Methodenartikel

Spijsvertering van de lymfkliertest lever voor een analyse van de cytometrische stroom van lymfatische endotheliale cellen

DOI:

10.3791/58621

⸱

7 januari 2019

 ,  , 
1Division of Gastroenterology and Hepatology, Department of Medicine, University of Colorado Anschutz Medical Campus, School of Medicine, 2Department of Immunology and Microbiology, University of Colorado Anschutz Medical Campus

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het doel van dit protocol is het identificeren van lymfatische endothelial cel populaties binnen de lever beschreven markeringen gebruiken. Wij gebruiken collagenase IV en DNase en een zachte hakken van weefsel, gecombineerd met stroom cytometry, ter identificatie van een aparte populatie van lymfatische endotheliale cellen.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Binnen de lever, lymfevaten binnen de portal triad worden gevonden, en hun beschreven functie is om de interstitiële vloeistof van de lever naar de lymfeklieren waar cellulaire puin en antigenen kunnen worden onderzocht. Wij zijn zeer geïnteresseerd in het begrip van hoe de lymfatische therapieën kan worden betrokken bij de ontsteking en immuun cel functie binnen de lever. Echter zeer weinig is gepubliceerd tot oprichting van de spijsvertering protocollen voor de isolatie van lymfatische endotheliale cellen van de lever of de specifieke markeringen die kunnen worden gebruikt voor het evalueren van de lever (LECs) LECS-server op basis van de per cel. Daarom geoptimaliseerd we een methode voor de spijsvertering en de kleuring van de lever om te evalueren van de LEC-bevolking in de lever. Wij zijn ervan overtuigd dat de hier geschetste methode nuttig voor de identificatie en de isolatie van de LECS-server uit de lever zijn zal en ons begrip van hoe de LECS-server op de lever communicatie reageren zal versterken.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De rol van lymfevaten en de LECS-server in de lever niet goed wordt begrepen. Terwijl lymfevaten zijn te in de portal triade van de lever1 vinden en uit te tijdens ziekte2 breiden, is weinig begrepen met betrekking tot de functie en het fenotype van de LECS-server binnen de lever. Met de ontdekking van de markeringen die zijn gevonden voornamelijk op de LECS-server3, vult het belang van deze cellen binnen verschillende weefsel niches in de homeostase en ziekte een belangrijke leemte in ons begrip. LECS-server hebben een belangrijke rol bij het handhaven van perifere tolerantie in de lymfeklier en gemetastaseerde tumoren door direct interactief werken met T cellen4,5,6,7,8, 9 , 10 , 11 , 12 , 13. LECs in de lymfeklier protectieve immuniteit via hun interacties met15,16van de14,van de trekkende dendritische cellen kunnen bevorderen. Daarom zijn er meerdere functies voor LECs die specifiek zijn voor de weefsels en interacties waarin ze aanwezig zijn. Maar is weinig begrepen over hoe de LECS-server interactie met immune cellen in het weefsel of hoe LECs functioneren in verschillende orgaansystemen; Dus, LECs evalueren op basis van per cel binnen de lever of andere organen kan leiden tot vooruitgang in hoe LECs program weefsel-specifieke immuniteit. Terwijl veel van de literatuur die zich op de LECS-server in de lever richt microscopie gebruikt om te visualiseren LECS-server met behulp van één of twee markeringen en morfologie17, is heel weinig gedaan om de LECS-server specifiek te evalueren op basis van cel voor cel met behulp van stroom cytometry, hoewel een studie verschillen tussen sinusvormige endotheliale cellen van de lever (LSECs) en LECs18evalueren. Kunnend analyseren LEC populaties in de lever door stroom cytometry voorziet de grondige studie van LEC fenotype tijdens normale homeostase of ziekte.

Om te beoordelen LECs door stroom cytometry, zijn meerdere oppervlakte markeringen nodig. Typisch, LECs worden gevisualiseerd door de expressie van prospero-gerelateerde homeobox 1 (Prox-1), de lymfatische vaartuig endothelial hyaluronan receptor 1 (LYVE1) of de vasculaire endotheliale groeifactor receptor 3 (VEGFR3) met behulp van microscopie. In de lever is de uitdrukking van deze markers echter niet beperkt tot de LECS-server. ProX-1 is wijd van hepatocyten tijdens lever ontwikkeling, regeneratie en letsel19, en LYVE1 en VEGFR3 worden geuit door de endotheliale cellen van de lever sinusvormige18. In de lymfeklier, LECs worden geïdentificeerd met behulp van stroom cytometry als clusters van differentiatie (CD) CD45 - CD31 + en podoplanin + (PDPN)16. Deze aanpak is echter ook minimale LECs in de lever te isoleren omdat CD45 - CD31 + cellen endotheliale cellen vangen zal, en de overheersende bevolking van vasculaire endotheliale cellen in de lever LSECs zijn. Zo nodig andere markeringen zijn te onderscheiden van de zeldzame LEC-bevolking uit de overvloedige LSEC populatie. Zowel CD16/32 (uitgedrukt door volwassen LSECs18) en CD146 (een gemeenschappelijke vasculaire endothelial cel markering die wordt hoofdzakelijk binnen de lever sinusoïdes uitgedrukt door endotheliale cellen van de lever sinusvormige20 met weinig tot geen expressie door lymfatisch endotheliale cellen21) werden kandidaat-markeringen.

Daarom geoptimaliseerd we een methode voor het opsporen en visualiseren van de LECS-server in de lever met behulp van de bovenstaande markeringen, CD45, CD31, CD146, CD16/32 en PDPN voor stroom cytometry. We beschrijven het gebruik van collagenase IV, DNase 1 en mechanische scheiding voor leverweefsel vertering in de schorsing van een eencellige. Ook beschrijven we het gebruik van iodixanol dichtheid verloop voor de isolatie van niet-parenchymal cellen (NPC) en te elimineren cellulaire puin. Ten slotte, met behulp van meerdere markeringen, we de optimale stroom cytometry gating strategie te identificeren van de LECS-server van de lever met PDPN als overheersende markering bepalen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Alle methoden die hier worden beschreven zijn goedgekeurd door de institutionele Animal Care en gebruik Comité (IACUC) van de Universiteit van Colorado Anschutz medische Campus.

1. voorbereiding van de materialen

  1. Maak een oplossing van 5 mg/mL van DNase ik in een met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS).
  2. Maak een mengsel van de spijsvertering door 5.000 U/mL collagenase IV aan Klik op de EHAA media toe te voegen.
  3. Verwarm het mengsel van de spijsvertering bij 37 ° C gedurende 30 minuten vóór gebruik.
  4. Een isolatie buffer maken door toevoeging van 4,8% bovien serumalbumine (BSA) en 2 mM ethyleendiamminetetra azijnzuuroplossing (NA2EDTA) naar Hanks evenwichtige zoutoplossing (HBSS).
  5. Een rode bloedcellen (RBC) lysis -buffermengsel maken door toevoeging van ammoniumchloride 100 mM, 10 mM KHCO3en 0.1 mM EDTA aan gedistilleerd H2O.

2. voorbereiding van de schorsing van een eencellige uit de lever van een muis

  1. De muis met CO2 en cervicale dislocatie euthanaseren.
  2. Spray de muisknop met 70% ethanol te nat zijn vacht ingedrukt. PIN van de muis voeten een dissectie-Board.
  3. Met behulp van dissectie schaar te knippen de huid ongeveer 1 cm boven de anus, voorzichtig om te knippen alleen via de huid (ongeveer 1 mm). Trek de huid van het lichaam met een getande Tang en voeg de schaar tussen de huid en buikvlies. Open de schaar te scheiden van de huid van het buikvlies, knip dan, de huid van de incisie aan de hals.
  4. PIN de huid aan het bestuur van de dissectie gebruikt één pin onder elke arm en boven elk been. De peritoneale sac optrekken en snijd omhoog naar de nek. Pak de lobben van de lever en snijd net onder het borstbeen.
    Opmerking: Let erop als elk van de lever zal worden gebruikt voor immunohistochemistry (IHC).
  5. Knippen rond de lever en de lever van de muis verwijderen en deze plaatsen in 4 mL klik van EHAA media.
  6. Met behulp van een scalpel, knip de lever in ~ 1 mm diameter stukken.
  7. Voeg 500 µL van het mengsel van de spijsvertering en 500 µL van de DNase I (2 mg/mL) bij de lever.
  8. Incubeer de lever gedurende 30 minuten bij 37 ° C. Na 15 min, meng de vloeistof met behulp van een precisiepipet 5 mL.
  9. Na 30 min van incubatie, overbrengen in het verteerd monster door een zeef van 100 µm een conische tube van 50 mL.
  10. Duw voorzichtig de resterende stukken door het filter met de zuiger van een injectiespuit 1 mL.
  11. Was het filter met 5 mL isolatie buffer en duw voorzichtig het weefsel door de zeef met de achterkant van een zuiger van een injectiespuit 1 mL. Herhaal dit totdat het filter wordt gewassen met 25 mL van isolatie buffer.
  12. Centrifugeer de cellen bij 400 x g voor 5 min. zorgvuldig uit het supernatant gecombineerd.
  13. Resuspendeer de pellet met 4 mL lysis-buffermengsel van RBC. Incubeer de cellen bij kamertemperatuur gedurende 5 minuten.
  14. Wassen van de cellen met 10 mL isolatie buffer en centrifugeer bij 400 x g gedurende 5 min.
  15. De cellen op een hemocytometer om te bepalen van de volledige lever telling tellen.
  16. Resuspendeer de cellen in 5 mL 20% iodixanol en laag hen met 1 mL PBS.
  17. Centrifugeer de cellen bij 300 x g gedurende 15 minuten zonder een rem.
  18. Verwijder de laag tussen het PBS en de iodixanol en plaats hen, via een 100 µm filter, in een nieuwe conische tube van 50 mL.
  19. Wassen van de cellen met 10 mL isolatie buffer en centrifugeer bij 400 x g gedurende 5 min.
  20. Verwijder het supernatant en resuspendeer de cellen in 500 µL van PBS met 2% foetale runderserum (FBS).

3. flow cytometrische analyse van enige cellen van de lever

  1. De cellen met behulp van een hemocytometer en de Microscoop, met behulp van trypan blauwe uitsluiting voor het meten van levensvatbare cellen te tellen. 10 µL van de cellen toevoegen aan 10 µL van trypan blauw en onmiddellijk plaats ze op een hemocytometer en tellen de levende cellen (niet blauw) onder een microscoop. Vervolgens Bereken het aantal cellen per microliter.
  2. Aliquot ongeveer 5 miljoen van de resterende nonparenchymal cellen in een enkel putje van een 96-wells-plaat.
  3. Centrifugeer de cellen bij 400 x g gedurende 5 min.
  4. Verwijder het supernatant en resuspendeer de cellen in 90 µL van PBS met 2% FBS.
  5. Anti-CD45 (1:200), anti-CD146 (1:200), anti-CD31 (1:200) en PDPN (1:200) verdund in 10 µL van 10 x 2.4G2 of anti-CD16/32 (1:200) toevoegen.
    Opmerking: Geen Fc blok (2.4G2) werd gebruikt als anti-CD16/32-gelabeld antilichaam werd gebruikt.
  6. Om te bepalen waar de positieve en negatieve poorten moeten worden vastgesteld, bevatten een fluorescentie minus één (FMO) vlek voor elke kleur en een isotype controle antilichaam.
  7. Om te bepalen live versus dode cellen, vlek met een levensvatbaarheid marker (bijv ghost rode 780). Incubeer de cellen bij 4 ° C gedurende 30 minuten.
  8. Wassen van de cellen met 100 µL van PBS met 2% FBS.
  9. Gebruik een kleine hoeveelheid cellen aan te passen de laser en compensatie-instellingen op de cytometer van de stroom. De cellen met een antilichaam aan elke afzonderlijke fluorophore en een zonder een antilichaam vlek.
    Opmerking: Afhankelijk van de stroom cytometer wordt gebruikt, moet een compensatie-matrix worden vastgesteld om het verwijderen van spectrale overlap.
  10. Plaats het monsterbuisje op de cytometer sonde en verzamelen en vastleggen van alle gebeurtenissen.

4. de gegevensanalyse

  1. Op zoek naar kant-scatter gebied vs. vooruit-scatter gebied, gate op "live" cellen op basis van grootte en granulariteit en levensvatbaarheid marker kleurstof.
  2. Vervolgens met behulp van CD45 briljante Violet 510 en CD31 PerCp Cy5.5, gate op de CD45 - CD31 +-cellen de isotype besturingselementen en FMO gebruiken om te bepalen van positieve en negatieve populaties.
  3. Ten slotte, met behulp van CD146 v450 of CD16/32 FITC en PDPN APC, nemen de CD146 - PDPN + of CD16/32-PDPN + cellen, opnieuw gebruikend isotype besturingselementen en FMO, om te bepalen van positieve en negatieve populaties. Deze cellen zijn de LECS-server.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Studies analyseren lever lymfatische hebben hoofdzakelijk immunohistochemistry gebruikt aan het kwantificeren van de frequentie en de diameter van de lymfevaten in de lever. Echter, deze methode niet mogelijk voor de evaluatie van de LECS-server op basis van de cel-door-cel of voor de expressie van meerdere markeringen, cytokines, chemokines of transcriptiefactoren. Dus we vroegen of lever LECs kon worden geïsoleerd uit de lever en geëvalueerd aan de hand van stroom cytometry. Vorige werk...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het algemene belang van LECs in immuun homeostase en verordening gekomen onlangs tot lichte25. Veel van de gepubliceerde lymfatische literatuur focust op de huid en lymfklieren; echter, lymfatische worden aangetroffen in het lichaam26 , en dus ons begrip van hun belang in verschillende organen nodig is. Hier laten we een methode waarin de LECS-server in de lever kunnen worden bestudeerd op basis van cel-door-cel om hun gelijktijdige uitdrukking van verschillende oppervlakte...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs bedank de GI en lever aangeboren immuun programma's voor monetaire steun voor dit project. B.A.J.T. wordt ook gefinancierd door R01 AI121209.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Clicks/EHAA mediaIrvine Scientific9195
Collagenase IVWorthington Biochemical corporationLS004188
DNase IWorthington Biochemical corporationLS002145Deoxyribonuclease 1
OptiPrepSigma AldrichD1556Density Gradient Medium
V450 anti mouse CD146(clone ME-9F1)BD biosciences562232
FITC anti mouse CD146 (clone ME-9F1)Biolegend134706Fluorescein isothiocyanate (FITC)
Pacific Blue anti mouse CD31(clone 390)Biolegend102422
PerCp/Cy5.5 anti mouse CD31(clone 390)Biolegend102420Peridinin-chlorophyll proteins-Cyanine 5.5 (PerCP-Cy5.5)
APC anti mouse PDPN (clone 8.1.1)Biolegend127410Allophycocyanin (APC), podoplanin (PDPN)
APC/Cy7 anti mouse CD45 (clone 30-F11)Biolegend103116
Brilliant Violet 510 anti mouse CD45 (clone 30-F11)Biolegend103138
FITC anti mouse CD16/32 (clone 93)Biolegend101306Fluorescein isothiocyanate (FITC)
PerCp/Cy5.5 anti mouse CD16/32(clone 93)Biolegend101324Peridinin-chlorophyll proteins-Cyanine 5.5 (PerCP-Cy5.5)
ghost red 780 viability dyeTONBO biosceinces3-0865-T100
APC syrian hamster IgG (clone SHG-1)Biolegened402102
PerCp/Cy5.5 rat IgG2a (clone RTK2758)Biolegend400531
FITC rat IgG2 (clone eBR2a)ebioscience1-4321-80
Anti mouse LYVE1 (clone 223322)R&D systemsFAB2125A
anti-mouse Cytokeratin(clone EPR17078)abcamab181598
anti-mouse F4/80 (clone Cl:A3-1)Bio-radMCA497
BSA (fraction V)FischerBP1600-100Bovine Serum Albumin (BSA)
Goat serumJackson Immunoresearch017-000-121
Donkey SerumJackson Immunoresearch017-000-121
EDTAVWRE177Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) -for RBC lysis buffer
Ammonium ChlorideFischerA687-500for RBC Lysis buffer
Potassium BicarbonateFischerP184-500for RBC Lysis buffer
ScalpelFeather2975#21
100 μm cell strainerFischer22363549
2.4G2in house/ATCCATCC HB-197FC block to inhibit non-specific binding to Fc gamma + cells -made from hybridoma
Phosphate Buffered Saline (PBS)Corning21-040-CV
Hanks Balanced Salt Solution (HBSS)Gibco14185-052
Fetal Bovine Serum (FBS)Atlanta biologicalsS11550
96 well plateCorning3788
6 well plateCorning3506
50 mL conicalTrulineTR2004
15 mL conicalFalcon352196
1 mL Pipete tipUSA scientific1111-2721
200 µL pipete tipUSA scientific1110-1700
10 µL pipete tipUSA scientific1111-3700
seriological 10 mL pipetegreiner bio-one607107
seriological 5 mL pipetegreiner bio-one606107
Cell incubatorFischerHeracell 160i
BD FacsCanto II flow cytometerBD biosciences
Clinical CentrifugeBeckman coultermodel X-14R

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Tanaka, M., Iwakiri, Y. Lymphatics in the liver. Current Opinion in Immunology. 53, 137-142 (2018).
  2. Vollmar, B., Wolf, B., Siegmund, S., Katsen, A. D., Menger, M. D. Lymph vessel expansion and function in the development of hepatic fibrosis and cirrhosis. The American Journal of Pathology. 151 (1), 169-175 (1997).
  3. Podgrabinska, S., et al. Molecular characterization of lymphatic endothelial cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (25), 16069-16074 (2002).
  4. Cohen, J. N., et al. Lymph node-resident lymphatic endothelial cells mediate peripheral tolerance via Aire-independent direct antigen presentation. Journal of Experimental Medicine. 207 (4), 681-688 (2010).
  5. Cohen, J. N., et al. Tolerogenic properties of lymphatic endothelial cells are controlled by the lymph node microenvironment. PLoS One. 9 (2), e87740(2014).
  6. Rouhani, S. J., et al. Roles of lymphatic endothelial cells expressing peripheral tissue antigens in CD4 T-cell tolerance induction. Nature Communications. 6, 6771(2015).
  7. Tewalt, E. F., et al. Lymphatic endothelial cells induce tolerance via PD-L1 and lack of costimulation leading to high-level PD-1 expression on CD8 T cells. Blood. 120 (24), 4772-4782 (2012).
  8. Dubrot, J., et al. Lymph node stromal cells acquire peptide-MHCII complexes from dendritic cells and induce antigen-specific CD4(+) T cell tolerance. Journal of Experimental Medicine. 211 (6), 1153-1166 (2014).
  9. Hirosue, S., et al. Steady-state antigen scavenging, cross-presentation, and CD8+ T cell priming: a new role for lymphatic endothelial cells. Journal of Immunology. 192 (11), 5002-5011 (2014).
  10. Lund, A. W., et al. VEGF-C promotes immune tolerance in B16 melanomas and cross-presentation of tumor antigen by lymph node lymphatics. Cell Reports. 1 (3), 191-199 (2012).
  11. Lund, A. W., et al. Lymphatic vessels regulate immune microenvironments in human and murine melanoma. Journal of Clinical Investigation. 126 (9), 3389-3402 (2016).
  12. Swartz, M. A. Immunomodulatory roles of lymphatic vessels in cancer progression. Cancer Immunology Research. 2 (8), 701-707 (2014).
  13. Dietrich, T., et al. Cutting edge: lymphatic vessels, not blood vessels, primarily mediate immune rejections after transplantation. Journal of Immunology. 184 (2), 535-539 (2010).
  14. Kedl, R., et al. Migratory Dendritic Cells acquire archived antigen from Lymphatic Endothelial Cells for antigen presentation during lymph node contraction. Nature Communications. 8, 2034(2017).
  15. Kedl, R. M., Tamburini, B. A. Antigen archiving by lymph node stroma: A novel function for the lymphatic endothelium. European Journal of Immunology. 45 (10), 2721-2729 (2015).
  16. Tamburini, B. A., Burchill, M. A., Kedl, R. M. Antigen capture and archiving by lymphatic endothelial cells following vaccination or viral infection. Nature Communications. 5, 3989(2014).
  17. Yokomori, H., et al. Lymphatic marker podoplanin/D2-40 in human advanced cirrhotic liver--re-evaluations of microlymphatic abnormalities. BMC Gastroenterology. 10, 131(2010).
  18. Nonaka, H., Tanaka, M., Suzuki, K., Miyajima, A. Development of murine hepatic sinusoidal endothelial cells characterized by the expression of hyaluronan receptors. Developmental Dynamics. 236 (8), 2258-2267 (2007).
  19. Dudas, J., et al. Prospero-related homeobox 1 (Prox1) is a stable hepatocyte marker during liver development, injury and regeneration, and is absent from "oval cells". Histochemistry and Cell Biology. 126 (5), 549-562 (2006).
  20. Schrage, A., et al. Murine CD146 is widely expressed on endothelial cells and is recognized by the monoclonal antibody ME-9F1. Histochemistry and Cell Biology. 129 (4), 441-451 (2008).
  21. Amatschek, S., et al. Blood and lymphatic endothelial cell-specific differentiation programs are stringently controlled by the tissue environment. Blood. 109 (11), 4777-4785 (2007).
  22. Huang, L., Soldevila, G., Leeker, M., Flavell, R., Crispe, I. N. The liver eliminates T cells undergoing antigen-triggered apoptosis in vivo. Immunity. 1 (9), 741-749 (1994).
  23. Shay, T., Kang, J. Immunological Genome Project and systems immunology. Trends in Immunology. 34 (12), 602-609 (2013).
  24. Li, B., et al. Adult Mouse Liver Contains Two Distinct Populations of Cholangiocytes. Stem Cell Reports. 9 (2), 478-489 (2017).
  25. Randolph, G. J., Ivanov, S., Zinselmeyer, B. H., Scallan, J. P. The Lymphatic System: Integral Roles in Immunity. Annual Review of Immunology. 35, 31-52 (2016).
  26. Olszewski, W. L. The lymphatic system in body homeostasis: physiological conditions. Lymphatic Research and Biology. 1 (1), discussion 21-14 11-21 (2003).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Leverlymfatische endotheelcellenprotocol voor leverdigestiestromale vasculaire isolatiedichtheidsgradi ntscheidinglysis van rode bloedcellenpodoplanine kleuringCD45 negatief CD31 positiefflowcytometriebuisjeslevensvatbaarheidsmarker kleurstof

Gerelateerde artikelen