig Vouw de aluminiumfolie in een perceel.
  15. Houd het pakje dicht onder de oppervlakte van vloeibare stikstof zonder aan te raken het oppervlak voor 30 s en laat vervolgens de secties te ontdooien volledig voor ongeveer 30 s. herhalen de vries-dooi een ander twee keer.
  16. Verwijder alle secties met een penseel en plaatst u ze in een glazen ampul met 2 mL 0,1 M PB onder constante agitatie te wassen uit overtollige sacharose.
  17. Verwijder de PB met een pipet van Pasteur en de secties in 2 mL van de 1% waterige H2O2 incubeer 30 min. wassen de secties in 2 mL van 0,1 M PB 3 x 5 min.
  18. Verwijder van de 0,1 M PB met een pipet van Pasteur en voeg 1% natriumboorhydride (NaBH4) in 0,1 M PB.
    Opmerking: Niet de flacon, als NaBH4 oplossing uit waterstofgas geeft cap.
  19. Verwijder de natriumboorhydride met een pipet van Pasteur en wassen de secties 2 mL 0,1 M PB grondig in 5 x 5 min.
  20. De 0,1 M PB vervangen door 10% normale geit serum (NGS) in 0,1 M PB voor 30 min.
  21. Verwijderen van het serum van de geit en de secties 's nachts bij 4 ° C in een mengsel van muis monoclonal en polyclonal antilichamen konijn in ABC oplossing samengesteld uit te broeden.
    Opmerking: In een lijst van primaire antilichamen gebruikt in eerdere studies is weergegeven in tabel 1 Botcher et al. (2014) 29.
  22. Incubeer de gedeelten voor 2 h in het donker in een mengsel van fluorescently-gelabelde secundaire antilichamen (Tabel van materialen).
  23. Monteer de secties op de dia's in de montage medium en bedek met een dekglaasje aan.
  24. Neem beelden van fluorescentie etikettering bij 40 X vergroting (figuur 1Bb).
  25. Na de fluorescentie imaging, plaatst u de dia in een glazen petrischaaltje met PBS en verwijder voorzichtig het dekglaasje aan. Daarna wassen in de secties van de dia met behulp van zachte pulsen van PBS van een pipet van Pasteur. Plaats de secties in een schone glazen ampul met PBS.
  26. De avidin-HRP-reactie door ten eerste het broeden van de secties in ABC voor ten minste 2 uur aan het versterken van het reactieproduct HRP uitvoeren
  27. Bereid de oplossing van 3,5 diaminobenzidine (DAB) door een tablet toe te voegen aan 5 mL gedestilleerd water.
  28. Wassen van de secties met PBS driemaal voor 10 minuten en verwijder met Tris buffer tweemaal voor 10 min. de Tris buffer na de laatste wasbeurt.
  29. Snel een daling van 8% NiCl2 -oplossing toevoegen aan de oplossing van DAB, Pipetteer van de oplossing in en uit om te mengen en 1 mL van deze oplossing snel toe te voegen over de afdelingen. Incubeer de secties in de DAB/NiCl2 oplossing voor 15 min.
  30. Voeg toe 10 µL van 1% H2O2 aan de DAB-oplossing. Toestaan dat de reactie op gaan in het donker onder constante agitatie voor ongeveer 1 tot 2 minuten en toezicht op de etikettering van de gevulde cellen met een ontleden Microscoop.
  31. Zet de reactie stop door het verwijderen van de DAB/NiCl2/H2O2 oplossing en wassen van de secties met Tris buffer tweemaal voor 5 min.
  32. In een zuurkast, een kleine kring van filtreerpapier in een petrischaal plaatsen en temperen het met 0,1 M PB. Til de secties één filter tegelijk uit de glazen ampul met behulp van een penseel, en plaats ze voorzichtig plat op het papier.
  33. Dekking van de secties met een andere bevochtigd cirkel filtreerpapier en verwijder overtollige buffer door zachtjes aan te raken de papieren zakdoekje aan de oppervlakte.
  34. 8 – 9 druppels 1% osmium tetroxide in 0,1 M PB van toepassing op de bovenste papier, dekken de schotel en behouden in de zuurkast voor minstens 30 min, maar niet meer dan 1 h.
  35. Open de petrischaal en til het bovenste koffiefilter. Til de secties zorgvuldig één filter tegelijk met een penseel, plaats ze in een glazen ampul en spoel ze tweemaal in gedestilleerd water.
  36. Verwijdering van osmium tetroxide afval op de juiste manier. Spoel alle beschikbare apparatuur en plaats ze in de juiste opslaglocaties.
  37. Plaats elke sectie plat op een glasplaatje en dekglaasje aan de secties. Overdracht van de dia in een petrischaal, plaatst u een lege glazen ampul boven het dekglaasje aan te behouden in plaats en bedek met 50% alcohol. Na 15 min, verwijder de dia uit de oplossing en de secties van de dia. Plaats de secties weer op de dia en plaatst u vervolgens de dia in 70% alcohol voor 15 min. Herhaal hetzelfde proces met 95% en 100% alcohol oplossing.
  38. Na de uitdroging stap, door de secties te overbrengen in een glazen flacon met 100% alcohol op een shaker in een zuurkast. De alcohol oplossing vervangen door propyleenoxide (C3H6O) en wassen drie keer, gedurende 5 min. Na de laatste wash, ~ 2 mL van propyleenoxide houden in het flesje en hars (1:1 verhouding) toe te voegen. Zorgen dat de hars is ontbonden en houden de secties onder constante agitatie voor 30 min.
  39. Plaats van elke sectie in een aluminium planchette met epoxyhars met behulp van een houten stok en na een nacht bebroeden.
    Opmerking: De secties in de hars langer dan 24 uur om te voorkomen dat het risico van beschadiging van de secties niet verlaten.
  40. Plaats de planchette over een warmhoudplaat voor ongeveer 10 min. halen elke sectie met een houten stok en leg ze op een schone dia. De richting van elke sectie consistent met behulp van een ontleden Microscoop houden. Plaats een dekglaasje aan over de afdelingen. Zet de dia in de oven gedurende 48 uur bij 56 ° C gedurende het genezen.

2. 3D neuronale reconstructies

Opmerking: Neurolucida software wordt gebruikt. Onderstaande instructies gelden alleen voor een specifieke neurone wederopbouw systeem (Tabel van materialen). De secties die zijn verkregen uit het snijden wordt voldaan vóór de reconstructies met behulp van een microscoop.

  1. Een dia in het werkgebied plaatst en het beveiligen met fase clip en de neuron wederopbouw software niet openen. Klik op Acquire tabblad en selecteer Live beeld.
  2. Het meten van de dikte van elke sectie met behulp van 100 X olie objectief. Maak een notitie van de waarde op de z-meter boven en onder aan elke sectie en de sectie dikte als het verschil van de twee waarden te berekenen.
  3. Gebruik een laag-vergroting doelstelling te richten op de Home sectie waarin de cel lichaam. Gebruik vervolgens een doelstelling van 100 x, focus op het lichaam van de cel en klik in het Midden ter gelegenheid van het referentiepunt.
  4. Selecteer in het tabblad traceren Serial sectie Manager. Selecteer vervolgens Nieuwe sectie maken (+ pictogram) in het venster Serial sectie Manager . Voer het aantal secties. Naam van elke sectie in de juiste Z-volgorde en voer de gesneden dikte gemeten in stap 2.2.
  5. Wilt traceren het soma in 3D met behulp van 100 X doelstelling, Contour selecteren in het tabblad traceren en selecteert u de cel lichaamscontouren. Gebruik de joystick om de focus te verplaatsen naar de top van de cel lichaam. Plaats de punten door te klikken op rond de omtrek van het deel dat is momenteel in focus. Klik met de rechtermuisknop en selecteer Nauwe Contour tot het einde van deze eerste schets. Herhaal dit proces op verschillende z posities totdat de onderkant van de cel lichaam is bereikt (Figuur 2).
    Opmerking: Selecteer 3D visualiseren in Trace tabblad te visualiseren van de cel lichaam in 3D.
  6. Selecteer cel lichaam van het Neuron -menu in de Trace tab. Focus op het midden van de cel lichaam wilt traceren de cel lichaam in 2D 100 X streven naar betere coördinatie. Plaats de punten door te klikken op rond de omtrek van de cel lichaam. Ter voltooiing van het lichaam van de cel, klik met de rechtermuisknop en selecteer Voltooien cel lichaam.
  7. Wilt traceren de dendritische arbor, dendriet of Apicale dendriet in het Neuron -menu te selecteren. Eerst een korte, eerste segment voor elke dendriet met behulp van het bladerwieltje van de muis aan te passen van de diameter van de cursor overeenkomt met de diameter van de dendriet te traceren. Trek elke dendrites met behulp van de joystick te bewegen over de sectie en het bladerwieltje van de muis aan te passen van de diameter van de tracering.
  8. Controleer de uitlijning van het traceren met de levende Microscoop afbeelding en pas indien nodig, vooral na het verplaatsen met behulp van de joystick. Selecteer Uitlijnen traceringin het tabblad traceren , klikt u op het traceren en klik dan op de juiste locatie.
  9. Wanneer een knooppunt in de boom is bereikt, met de rechtermuisknop op en selecteer Punten Node of Trifurcating Node in het drop-down menu.
  10. Als het uiteinde van een tak heeft bereikt, selecteert u een einde in het drop-down menu in het menu van het Neuron . Selecteer de juiste einddatum type, dwz., hoge einde, normale einde of low eindigt om overeenkomende meerdere secties.
  11. Verminder de vergroting op de Microscoop zodra alle dendrites in de huidige sectie hebben opgespoord, selecteer het tabblad Joy vrije en verplaatsen naar een sectie die overeenkomt met onmiddellijk boven of onder het voltooide gedeelte.
  12. U kunt overeenkomende punten tussen de dendrites in een sectie die overeenkomt met de voltooide sectie identificeren, klik op het tabblad verplaatsen en Match puntenselecteren. Selecteer het aantal punten nodig gepaard gaan (drie of meer punten heeft de voorkeur) en druk vervolgens op OK. Klik op het einde van een voltooide tak en klik dan op de tak. Herhaal dit voor elk punt van de wedstrijd. Herhaal dit proces op 100 X vergroting om ervoor te zorgen nauwkeurige matching.
  13. Overeenkomende takken aan de vorige sectie direct door met de rechtermuisknop op het einde toevoegen. Selecteer toevoegen aan einde toen de tak op één lijn staat met de voltooide overgetrokken tak en het spoor zoals eerder is beschreven.
  14. Zodra alle de dendrites van elke sectie hebben opgespoord, traceren de axon via hetzelfde proces door het Axon selecteren in het menu van het Neuron .
  15. Ga naar de sectie opnieuw uitlijnen de wederopbouw met de levende Microscoop afbeelding en contouren van de Trace tab. Selecteer een vooraf gedefinieerde contour/laag grensgebied/rand selecteren en klik op te sporen langs een contour. Selecteer eind Open Contour. Traceren alle gewenste lagen en contouren van de regio.
  16. Gebruik 3D visualiseren in Trace tabblad te visualiseren de reconstructies in 3D.
  17. Record video's van 3D-reconstructies (Video 1), open de 3D reconstructie en films maken. De bestemming van een bestand instellen en rotatiesnelheid gewenst. Het is aanbevolen om de rotatie instellen tot 270°. Selecteer opname starten, record voor een paar seconden, en klik op Auto-roteert. Selecteer opname stoppen wanneer dit nodig is. Bewerk de video met een video-editing software (Tabel van materialen).
  18. Als u wilt de bestanden exporteren naar Tiff of JPEG-bestanden, selecteer bestand | Exporteren | Exporteren als afbeelding overtrekken. Een µm/pixel/breedteverhouding heeft gekozen en selecteer aanpassen. Selecteer een achtergrondkleur en selecteer bestand. Naam van het bestand, selecteer Tiff of JPEG en druk op Opslaan. Als u wilt exporteren de bestanden in vector-bestanden, selecteer bestand | Exporteren | Export traceren als vectorbestanden.
  19. Gebruik een software van de analyse van de wederopbouw van neuron Morfometrische-analyses uitvoeren.
    1. Open het bestand in Neurolucida Explorer te analyseren van dendritische bomen en verkrijgen van een dendrogram. Selecteer analyseren | Structuur en selecteer Dendrogram uit de drop-down menu (Figuur 3).
    2. Voor het uitvoeren van een analyse van de uitgebreide Morfometrische van de 3D-reconstructies (tak complexiteit, volumes van takken en Soma, oppervlakte), open het bestand in de software. Klik op Alles selecterenin het tabblad beeld . Selecteer het tabblad analyseren . Selecteer vervolgens structuur en Structuuranalyse van de tak.

3. Trouble Shooting

  1. Camera instellingen wijzigen. Voor het beste resultaat de belichtingstijd ingesteld op minder dan 100 ms en krijgen zo dicht bij de 0 mogelijk compenseren.
  2. Als de neuron wederopbouw software wordt niet automatisch de getraceerde contouren als een 3D cel lichaam in 3D visualiseren in Trace tabblad weergegeven, selecteert u objecten selecteren in Trace tabblad, houdt u de Ctrl -toets op het toetsenbord en Klik op alle getekende contouren, klik met de rechtermuisknop en selecteer vervolgens cel lichaam ingesteld op het drop-down menu.
  3. De z-aanpassing van alle punten via de rechtermuisknop aanklikt menu drop-down aan te passen van de z-parameters van een afzonderlijke tak, de boom (Selecteer objecten in Trace tabblad) te selecteren en instellen. Selecteer wijzigen z positie, vervolgens selecteert u Shift z-waarde en voer de vereiste waarde.
  4. Uitlijnen de reconstructies met behulp van 'Ga naar' in het tabblad ' verplaatsen' wanneer het nodig is te verplaatsen van een grote afstand over de tracering.
  5. Extra knooppunten toevoegen op elk gewenst moment tijdens het proces van wederopbouw. Selecteer het bijkantoor waar het knooppunt wordt worden geplaatst in (Object selecteren in Trace tabblad en klik op de tak), klik met de rechtermuisknop, en selecteer Invoegen in boom geselecteerd knooppunt. Klik vervolgens op de juiste locatie op de tak.
  6. Wanneer een reconstructie van een complexe neurone, splice trace overeenkomende takken individueel en later hen snellere identificatie van takken. Sporen van de takken in het nieuwe gedeelte afzonderlijk en vervolgens deze takken aan de overeenkomende takken op de vorige sectie te koppelen door zweefde over de beëindiging van het bijkantoor worden verbinding aan de randen, met de rechtermuisknop op en selecteer Spliceen vervolgens zweven tegenover de uitgang die de tak is worden verbinding aan de randen aan en klik op.
  7. Als een tak onder het verkeerde gegevenstype getrokken, selecteert u de boom, met de rechtermuisknop op selecteert U Type wijzigen boomen selecteer de juiste boom-type.
  8. Als een punt onjuist geplaatst wordt, Ctrl + Zuitvoeren of klik op de knop ongedaan maken in het menu van de Trace te verwijderen van de laatste punt. Deze procedure werkt echter niet als de joystick wordt gebruikt om te bewegen over de sectie voordat u probeert te verwijderen van een punt. In dit geval kan het punt worden verwijderd wanneer de tak wordt beëindigd. Selecteer de tak (druk op Object selecteren en klik op de tak), de muisaanwijzer op het punt om te worden verwijderd, klik met de rechtermuisknop en selecteer verwijderen punt.
  9. Als niet zeker dat of twee takken wordt voldaan, hetzij 1) gebruiken 3D visualiseren in Trace tabblad om te controleren afdelingen of de takken overeenkomen in het z-vlak, of 2) Toon begeleidende functie gebruiken in de Serial sectie Manager weergeven onmiddellijk boven en onder de huidige sectie in het grijs.
  10. Als een sectie is gespiegeld, ga naar Tools in de Trace tab. Selecteer XY schalen aanpassen en wijzigen van de x-as op -1. Selecteer juiste Z-krimp en z-as wijzigen op -1. Dan het traceren van takken zoals gebruikelijk. Vergeet niet om het omkeren van deze veranderingen bij het verplaatsen naar een sectie die had de oorspronkelijke afdrukstand. Wijzigen van de x - en z - as niet wijzigen tak die eindigde op etiketten, dus wees voorzichtig bij het splicing dat de juiste uitgangen worden gebruikt.
  11. Juiste Z-krimp kan worden gecorrigeerd, als er een significant verschil tussen het gedeelte knippen van de dikte en de gemonteerde dikte gemeten. Selecteer extraen vervolgens het corrigeren van Z-krimpin het tabblad traceren en voer de krimp factor voor de z-as als een decimale weergave van de gesneden dikte gedeeld door de gekoppelde dikte.

Resultaten

Neuronen in hippocampal CA2 werden gevuld met biocytin na elektrofysiologische opnamen (cijfers 1Ac, Ad en 1Bc, Bd). De plakjes waren vaste 's nachts na de opnames en de neurochemie en morfologische karakterisering van neuronen werden geopenbaard na het protocol beschreven hier.

De calcium-bindend-proteïne of eiwit inhoud van gevulde interneuronen werd bepaald door de segmenten eerst met primaire antilichamen en vervolgens met fluorescently geëtiketteerde secundaire antilichamen aan het broeden. De kenmerken van de vuren van de interneuronen tijdens de opnames zal bepalen de keuze van de primaire antilichamen gebruikt. Avidin-AMCA werd gebruikt om te visualiseren de interneuron biocytin gevulde en anti-muis fluoresceïne-isothiocyanaat (FITC) en geit anti-konijn Texas Red (TR) werden gebruikt voor het karakteriseren van de interneuronal neurochemie (figuur 1Bb).

Naar aanleiding van de fluorescentie visualisatie, een HRP-protocol is gebruikt voor het onthullen van de biocytin (figuur 1Ab). De fijn gedetailleerde anatomie van CA2 interneuronen was dan getrokken in 3D met behulp van een neuron wederopbouw software (Figuur 2 en Figuur 3a). Een video van een 3D reconstructie van een mand cel opgenomen en CA2 ingevuld wordt weergegeven in de Video. Neuronale reconstructies werden beschouwd als volledige als de dendritische en axonale arbors werden opgesloten in de diepte van het 450-500 μm segment. Arme axonale arbor kleuring werd beoordeeld door de aanwezigheid van afgeknotte takken met open uitgangen aan de boven- of de onderkant van het segment of door een kleuring die beperkt tot het eerste segment van de axon en zeer proximale takken was. Figuur 4 geeft de voorbeelden van een goede en een slechte HRP kleuring volgende biocytin visualisatie.

Morfometrische analyse van 3D-reconstructies (Figuur 3) kan worden uitgevoerd om aan te tonen van de tak complexiteit, soma oppervlakte en de oppervlakte en het volume van de dendritische en axonale arbors.

figure-results-1
Figuur 1 : Neuronale reconstructies van twee soorten mand cellen opgenomen en in de hippocampal regio van CA2 gevuld en gecorreleerd elektrofysiologische gegevens die zijn verkregen na intracellulaire opnames in vitro. Dit cijfer is gewijzigd van eerdere studies23,24. ZO Stratum Oriens, SP Stratum Pyramidale, SR Stratum Radiatum, SLM Stratum Lacunosum Moleculare. (A) Aa: reconstructie van een cel mand CA2 met beperkte dendritische en axonale prieel met behulp van een tekening buis (1000 X). De dendrites zijn in het zwart, en de axon is in het rood. AB: Afbeelding van de cel van de biocytin gevulde mand na het protocol van de avidin-HRP hier beschreven. AC: Vertegenwoordiger spoor van spanning reacties op hyperpolarizing en depolarizing van de huidige injectie van een cel mand CA2 met beperkte dendritische en axonale arbor. AD: Voorbeeld van een piramide CA2 te smal arbor mand cel verbindingen opgenomen met behulp van scherpe elektroden. Samengestelde excitatory post synaptic potentieel (EPSP) gemiddelden Toon korte trein depressie blijkt tijdens reacties op treinen van drie pieken. (B) Ba: 2D wederopbouw van een cel mand CA2 met brede dendritische en axonale arbors met behulp van een tekening buis (1000 X). De dendritische boom van deze mand cel (in zwart) uitgebreid radiaal door alle lagen van de CA2 regio en horizontaal in SO, SP van de CA2 en CA3 regio's. Een horizontale dendriet bereikt ook de CA1-regio. De axon (in rood) uitgebreid tot de CA3 en CA1 regio's. BB: De biocytin gevulde (AMCA kleuring) mand cel was PV-immunopositive (FITC kleuring) en CB-immunonegative (Texas-rood kleuring). BC: Vertegenwoordiger spoor van spanning reacties op hyperpolarizing en depolarizing van de huidige injectie van een cel mand CA2 met brede dendritische en axonale arbor. BD: Samengestelde EPSP gemiddelden Toon korte trein versoepeling duidelijk tijdens reacties op treinen van drie pieken. Voorbeelden van andere soorten interneuronen opgenomen in CA2 kunnen worden gevonden in eerdere studies25,30. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer. 

figure-results-2
Figuur 2 : 3D cel lichaam wederopbouw. (A) 3D tracering van de cel lichaam. Weergave van de verschillende contouren getraceerd op verschillende z posities, terwijl zich te concentreren door de cel lichaam. (B) 3D-weergave van de verschillende contouren. (C) 3D-weergave van de cel lichaam onder een verschillende hoek. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer. 

figure-results-3
Figuur 3 : Morphometry analyses van 3D-neuronale reconstructies. (A) 3D reconstructie van een CA2 smalle arbor mand cel. Elke dendritische tak wordt vertegenwoordigd door een kleur (groen, blauw, rood en roze) en axon is in lichtblauw. (B) Dendrogram van de mand cel vertegenwoordigt het nummer van dendritische takken en de lengte van elk segment dat deel uitmaakt van bollen concentrische met het soma en 100 μm tussenpozen van het soma. De kleuren op de dendrogram overeenkomen met die van de dendrites in A. (C) voorbeeld van Morfometrische analyse uitgevoerd op piramidale cellen CA2 (aangepast van een eerdere studie23). Het aantal dendritische takken was uitgezet tegen de afstand van het soma CA2 piramidale cellen. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer. 

figure-results-4
Figuur 4 : Voorbeelden van goede (A) en slechte (B) HRP kleuring. (A) herstel van de Biocytin bleek een zeer goed gevulde interneuron in CA2. Het lichaam van de cel (CB) is donker gekleurd en heeft duidelijke contouren. De dendrites zijn kraaltjes en sommige stekels (vertegenwoordigd door de rode sterren) weergegeven. De axonale arbor (A) is dicht en presenteert kleine los. (B) voorbeeld van een arme, dendritische en axonale kleuring van 2 piramidale cellen in CA2. De kleuring van het CB is flauw met geen duidelijk overzicht. Slechte kleuring wordt vaak geassocieerd met kortere elektrofysiologische opnames wat resulteert in de aanwezigheid van zeer weinig biocytin gevulde takken. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer. 

Video 1: 3D neuronale reconstructie van een cel mand CA2 met beperkte dendritische arbor (ook CA2 smalle arbor mand cel genoemd) met haar soma in stratum pyramidale, dendrites verspreid over alle lagen en axon in CA2 stratum pyramidale en aangrenzende stratum oriens en radiatum. Heel weinig takken bereikt de proximale CA3 stratum oriens en CA3 stratum pyramidale. Deze cel was gevuld met biocytin na elektrofysiologische opnames en secties werden verwerkt met avidin-HRP volgens het protocol beschreven hier. Als gevolg van snijden, werd alleen de axon binnen de diepte van het segment teruggevonden, hoewel de dendrites intact zijn. Dendrites zijn in donker roze en axon in wit. Laag en regio grenzen zijn toegevoegd aan het begin van de video. 3D reconstructie door Georgia Economides-3D video door Svenja Falk. De video werd opgenomen met een neuron wederopbouw software zoals in stap 2.17 en bewerkt met een video-editing software. Link naar de video:30. Klik hier om deze video te downloaden.

Oplossingen gebruiktSamenstelling/instructies
Fixatie oplossingparaformaldehyde 4%, 0,2% verzadigd pikrinezuur oplossing, 0,025% Glutaaraldehyde in 0,1 M fosfaatbuffer (PB)
0,1 M fosfaatbuffer pH 7,6Voeg 100 mL 1 M fosfaat Buffer voorraad tot 900 mL gedestilleerd water
Fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) pH 7.4/7.5Voeg 10 mL 0,1 M fosfaatbuffer, 0.2 g KCl en 8.76 g NaCl tot 990 mL gedestilleerd water
TRIS buffer pH 7.5Los 5,72 g van Tris Hydrochloride en 1,66 g van Tris Base in 50 mL gedestilleerd water. Maak vervolgens met gedestilleerd water aan tot 1 liter.
Gebufferde Glutaaraldehyde en paraformaldehyde kleefpoeders oplossingparaformaldehyde 4%, 0,2% verzadigd pikrinezuur oplossing, 0,025% Glutaaraldehyde in 0,1 M fosfaatbuffer.
ABC oplossingOplossing voor ten minste 30 minuten vóór gebruik van de ABC-kit worden gemaakt. 1 druppel van oplossing A en 1 druppel van oplossing B toevoegen aan 2,5 mL PBS.
Durcupan epoxyhars:Om 20 potten: 20 g van onderdeel A, 20 g van onderdeel B, 0.6 g van onderdeel C en 0,4 g van onderdeel D -
Beschermen de balans tegen morsen van vloeistoffen door die betrekking hebben op de plaat met een cirkel filtreerpapier. Weeg zorgvuldig de reagentia in een bekerglas van de tripour in de verhoudingen die hierboven vermeld. Meng door krachtig roeren met behulp van twee houten stokken voor minstens 5 min. Het mengsel moet een uniforme dichtheid donkerbruine kleur geworden. Plaats het bekerglas in de oven bij ~ 50 ° C voor een maximum van 10 min zo veel luchtbellen verwijderen als mogelijk. Opmerking: De hars begint te genezen als u buiten beschouwing het bekerglas in de oven langer dan 10 min. Decant de hars in kunststof potten of 5 mL spuiten laten, datum van hen en opslaan in de-20 ° C diepvries klaar voor gebruik.

Tabel 1: Tabel van oplossingen. 

Discussie

Elektrofysiologische opnames in vitro (Figuur 1 Ac,d en v.Chr., d) gecombineerd met histochemische en immunohistochemische procedures stellen de gedetailleerde morfologie, bindende eiwit calciumgehalte en identiteit van volwassen corticale interneuronen geregistreerd te worden onthuld. In de CA2-regio, deze techniek toegestaan van de studie van het lokale circuit voor de eerste keer en subklassen van interneuronen die had niet eerder zijn beschreven in CA1 of CA3 geopenbaard: breed dendritische en axonale arbor mand cellen (figuur 1B), bistratified cellen en SP-SR interneuronen.

Het protocol hier beschreven is geoptimaliseerd om de ultrastructuur van de neuronen te behouden en verkrijgen van uitstekende herstel van dendritische (inclusief stekels) én axonale arbors. Kritische stappen omvat het gebruik van de dubbele fixatie techniek om het contrast voor de lichte microscopie van26 verbeteren en de toevoeging van de kleefpoeders oplossing voor verbeteren van antilichaam penetratie en het behoud van de neuronale Glutaaraldehyde en pikrinezuur oplossing ultrastructuur27. Zachte bevriezen-ontdooien permeabilization geeft beter behoud van de fijne structuur, terwijl osmication en hars inbedding z-plane krimp28 verminderen. Bovendien, is de visualisatie van zeer fijne structuren (fijne axonen met kleine los bijvoorbeeld) verbeterd door de secties met H2O2 en NaBH4 om achtergrondkleuring aan het broeden. Contrast kan ook worden verhoogd met de toevoeging van NiCl2 tot de HRP-reactie.

De histologische procedure hier biedt uitstekende resultaten op het gebied van de reproduceerbaarheid en betrouwbaarheid. Echter, de duur van de elektrofysiologische opnames zal bepalen de kwaliteit van de biocytin/fluorescentie kleuring, met kortere opnames meestal geassocieerd met de slechte axonale kleuring. De keuze voor het opnemen van protocollen (intracellulaire opnamen met behulp van scherpe elektroden vs. geheel-cel patch klemmen) kan ook van invloed biocytin bewaring en het behoud van de fijne anatomie.

Terwijl de problemen de fijne structuur behouden tijdens histologische verwerking die hier worden beschreven en de tijd die nodig is te reconstrueren op 100 X vergroting (1-4weeks afhankelijk van de complexiteit van de axon) worden gewaardeerd, deze methode geeft een accurate weergave van dendritische en axonale diameters. Het gebruik van minder veeleisende protocollen te onthullen biocytin-etikettering is begrijpelijk, evenwel dat deze vaak duidelijk visualisatie van fijne axonale takken. Wasmiddelen, ter bevordering van de toetreding van Avidin-HRP te onthullen van de biocytin en de antilichamen, vaak noodzakelijk zijn in het dik secties, maar fijne structuur kunnen verstoren. Neurowetenschappers zoeken voortdurend voor semi-automatische methoden van wederopbouw, maar voor blijft nu en voor met name biocytin-HRP axonen met handmatige wederopbouw de goudstandaard31.

Zeer gedetailleerd neuronale reconstructies, vooral nauwkeurige tekeningen van axonale los en knooppunten, de aanwezigheid of afwezigheid van myeline en meer in het algemeen de tekening van volledige axonale arbor, met de voorstelling van nauwkeurig axon-diameter langs verandert haar lengte, nadere informatie voor nauwkeurige identificatie van een verschillend type van interneurone. Hoewel veel interneuronen niet precies in een specifieke klasse passen kunnen, oplevert de techniek hierboven beschreven gecorreleerde gegevens over neuronale elektrofysiologische eigenschappen, de korte plasticiteit gekoppeld aan een specifiek type van verbinding en gedetailleerde neuronale reconstructies, waardoor het bedradingsschema, CA2 regio, bijvoorbeeld, tot in detail worden bestudeerd.

Mooie, gedetailleerde structuur is vaak vereenvoudigd in rekenmodellen. Terwijl begrijpelijk, resulteert dit in het verlies van de gegevens die in de toekomst kritiek zou kunnen blijken. Analyse van gedetailleerde 3D-reconstructies met parallelle synaptic gegevens kan de toevoeging van verdere criteria voor interneuronal indeling. Gegevens kunnen worden gestort in openbare bewaarplaatsen en gebruikt door modelbouwers te verkennen van het resultaat van sporadische veranderingen in de diameter van de axon en myelinisering over actiepotentiaal teeltmateriaal computationeel.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

Dit onderzoek heeft financiering ontvangen van Novartis Pharma (Bazel) en de medische Raad voor onderzoek toegekend aan Prof Alex Thomson, de biotechnologie en de biologische Sciences Research Council (BBSRC-BB/G008639/1), de fysiologische samenleving, de Europese Unie de Horizon 2020 kaderprogramma voor onderzoek en innovatie onder de specifieke Grant overeenkomst No. 720270 (menselijk brein Project SGA1) en onder de specifieke Grant overeenkomst No. 785907 (menselijk brein Project SGA2). We zijn zeer dankbaar Prof Alex Thomson voor het opzetten van het protocol in andere corticale gebieden, het garanderen van de financiering voor haar voortdurende steun voor dit project. Bijdragen van lab-leden die hebben geholpen met het optimaliseren van het protocol van herstel en gereconstrueerd CA2 neuronen dankbaar zijn erkend: J. Deuchars, H. Pawelzik, D. I. Hughes, A. P. Bannister, K. Eastlake, H. Trigg, N. A. Botcher.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Avidin-7-amino-4-methylcoumarine-3-azijnzuur (Avidin-AMCA) antilichaam- 20,8 mg/mL Vector laboratoriesA2008
Biocytine  ≥98% (TLC)SigmaB4261
3,5 diaminobenzidine (DAB) tablet, Voor het bereiden van 5 mLSigmaD4293
Durcupan epoxyhars ASigma44611
Durcupan epoxyhars BSigma44612
Durcupan epoxyhars CSigma44613
Durcupan epoxyhars DSigma44614
Ethanol, puriss. p.a., absoluut, ≥99,8%Sigma32221
GelatineSigma48723
Glutaraldehyde-oplossing, graad I, 25 % in H2OSigmaG5882
Glycerol, ≥99% SigmaG5516
GeitenserumSigmaG9023
Geiten-anti-muis fluoresceine isothiocyanate (FITC)- 14,3 mg/mLSigmaF2653
Geiten-anti-konijn Texas Red (TR)- 3,3 mg/mLInvitrogenT2767
Waterstofperoxide, 30% oplossingSigmaH-1009
Dompelolie, viscositeit 1.250 cSt (lit.)SigmaI0890
Nikkelchloride (NiCl2 . 6H2O)Sigma N5756
Osmiumtetraoxide, voor elektronenmicroscopie, 4% in H2O Sigma75632
Paraformaldehyde, reagentiakwaliteit, kristallijn SigmaP6148
Picrinezuur, bevochtigd met water, ≥98%Sigma197378
Fosfaatbuffer 1 MSigmaP3619
Propyleenoxide (C3H6O), 99%Alfa Aesar 30765
NatriumtetrahydroboraatVWR27885.134
SucroseFisher scientificS/8600/53
Trizma hydrochloride, ≥99,0%SigmaT5941
Trizma base, ≥99,9%SigmaT6066
Vectashield Antifade Montagemedium,, brekingsindex 1,45 Vector laboratoriesH-1000
Vectastain Elite ABC HRP kitVector laboratoriesPK6100
Gebruikte apparatuur 
VibratomeAgar Scientific
C4A Cupped aluminium planchettes GA-MA & ASSOCIATES, INC.
Leica DMR microscoop Leica Microsystems
X-Cite 120PC Q  fluorescentielichtbron Excelitas Technologies 
Leica DFC450 digitale microscoopcamera Leica Microsystems 
Rapidograph technisch tekenpen 0,18mm London graphics centre
0,18 mm rapidograph penpuntLondon graphics centre
Rapidograph technisch tekenpen 0,25mm London graphics centre
0,25 mm rapidograph penpuntLondon graphics centre
Neurolucida-systeem inclusief PC-werkstation, stage, camera en joystick voor XYZ-stagebesturingMicrobrighfield (MBF) Bioscience
Neurolucida-software versie 2017Microbrighfield (MBF) Bioscience
CorelDRAW graphics Suite X5Corel
Videobewerkingssoftware Adobe Premiere Pro
Glazerne flesjes 14 mLFisher scientific 

Referenties

  1. Klausberger, T., Somogyi, P. Neuronal diversity and temporal dynamics: the unity of hippocampal circuit operations. Science. 321, 53-57 (2008).
  2. DeFelipe, J., et al. New insights into the classification and nomenclature of cortical GABAergic interneurons. Nature Reviews Neuroscience. 14 (3), 202-216 (2013).
  3. Bezaire, M. J., Soltesz, I. Quantitative assessment of CA1 local circuits: knowledge base for interneuron-pyramidal cell connectivity. Hippocampus. 23, 751-785 (2013).
  4. Katona, L., et al. Behavior-dependent activity patterns of GABAergic long-range projecting neurons in the rat hippocampus. Hippocampus. 27, 359-377 (2017).
  5. Ali, A. B., Thomson, A. M. Facilitating pyramid to horizontal oriens-alveus interneurone inputs: dual intracellular recordings in slices of rat hippocampus. Journal of Physiology. 507, 185-199 (1998).
  6. Ali, A. B., Thomson, A. M. Synaptic alpha 5 subunit-containing GABAA receptors mediate IPSPs elicited by dendrite-preferring cells in rat neocortex. Cerebral Cortex. 18, 1260-1271 (2008).
  7. Ali, A. B., Bannister, A. P., Thomson, A. M. Robust correlations between action potential duration and the properties of synaptic connections in layer 4 interneurones in neocortical slices from juvenile rats and adult rat and cat. Journal of Physiology. 580, 149-169 (2007).
  8. Pawelzik, H., Bannister, A. P., Deuchars, J., Ilia, M., Thomson, A. M. Modulation of bistratified cell IPSPs and basket cell IPSPs by pentobarbitone sodium, diazepam and Zn2+: dual recordings in slices of adult rat hippocampus. European Journal of Neuroscience. 11, 3552-3564 (1999).
  9. Pawelzik, H., Hughes, D. I., Thomson, A. M. Physiological and morphological diversity of immunocytochemically defined parvalbumin-and cholecystokinin-positive interneurones in CA1 of the adult rat hippocampus. Journal of Comparative Neurology. 443, 346-367 (2002).
  10. Thomson, A. M., Lamy, C. Functional maps of neocortical local circuitry. Frontiers of Neuroscience. 1, 19-42 (2007).
  11. Kepecs, A., Fishell, G. Interneuron cell types are fit to function. Nature. 505 (7483), 318-326 (2014).
  12. Wilent, W. B., Nitz, D. A. Discrete Place Fields of Hippocampal Formation Interneurons. Journal of Neurophysiology. 97, 4152-4161 (2007).
  13. Hirsch, J. A., Martinez, L. M. Laminar processing in the visual cortical column. Current Opinion in Neurobiology. 16 (4), 377-384 (2006).
  14. Kay, K., Sosa, M., Chung, J. E., Karlsson, M. P., Larkin, M. C., Frank, L. M. A hippocampal network for spatial coding during immobility and sleep. Nature. 531, 185-190 (2016).
  15. Yu, J. Y., et al. Distinct hippocampal-cortical memory representations for experiences associated with movement versus immobility. eLife. 6, e27621(2017).
  16. Markram, H., et al. Reconstruction and Simulation of Neocortical Microcircuitry. Cell. 163, 456-492 (2015).
  17. Van Geit, W., et al. BluePyOpt: Leveraging Open Source Software and Cloud Infrastructure to Optimise Model Parameters in Neuroscience. Frontiers in Neuroinformatics. 10, 17(2016).
  18. Gal, E., et al. Rich cell-type-specific network topology in neocortical microcircuitry. Nature Neuroscience. 20, 1004-1013 (2017).
  19. Thomson, A. M., West, D. C., Wang, Y., Bannister, A. P. Synaptic connections and small circuits involving excitatory and inhibitory neurons in layers 2-5 of adult rat and cat neocortex: triple intracellular recordings and biocytin labeling in vitro. Cerebral Cortex. 12, 936-953 (2002).
  20. Mercer, A., West, D. C., Morris, O. T., Kirchhecker, S., Kerkhoff, J. E., Thomson, A. M. Excitatory connections made by presynaptic cortico-cortical pyramidal cells in layer 6 of the neocortex. Cerebral Cortex. 15, 1485-1496 (2005).
  21. West, D. C., Mercer, A., Kirchhecker, S., Morris, O. T., Thomson, A. M. Layer 6 cortico-thalamic pyramidal cells preferentially innervate interneurons and generate facilitating EPSPs. Cerebral Cortex. 16, 200-211 (2006).
  22. Bannister, A. P., Thomson, A. M. Dynamic properties of excitatory synaptic connections involving layer 4 pyramidal cells in adult rat and cat neocortex. Cerebral Cortex. 17, 2190-2203 (2007).
  23. Mercer, A., Trigg, H. L., Thomson, A. M. Characterization of neurons in the CA2 subfield of the adult rat hippocampus. Journal of Neuroscience. 27 (7), 7329-7338 (2007).
  24. Mercer, A., Eastlake, K., Trigg, H. L., Thomson, A. M. Local circuitry involving parvalbumin-positive basket cells in the CA2 region of the hippocampus. Hippocampus. 22 (1), 43-56 (2012).
  25. Mercer, A., Botcher, N. A., Eastlake, K., Thomson, A. M. SP-SR interneurones: a novel class of neurones of the CA2 region of the hippocampus. Hippocampus. 22 (8), 1758-1769 (2012).
  26. Sabatini, D. D., Bensch, K., Barrnett, R. J. Cytochemistry and electron microscopy: The Preservation of Cellular Ultrastructure and Enzymatic Activity by Aldehyde Fixation. Journal of Cell Biology. 17, 19-58 (1963).
  27. Somogyi, P., Takagi, H. A note on the use of picric acid-paraformaldehyde-glutaraldehyde fixative for correlated light and electron microscopic immunocytochemistry. Neuroscience. 7, 1779-1783 (1982).
  28. Hughes, D. I., Bannister, A. P., Pawelzik, H., Thomson, A. M. Double immunofluorescence, peroxidase labelling and ultrastructural analysis of interneurones following prolonged electrophysiological recordings in vitro. Journal of Neuroscience Methods. 101, 107-116 (2000).
  29. Botcher, N. A., Falck, J. E., Thomson, A. M., Mercer, A. Distributions of interneurones in the CA2 region of the rat hippocampus. Frontiers in Neuroanatomy. 8, 104(2014).
  30. Mercer, A., Thomson, A. M. Cornu Ammonis Regions-Antecedents of Cortical Layers? Frontiers in Neuroanatomy. 11, 83(2017).
  31. Blackman, A. V., Grabuschnig, S., Legenstein, R., Sjöström, P. J. A comparison of manual neuronal reconstruction from biocytin histology or 2-photon imaging: morphometry and computer modeling. Frontiers in Neuroanatomy. 8, 65(2014).

Herprints en machtigingen

Trefwoorden

3D reconstructieinterneuroonmorfologieelektrofysiologische registratievibratoomsnijdenavidine HRP reactieosmiumtetroxide kleuringcalciumbindend eiwitfluorescentiebeeldvorming
Biocytin herstel en 3D-reconstructies van gevulde Hippocampal CA2 interneuronen
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleid

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.