Presenteren we een protocol om te evalueren van de expressie niveaus van circulerende microRNA (miRNAs) in plasma monsters van kankerpatiënten. In het bijzonder, hebben we gebruikt een verkrijgbare kit voor circulerende miRNA extractie en omgekeerde transcriptie. Ten slotte, geanalyseerd wij een panel van 24 geselecteerde miRNAs met behulp van real-time vooraf gevlekte sonde aangepaste platen.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Detectie van een circulerende MicroRNA Custom Panel bij patiënten met uitgezaaide darmkanker
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Er is steeds meer belangstelling in vloeibare biopsie voor kanker-diagnose, prognose en therapeutische monitoring, de behoefte aan betrouwbare en nuttige biomarkers voor de klinische praktijk te maken. Hier presenteren we een protocol wilt ophalen, omgekeerde transcriberen en evalueren van de expressie niveaus van circulerende miRNAs uit plasma monsters van patiënten met een colorectaal carcinoom (CRC). microRNAs (miRNAs) vormen een klasse van niet-coderende RNAs van 18-25 nucleotiden in lengte die de uitdrukking van de doelgenen translationeel niveau regelen en spelen een belangrijke rol, met inbegrip van de pro - en anti-angiogenic functie, in de fysiopathologie van verschillende organen. miRNAs zijn stabiel in biologische vloeistoffen zoals serum en plasma, waardoor ze ideale circulerende biomarkers voor kanker-diagnose, prognose en behandeling besluitvorming en controle. MiRNA extractie circulerende werd uitgevoerd met behulp van een snelle en effectieve methode, waarbij zowel organische als kolom gebaseerde methoden. Voor miRNA retrotranscription gebruikten we een scriptingregel procedure dat polyadenylatie op 3' en de afbinding van een adapter op 5' van de volwassen miRNAs acht, gevolgd door willekeurige miRNA pre versterking. Wij een 24-miRNA aangepaste panel te worden getest door kwantitatieve real-time polymerasekettingreactie (qRT-PCR) geselecteerd en de miRNA sondes gespot op matrix aangepaste platen. Wij uitgevoerd qRT-PCR plaat draait op een real-time PCR-systeem. Huishouden miRNAs voor normalisatie zijn gekozen aan de hand van de GeNorm software (v. 3.2). Gegevens zijn geanalyseerd met behulp van de software van de suite van de expressie (v 1.1) en statistische analyses werden uitgevoerd. De methode bleek te zijn betrouwbaar en technisch robuust en nuttig kan zijn voor het evalueren van biomerker niveaus in vloeibare monsters zoals plasma en/of serum.
Inleiding
CRC vertegenwoordigt de derde meest voorkomende gediagnosticeerd maligniteit en de vierde oorzaak van kanker sterfgevallen wereldwijd. Tot op heden zijn voor bevacizumab (B), een monoclonal antilichaam gericht tegen de vasculaire endotheliale groeifactor (VEGF), en cetuximab (C) of panitumumab (P), monoklonale antilichamen gericht tegen epidermale groeifactor receptor (EGFR), goedgekeurd eerstelijns behandeling in combinatie met chemotherapie (CT) regimes.
Mutaties in de genen van K-RAS en N-RAS zijn de enige klinisch nuttig biomarkers staat van identificatie van de patiënten die zijn minste kans om te profiteren van de an....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Opmerking: Alle van de volgende stappen uit onder een gesteriliseerde zuurkast volgens goede laboratorium praktijk (GLP) uitvoeren.
1. plasma inzameling en opslag
- Verzamelen van 3 mL van perifeer bloedmonster in de buis van een K3E EDTA.
- Centrifugeer de buis bij kamertemperatuur bij 1,880 x g gedurende 15 minuten.
- Het supernatant plasma in porties van 450 µL herstellen.
- De monsters bij-80 ° C bewaren tot gebruik.
Opmerking: Proces de perifeer bloed buis binnen 2 uur van collectie. Wanneer het herstellen van het plasma van de buis, de lymfocyt laag niet sto....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
We een panel van angiogenese-gerelateerde circulerende miRNAs in verband met de progressie-vrije overleving (PFS) geanalyseerd, totale overleving (OS) en objectieve reactie (ORR) stem in een 52 mCRC patiënten behandeld met B gebaseerde CT. De evaluatie van dergelijke biomarkers in plasma monsters is uitdagend vanwege technische problemen. We gebruikten gevestigde methodes voor miRNA extractie van patiënt plasma monsters, omgekeerde transcriptie en pre versterking. Na instructies van de fa.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
miRNAs zijn kleine niet-coderende RNAs (18-25 nucleotiden in lengte) staat de 3' UTR regio van hun doel messenger RNA bindend en remmen en/of vernederende het. Zij kunnen dus gen expressie regelgevers op translationeel niveau worden beschouwd. In het laatste decennium, hebben verschillende miRNAs zijn gecorreleerd met kanker inleiding en ontwikkeling, waardoor ze nuttig klinische biomarkers voor diagnose, prognose en therapie. Beschermd door RNases, zijn miRNAs aanwezig in een stabiele vorm in biologische vloeistoffen zo.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben geen conflicten van belang om te vermelden.
Dankbetuigingen
Deze studie werd gedeeltelijk gefinancierd door Roche S.p.A. en de Italiaanse geneesmiddelen Agentschap (AIFA).
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Rnase-free Safe-lock 1.5 mL tubes | Eppendorf | 0030 123.328 | |
| Rnase-free Safe-lock 2 mL tubes | Eppendorf | 0030 123.344 | |
| Rnase-free 20 µL tips | Starlab | S1123-1810 | |
| Rnase-free 200 µL tips | Starlab | S1120-8810 | |
| Rnase-free 1,000 µL tips | Starlab | S1122-1830 | |
| mirVana PARIS RNA and Native Protein Purification Kit | Thermo Fisher | AM1556 | |
| TaqMan Advanced miRNA cDNA Synthesis Kit | Thermo Fisher | A28007 | |
| 100% ethanol anidrous ACS grade | Carlo Erba Reagents | 414605 | |
| 2-mercapto-ethanol | Sigma-Aldrich | M3148 | |
| TaqMan Fast Advanced Master Mix | Thermo Fisher | 4444558 | |
| TaqMan Advanced miRNA Assays | Thermo Fisher | A25576 | |
| 7500 Real-Time PCR System | Applied Biosystems | 4406984 | |
| 0.2-2, 1-10, 2-20, 20-200, 100-1,000 µL laboratory pipettes | |||
| Benchtop microcentrifuge | |||
| Vortex | |||
| Benchtop heating block | |||
| Fume hood | |||
| 0.2 mL PCR tubes |
Referenties
- Luo, H. -Y., Xu, R. -H. Predictive and prognostic biomarkers with therapeutic targets in advanced colorectal cancer. World journal of gastroenterology. 20 (14), 3858-3874 (2014).
- Toiyama, Y., Okugawa, Y., Fleshman, J., Richard, C., Goel, A.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
