Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Bouw van een meerdere lagen mesenchymale stamcellen blad met een 3D dynamische cultuur-systeem

6.8K weergaven

DOI:

10.3791/58624

20 oktober 2018

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

Dit artikel biedt een efficiënt en haalbaar methode voor de opbouw van meerdere lagen stamcel bladen met de cel van de stam van de gunstige eigenschap.

Samenvatting

Stamcel therapie toont een veelbelovende toekomst in het regenereren van de benadeelde orgel en weefsels, en de cel blad techniek is ontwikkeld ter verbetering van het lage cel retentie en de overleving van de arme binnen de doelzone. Echter tijdens het bouwproces in vitro , is een oplossing voor het behoud van de stamcel topicale en verhoging van het bedrag van de cel binnen de cellaag dringend nodig. Dit protocol presenteert hier een methode voor de bouw van een meerdere lagen cellaag met gunstige stamcel topicale en optimale bruikbaarheid. Decellularized varkens hartzakje (DPP) wordt bereid door fosfolipase een methode decellularization2 (PLA2) als de cel blad steiger en rat beenmerg mesenchymale stamcellen (BMSCs) zijn geïsoleerd en uitgebreid als de geplaatste cellen. De tijdelijke meerdere lagen blad celstructuur is gebouwd met behulp van RAD16-ik peptide hydrogel. Tot slot, de cellaag is gekweekt met een dynamische perfusie-systeem te stabiliseren van de driedimensionale (3D) structuur en de cellaag kon worden verkregen na een 48-urige cultuur in vitro. Dit protocol biedt een efficiënt en haalbaar methode voor de bouw van een vel met meerdere lagen cel van de stam en het blad van de cel kan worden ontwikkeld als een gunstige stamcel therapie product in de toekomst.

Inleiding

Stamcel therapie werd gerapporteerd als een effectieve behandeling voor vele ziekten; lage cel retentie en arme overleven binnen de doelzone blijven echter kritieke problemen na injectie van de traditionele cel van de stam. U kunt dit probleem oplossen, ontwikkeld weefsel engineering wetenschappers de cel blad techniek. Een monolayered cellaag met intact extracellulaire matrix bereid was om te beginnen met behulp van de temperatuur-respons cultuur schotel1, en haar follow-up studies rapporteerde de significante verbeteringen van de stamcel retentie en overleven in de infarcted gebied2,3....

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Alle stamcel en dierlijke experiment procedures werden uitgevoerd volgens de ethische richtsnoeren voor de nationale gids voor de verzorging en het gebruik van proefdieren en goedgekeurd door het Jinan Universiteit Animal Care en gebruik Comité (Guangzhou, China).

1. bereiding van de DPP steiger met de PLA2 Decellularization methode14

Opmerking: Zie figuur 1A voor een schematische voorstelling van de PLA-2 decellularization-methode.

  1. 100 mL 200 U/mL PLA2 oplossing voor te bereiden. Voeg 0,5 g natrium deoxycholate en 2 ....

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Het schema van de opbouw van meerdere lagen stamcel blad is afgebeeld in Figuur 1. Voorbereiding van de cel blad steiger door de PLA2 decellularization methode is de eerste stap. Gebaseerd op de steiger, is een tijdelijke 3D celstructuur gebouwd door het mengen van de cellen van de stam met de RAD16-1 peptide hydrogel. Het verkrijgen van een meerdere lagen cellaag met gunstige stamcel topicale en optimale mechanische sterkte, is de cellaag gekweekt.......

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Dit protocol rapporteert een efficiënte methode voor de bouw van een meerdere lagen MSC blad. Deze cellaag vertoont optimale mechanische sterkte, hoge celdichtheid seeding en gunstige stamcel topicale. BMSCs als een voorbeeld gebruikt, is de 3D celstructuur snel gebouwd met RAD16-ik peptide hydrogel. Na wordt gekweekt in het dynamische perfusie-systeem, het meerdere lagen BMSC blad met succes wordt verkregen en de BMSCs handhaven een hoog expressie van markeringen in een cel van de stam.

Bouw .......

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

Dit werk werd gesteund door de National Natural Science Foundation of China (subsidie nummer 31771064); de wetenschap en de technologie Planning Project van de provincie Guangdong (subsidie nummers 2013B010404030, 2014A010105029 en 2016A020214012); de wetenschap en de technologie Planning Project van Guangzhou (subsidie nummer 201607010063); en de Undergraduate innovatie en ondernemerschap trainingsprogramma (subsidie nummer 201610559028); de National Science Foundation voor jonge wetenschappers van China (verlenen nummer 31800819).

....

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Phospholipase A2Sigma-AldrichP6534
Sodium deoxycholateSigma-AldrichD6750-100G
Phosphate bufferGibco BRL89033
Penicillin streptomycin / amphotericin Gibco BRL15640055
Buffer bicarbonateSigma-AldrichC3041
Table concentratorChangzhou Aohua Instrument Co.KT20183
Dulbecco's Modified Eagle Medium(DMEM)Corning Cellgro10-014-CVR
South American fetal bovine serum Gibco BRL10270-106/P30-3302
L-GlutamineCorning Cellgro25-005-CI
0.25% Trypsin/2.21 mM EDTACorning Cellgro25-053-CI
Biosafety cabinetEsco,SingaporeAC2-2S1
Constant temperature incubator Esco,SingaporeCLS-170B-8
Centrifuge tube Corning430790
EP tubeAxygen31617934
Centrifugal machineTOMOS1-16R 
SucroseSigma-AldrichS9378-500G
Pura Matrix BD354250
Dynamic perfusion culture systemMinucells and MinutissueD-93077
Peristaltic pumpIsmatecIPC N8
Pump tubingIsmatecNr.1306
MINUSHEET 1300 Regensburgweefseldragercomponenten 
MINUSHEETRegensburgdynamisch perfusiesysteem 
MINUSHEET 0006Regensburggaswisselingsapparatuur 
MINUSHEET 0002Regensburg500 mL glazen fles 
MINUSHEET 1301perfusiecultuurcontainer 

Referenties

  1. Miyahara, Y., et al. Monolayered mesenchymal stem cells repair scarred myocardium after myocardial infarction. Nature Medicine. 12 (4), 459-465 (2006).
  2. Narita, T., et al.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Tags

3D dynamisch cultuursysteemgedecellulariseerd varkenspericardmesenchymale stamcellen uit het beenmergRAD16-I peptidehydrogeldynamisch perfusiesysteemcellaagsteunstructuurbioactiviteit van stamcellenmeerlaagse celstructuurlevensvatbaarheid van stamcellen