Detectie van een circulerende MicroRNA Custom Panel bij patiënten met uitgezaaide darmkanker

Samenvatting

Presenteren we een protocol om te evalueren van de expressie niveaus van circulerende microRNA (miRNAs) in plasma monsters van kankerpatiënten. In het bijzonder, hebben we gebruikt een verkrijgbare kit voor circulerende miRNA extractie en omgekeerde transcriptie. Ten slotte, geanalyseerd wij een panel van 24 geselecteerde miRNAs met behulp van real-time vooraf gevlekte sonde aangepaste platen.

Samenvatting

Er is steeds meer belangstelling in vloeibare biopsie voor kanker-diagnose, prognose en therapeutische monitoring, de behoefte aan betrouwbare en nuttige biomarkers voor de klinische praktijk te maken. Hier presenteren we een protocol wilt ophalen, omgekeerde transcriberen en evalueren van de expressie niveaus van circulerende miRNAs uit plasma monsters van patiënten met een colorectaal carcinoom (CRC). microRNAs (miRNAs) vormen een klasse van niet-coderende RNAs van 18-25 nucleotiden in lengte die de uitdrukking van de doelgenen translationeel niveau regelen en spelen een belangrijke rol, met inbegrip van de pro - en anti-angiogenic functie, in de fysiopathologie van verschillende organen. miRNAs zijn stabiel in biologische vloeistoffen zoals serum en plasma, waardoor ze ideale circulerende biomarkers voor kanker-diagnose, prognose en behandeling besluitvorming en controle. MiRNA extractie circulerende werd uitgevoerd met behulp van een snelle en effectieve methode, waarbij zowel organische als kolom gebaseerde methoden. Voor miRNA retrotranscription gebruikten we een scriptingregel procedure dat polyadenylatie op 3' en de afbinding van een adapter op 5' van de volwassen miRNAs acht, gevolgd door willekeurige miRNA pre versterking. Wij een 24-miRNA aangepaste panel te worden getest door kwantitatieve real-time polymerasekettingreactie (qRT-PCR) geselecteerd en de miRNA sondes gespot op matrix aangepaste platen. Wij uitgevoerd qRT-PCR plaat draait op een real-time PCR-systeem. Huishouden miRNAs voor normalisatie zijn gekozen aan de hand van de GeNorm software (v. 3.2). Gegevens zijn geanalyseerd met behulp van de software van de suite van de expressie (v 1.1) en statistische analyses werden uitgevoerd. De methode bleek te zijn betrouwbaar en technisch robuust en nuttig kan zijn voor het evalueren van biomerker niveaus in vloeibare monsters zoals plasma en/of serum.

Inleiding

CRC vertegenwoordigt de derde meest voorkomende gediagnosticeerd maligniteit en de vierde oorzaak van kanker sterfgevallen wereldwijd. Tot op heden zijn voor bevacizumab (B), een monoclonal antilichaam gericht tegen de vasculaire endotheliale groeifactor (VEGF), en cetuximab (C) of panitumumab (P), monoklonale antilichamen gericht tegen epidermale groeifactor receptor (EGFR), goedgekeurd eerstelijns behandeling in combinatie met chemotherapie (CT) regimes.

Mutaties in de genen van K-RAS en N-RAS zijn de enige klinisch nuttig biomarkers staat van identificatie van de patiënten die zijn minste kans om te profiteren van de anti-EGFR-gebaseerde CT. Hoewel verschillende onderzoeken zijn uitgevoerd om te zoeken naar biomarkers die voorspellende van reactie op B gebaseerde CT zijn, is er nog steeds een aanzienlijk gebrek aan betrouwbare en effectieve geneesmiddelen voor gebruik in de klinische praktijk¹.

miRNAs zijn kleine RNAs (18-25 nucleotiden in de lengte) dat de vertaling van de doelgenen reguleren en een cruciale rol in tal van pathofysiologische processen, met inbegrip van de embryogenese en carcinogenese. Deze moleculen zijn zeer stabiel in biologische vloeistoffen zoals plasma/serum, urine en sputum, waardoor ze robuuste biomarkers voor niet-invasieve bemonstering²te gebruiken. Met behulp van een panel van miRNAs die betrokken zijn bij het angiogenic traject, wij gericht vast te stellen nieuwe circulerende biomarkers staat het voorspellen van klinische resultaten bij patiënten met metastatische CRC (mCRC) behandeld met B gebaseerde CT.

We analyseren van een reeks van 52 mCRC patiënten behandeld met B gebaseerde CT binnen de toekomstige multicentrische gerandomiseerde fase III trial "Italiaanse Trial in geavanceerde colorectaal carcinoom" (ITACa). Dit protocol is goedgekeurd door de lokale ethische Commissie (Comitato Etico gebied Vasta e Istituto Scientifico Romagnolo per lo Studio e la Cura dei Tumori (eerste) IRCCS, no. 674) op 19^th September 2007. Alle patiënten gaf geïnformeerde toestemming voordat bloed monster collectie. Voor elke patiënt, werden veneuze bloedmonsters verzameld vóór de behandeling en bij de eerste klinische evaluatie (na 8 weken) om basislijn miRNA expressie en haar modulatie tijdens behandeling met betrekking tot de patiënt resultaten te evalueren.

Via een zoekopdracht van de literatuur, die we geselecteerd 21 miRNAs gecorreleerd met het angiogenic-proces waarvan bekend is dat aantoonbaar in menselijk plasma: heeft-miR-107, heeft-miR-126-3 p heeft-miR-145-5 p, heeft-miR-194-5 p, heeft-miR-199a - 5p, heeft-miR-200b - 3p, heeft-miR-20b - 5p , heeft-miR-21-5 p, heeft-miR-210-3 p, heeft-miR-221-3 p, heeft-miR-24-3 p, heeft-miR-27a - 3p, heeft-miR - 29 ter - 3p, heeft-miR-335-5 p, heeft-miR-424-5 p, heeft-miR-497-5 p, heeft-miR - 520d - 3p, heeft-miR-92a - 3p, heeft-miR-17-5-p en heeft-miR-155-5 p. Wij ook geselecteerd heeft-miR-223-3 p en heeft-mir-484 endogene normalisatie^3,,^4,,^5,6, en cel-miR-39 gezuiverd van C. elegans als een piek voor exogene normalisatie. Alle gegevens belangrijk waren uitgevoerd met behulp van de methode van de ̄(ΔΔCt) 2 ̂.

De detectie van circulerende miRNAs presenteert enkele technische problemen omdat de moleculen aanwezig op een zeer laag niveau in plasma zijn en hun versterking chemisch uitdagende gezien hun korte opeenvolging is. Wij hebben gekozen om deze redenen een procedure dat zowel organische extractie met fenol en een glasvezel kolom gebaseerde methodiek acht. Circulerend miRNA extractie is een hot topic op het gebied van vloeibare biopsie, en we kozen een commerciële kit die heeft aangetoond dat een van de meest betrouwbare in termen van hoeveelheid en de kwaliteit van de herstelde opbrengsten^7,8. We kozen een protocol om te keren het transcriberen van miRNAs door de toevoeging van een adapter op 5' en een poly(A) staart naar 3' van de volwassen miRNA ter verbetering van de selectiviteit en de specificiteit van de reactie.

Gezien de robuustheid van de methode, wij ontwierp aangepaste borden met vooraf gevlekte sondes voor RT-PCR te beoordelen van elk monster in tweevoud en geanalyseerd 2 patiënten binnen elke plaat, zoals afgebeeld in figuur 1.

Protocol

Opmerking: Alle van de volgende stappen uit onder een gesteriliseerde zuurkast volgens goede laboratorium praktijk (GLP) uitvoeren.

1. plasma inzameling en opslag

1. Verzamelen van 3 mL van perifeer bloedmonster in de buis van een K3E EDTA.
2. Centrifugeer de buis bij kamertemperatuur bij 1,880 x g gedurende 15 minuten.
3. Het supernatant plasma in porties van 450 µL herstellen.
4. De monsters bij-80 ° C bewaren tot gebruik.
   Opmerking: Proces de perifeer bloed buis binnen 2 uur van collectie. Wanneer het herstellen van het plasma van de buis, de lymfocyt laag niet storen.

2. extractie van circulerende miRNAs uit Plasma monsters (tabel of Materials)

1. Alle vereiste oplossingen voor te bereiden en ontdooien van de monsters voor de extractie stappen.
   1. 375 µL van 2-mercaptoethanol toevoegen aan de 2 x denaturating-oplossing en meng goed.
   2. Voeg 21 mL ACS grade 100% ethanol tot de miRNA wassen oplossing ik toe en meng goed.
   3. Voeg 40 mL ACS grade 100% ethanol tot de wash oplossing 2/3 en meng goed.
   4. Toestaan dat een plasma aliquoot ontdooien bij kamertemperatuur en dan beginnen de extractie stappen.
2. Biologische extractie
   1. Pipetteer 400 µL van het plasma monster in een tube 2 mL RNase-vrij.
   2. Voeg 400 µL van 2 x denaturating oplossing, Meng door vortexing en kort centrifugeren.
   3. Voeg 4 µL van 1 nM spike, Meng door vortexing en kort centrifugeren.
   4. Voeg 800 µL van zure fenol-chloroform.
   5. Vortex voor 60 s en centrifuge op maximale snelheid (≥10, 000 x g) gedurende 15 minuten.
   6. De bovenste waterfase overbrengen in een verse buis. De interfase niet storen. Opmerking het volume herstelde zich en negeren de buis met de niet-acqueous fase.
      Opmerking: De 2 x denaturering oplossing wordt opgeslagen bij 4 ° C en bij deze temperatuur kan stollen. Vóór gebruik, warme de oplossing tot 37 ° C, af en toe voor 10-15 min. schudden voorzichtig te trekken van de fase van de bodem met de zure fenol-chloroform, niet in het geval van de acqueous-buffer die op de top van het mengsel ligt. Verwarm de oplossing van de elutie of nuclease-gratis water tot 95 ° C. Wees voorzichtig om te verwarmen van een voldoende hoeveelheid oplossing (100 µL per monster + 10% teveel).
3. Kleine RNA verrijking
   1. 1/3 hoeveelheid ethanol 100% toevoegen aan de waterige fase vanaf stap 2.2.6 en meng.
   2. Plaats een filterelement in de buis van een frisse collectie voor elk monster.
   3. Overdracht van maximaal 700 µL van lysate van stap 2.3.1 en ethanol in de filter cartridge en centrifugeer bij 10.000 x g gedurende 30 s.
   4. Als er > 700 µL van het mengsel links, plaatst u het filtraat in een verse buis en herhaalt u stap 2.3.3; Herhaal totdat alle het mengsel door de filter cartridge is verstreken.
   5. Meten van het totale volume van de doorstroming.
   6. Voeg 2/3 hoeveelheid ethanol 100% filtraat en meng.
   7. Plaats een tweede filter cartridge in een frisse collectie buis.
   8. Breng maximaal 700 µL van monstervolume in de cartridge samen en centrifugeer bij 10.000 x g voor 30 s. negeren de doorstroming.
   9. Herhaal stap 2.3.8 totdat alle het mengsel door de filter cartridge is verstreken.
   10. 700 µL van miRNA wassen oplossing 1 van toepassing op het filterelement en Centrifugeer het filterpatroon met de collectie buis 10.000 x g gedurende 15 s. negeren de doorstroming. Plaats de cartridge filter in de dezelfde collectie buis.
   11. Breng 500 µL wassen oplossing 2/3 voor het filterelement en centrifuge het filterpatroon met de collectie buis 10.000 x g voor 15 s. negeren de doorstroming. Plaats de cartridge filter in een frisse collectie buis.
   12. Plaats de cartridge filter in een frisse collectie buis en herhaalt u stap 2.3.11 met 500 µL van wassen oplossing 2/3. Negeren de doorstroming en de filterpatroon overbrengen in een frisse collectie buis.
   13. Centrifugeer de buizen met de filterpatronen bij 10.000 x g gedurende 1 minuut.
   14. Breng het filterelement in een tube van de collectie verse 1,5 mL en voeg 100 µL voorverwarmde (95 ° C) elutie oplossing of nuclease-gratis water.
   15. Centrifugeer bij 10.000 x g gedurende 30 s miRNAs herstellen en opslaan bij-80 ° C.
       Opmerking: Een witte neerslag kan vormen in de wash oplossing 2/3. Dit is teveel EDTA vrijgelaten uit de oplossing. Vermijd deze kristallen opstellen tijdens de pipetting stappen.

3. uitvoeren van de omgekeerde transcriptie en miRNA pre versterking (tabel of Materials)

1. Uitvoeren van polyadenylatie reactie
   1. Ontdooi alle reagentia op het ijs, dan kort vortex en centrifuge te draaien naar de inhoud beneden. Bovendien, PEG dooi 50% 8000, zodat het bereiken van de kamertemperatuur.
   2. De mix van de reactie in een centrifugebuis 0,5 mL, verkrijgen een eindvolume van 3 µL van reactie cocktail voor elk monster voor te bereiden. Gebruik de volgende hoeveelheden, plus 10% extra volume voor elke reagens.
   3. Toevoegen van 1.7 µL van RNase-gratis water, 0,5 µL van 10 x Poly(A) buffer, 0,5 µL van 10 mM ATP en ten slotte 0,3 µL 5 U/µL PolyA enzym.
   4. Kort vortex en centrifuge de cocktail mix te draaien naar beneden van de inhoud.
   5. Breng 2 µL van het monster aan elk putje van de plaat van de reactie of de reactiebuis en voeg 3 µL van de reactie cocktail. Kort vortex en centrifuge te draaien naar beneden van de inhoud.
   6. Plaats de plaat/buizen in een thermische cycler en voer de volgende stappen uit.
   7. Incubeer bij 37 ° C gedurende 45 minuten (polyadenylatie stap).
   8. Incubeer bij 65 ° C gedurende 10 minuten (halte reactie), met een volgende houden bij 4 ° C.
2. De afbinding reactie uit te voeren.
   1. De mix van de reactie in een centrifugebuis met de volgende volumes voorbereiden op elke steekproef en 10% voor volume in overmaat.
   2. Voeg 0.4 µL van RNase-gratis water, 3 µL van 5 x DNA ligase buffer, 0.6 µL van 25 x afbinding adapter, 4.5 µL van 50% PEG 8000, en ten slotte 1.5 µL van RNA ligase.
   3. Kort vortex en centrifuge de cocktail mix te draaien naar beneden van de inhoud.
   4. 10 µL van het mengsel toevoegen aan elke goed/reactiebuis die het poly(A) tailing product bevatten. Meng door een plaat shaker van 1.900 toeren per minuut voor 1 min of kort vortexing en spin down de inhoud.
   5. Plaats de plaat/reactie buizen in een thermische cycler met de volgende instellingen: incubatie bij 60 ° C gedurende 60 minuten, met een volgende houden bij 4 ° C.
      Opmerking: 50% PEG 8000 is zeer viskeuze. Gebruiken bij kamertemperatuur, zuigen en verstrekking langzaam. Na elke aspiratie en verstrekking stap, houd de plugger voor 10 s om het reagens te stromen op en neer.
3. Het uitvoeren van de omgekeerde transcriptie reactie.
   1. De mix van de reactie in een centrifugebuis, met de volgende hoeveelheden voor elk monster en 10% voor volume in overmaat voor te bereiden.
   2. Voeg 3.3 µL van RNase-gratis water, 6 µL van 5 x RT buffer, 1.2 µL van dNTP mix (elke 25 mM), 1.5 µL van 20 x universele RT inleidingen, en ten slotte 3 µL van 10 x RT enzym mix.
   3. Kort vortex en centrifuge de cocktail mix te draaien naar beneden van de inhoud.
   4. 15 µL van het mengsel toevoegen aan elke goed/reactiebuis die het afbinding product bevatten. Meng door een plaat shaker van 1.900 toeren per minuut voor 1 min of kort vortexing en spin down de inhoud.
   5. Plaats de plaat/reactie buizen in een thermische cycler met de volgende instellingen.
   6. Incubeer bij 42 ° C gedurende 15 minuten (reverse transcriptie).
   7. Incubeer bij 85 ° C gedurende 5 minuten (stop reactie), met een volgende houden bij 4 ° C.
      Opmerking: De RT-product kan nu worden opgeslagen bij-20 ° C en maximaal 2 maanden stabiel zullen blijven.
4. Het uitvoeren van de miR-Amp reactie (tabel of Materials).
   1. De mix van de reactie in een centrifugebuis met de volgende volumes voorbereiden op elke steekproef en 10% voor volume in overmaat.
   2. 17.5 µL van RNase-gratis water, 25 µL van de 2 x miR-Amp master mix en 2.5 µL van 20 x miR-Amp primer mix toevoegen.
   3. Kort vortex en centrifuge de cocktail mix te draaien naar beneden van de inhoud.
   4. Voor elk monster, breng 45 µL van de reactie mix aan elk putje van een nieuwe reactie plaat of een reactiebuis. 5 µL van het RT product aan elke buis goed of reactie toevoegen. Meng door een plaat shaker van 1.900 toeren per minuut voor 1 min of kort vortexing en spin down de inhoud.
   5. Plaats de plaat/reactie buizen in een thermische cycler en run zoals aangegeven in tabel 1.

4. het uitvoeren van PCR in real time

1. Verdun elk cDNA monster 1:10 in 0.1 x TE buffer.
2. Bereken het aantal putten/replicatieonderzoeken voor elk monster. De mix van de reactie in een centrifugebuis met de volgende volumes voorbereiden op elk monster, 10% van het volume in overmaat toe te voegen.
3. 4 µL van RNase-gratis water, 10 µL van 2 x snel geavanceerde master mix (Tabel van materialen) en ten slotte 5 µL van verdunde cDNA toevoegen.
4. Mix van vortexing en kort centrifugeren om te draaien naar beneden van de inhoud.
5. Breng 19 µL van reactie mix te elk Nou, afdichting van de plaat en kort centrifugeren.
6. Het thermische protocol (tabel 2) op een RT-PCR-systeem uitvoeren

Resultaten

We een panel van angiogenese-gerelateerde circulerende miRNAs in verband met de progressie-vrije overleving (PFS) geanalyseerd, totale overleving (OS) en objectieve reactie (ORR) stem in een 52 mCRC patiënten behandeld met B gebaseerde CT. De evaluatie van dergelijke biomarkers in plasma monsters is uitdagend vanwege technische problemen. We gebruikten gevestigde methodes voor miRNA extractie van patiënt plasma monsters, omgekeerde transcriptie en pre versterking. Na instructies van de fa...

Discussie

miRNAs zijn kleine niet-coderende RNAs (18-25 nucleotiden in lengte) staat de 3' UTR regio van hun doel messenger RNA bindend en remmen en/of vernederende het. Zij kunnen dus gen expressie regelgevers op translationeel niveau worden beschouwd. In het laatste decennium, hebben verschillende miRNAs zijn gecorreleerd met kanker inleiding en ontwikkeling, waardoor ze nuttig klinische biomarkers voor diagnose, prognose en therapie. Beschermd door RNases, zijn miRNAs aanwezig in een stabiele vorm in biologische vloeistoffen zo...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Rnase-free Safe-lock 1.5 mL tubes	Eppendorf	0030 123.328
Rnase-free Safe-lock 2 mL tubes	Eppendorf	0030 123.344
Rnase-free 20 µL tips	Starlab	S1123-1810
Rnase-free 200 µL tips	Starlab	S1120-8810
Rnase-free 1,000 µL tips	Starlab	S1122-1830
mirVana PARIS RNA and Native Protein Purification Kit	Thermo Fisher	AM1556
TaqMan Advanced miRNA cDNA Synthesis Kit	Thermo Fisher	A28007
100% ethanol anidrous ACS grade	Carlo Erba Reagents	414605
2-mercapto-ethanol	Sigma-Aldrich	M3148
TaqMan Fast Advanced Master Mix	Thermo Fisher	4444558
TaqMan Advanced miRNA Assays	Thermo Fisher	A25576
7500 Real-Time PCR System	Applied Biosystems	4406984
0.2-2, 1-10, 2-20, 20-200, 100-1,000 µL laboratory pipettes
Benchtop microcentrifuge
Vortex
Benchtop heating block
Fume hood
0.2 mL PCR tubes