Hoge resolutie patroon Biofilm afzetting met behulp van pDawn-Ag43

Samenvatting

We tonen een methode voor het storten van Escherichia coli bacteriën biofilms in willekeurige ruimtelijke patronen met een hoge resolutie met behulp van optische stimulatie voor een genetisch gecodeerde oppervlak wrijvingscoëfficiënt construct.

Samenvatting

Ruimtelijke structuur en patronen spelen een belangrijke rol in de bacteriële biofilms. Hier tonen we een toegankelijke methode voor het kweken van E. coli biofilms in willekeurige ruimtelijke patronen met hoge ruimtelijke resolutie. De techniek maakt gebruik van een genetisch gecodeerde optogenetic constructie — pDawn-Ag43 — die biofilm vorming in E. coli paren om optische stimulatie door blauw licht. We detail het proces voor het omzetten van E. coli met pDawn-Ag43, de vereiste optische set-up en het protocol voorbereiding culturing gedessineerde biofilms met behulp van pDawn-Ag43 bacteriën. Met behulp van dit protocol, kan biofilms met een ruimtelijke resolutie onder 25 μm patroon worden op verschillende oppervlakken en omgevingen, met inbegrip van ingesloten chambers, zonder microfabrication, schoon-kamer faciliteiten of ondergrond voorbehandeling. De techniek is handig en geschikt is voor gebruik in toepassingen die onderzoeken van het effect van biofilm structuur, verstrekken van afstembare controle over biofilm patronen. Meer in het algemeen, heeft het ook potentiële toepassingen in biomaterialen, onderwijs en bio-art.

Inleiding

Biofilms zijn oppervlak-ingeschrevenen gemeenschappen van microben en staan bekend om hun sterke structuur-functie-koppeling. Ruimtelijke geometrie en patronen van biofilms spelen een belangrijke rol in de algehele gemeenschap functie (en vice versa)¹. De kleine lengte schalen die betrokken zijn bij de biofilm structuur — over de volgorde van tientallen micron²— afstembare en handig controle van biofilm patronen een uitdagende probleem maken. Hier tonen we een protocol waarmee voor biofilms te zijn precies patroon in willekeurige geometrieën, gebaseerd op optische verlichting.

Het hier gepresenteerde protocol maakt gebruik van pDawn-Ag43³, een optogenetic-constructie waarbij de biofilm vorming in E. coli bacteriën om optische verlichting paren door het rijden van de expressie van Ag43 (een adhesine gen dat verantwoordelijk is voor de oppervlakte hechting en een biofilm vorming) onder de controle van pDawn⁴ (een transcriptionele regulator gecontroleerd door optische verlichting). De methode is handig in gebruik en kan patroon biofilms op verschillende oppervlakte omgevingen, met inbegrip van de ingesloten (transparant) cultuur kamers. In vergelijking met bestaande cel afzetting methoden, zoals druppel gebaseerde afzetting⁵ of oppervlak prepatterning/behandeling⁶, pDawn-Ag43 vereist geen microfabrication of schoon-kamer voorzieningen en vereist geen materialen die verder gaan dan beschikbaar voor een typische microbiologie laboratorium. Is het kundig voor patroon met een ruimtelijke resolutie onder 25 μm, nadert de ruimtelijke dimensies van microcolonies in natuurlijk bestaande biofilms². Over het geheel genomen, deze techniek biedt de mogelijkheid om te manipuleren van de structuur van de biofilm, die vervolgens opent veel mogelijkheden om te studeren van microecology in bacteriële gemeenschappen⁷. Gedessineerde biofilms kunnen bovendien een handig platform waarop ingenieur nuttig biomaterialen^8,9. In dit document, wij bespreken het basisprotocol die nodig zijn voor de patronen van biofilms met behulp van pDawn-Ag43 en aanpakken van potentiële wijzigingen en probleemoplossing gerelateerde aan de methode.

Protocol

1. bereiding van pDawn-Ag43 bacteriestammen

1. PDawn-Ag43 omvormen tot een stam E. coli van belang (Figuur 1).
   1. Groeien een klonen stam hosting pDawn-Ag43 plasmide (verkrijgbaar bij een plasmide repository) door het enten van de stam in de pond-Bouillon aangevuld met 50 μg/mL spectinomycine (LB + spec) in een buis van de cultuur ('s nachts in een schudden incubator bij ~ 250 omwentelingen per minuut, 37 ° C). Gebruik vervolgens een miniprep kit om te oogsten van de plasmide gezuiverde pDawn-Ag43¹⁰.
   2. Kies een stam E. coli van belang zijn voor het patroon worden. PDawn-Ag43 is tot nu toe geverifieerd om te werken in MG1655³ en BW25113.
   3. Gebruik een gangbaar protocol voor het genereren van bevoegde (b.v., chemisch bevoegde¹¹ of electrocompetent¹²) voorraden van de gekozen E. coli stam (bijvoorbeeldMG1655).
   4. PDawn-Ag43-plasmide transformeren in de bevoegde bacteriën^11,12, gevolgd door 1 h terugwinning en plaat op LB + spec agar platen. Toestaan van kolonies groeien 's nachts bij 37 ° C.
2. Winkel de pDawn-Ag43 getransformeerd stammen.
   1. Enten van een één kolonie van pDawn-Ag43 van een LB + spec agarplaat in LB + spec Bouillon in een buis van de cultuur en het groeien in een schudden incubator (bij ~ 250 omwentelingen per minuut, 37 ° C) tot exponentiële fase (OD600 ~0.4 - 0.8).
   2. Voorraad voor het opslaan van de stam van de pDawn-Ag43 omgezet bij-80 ° C op lange termijn door het mengen van 1 mL van de cultuur met 1 mL steriele glycerol van 50% in een cryo-buis te verkrijgen van een 25% glycerol vriezer voorraad voor te bereiden. Bewaar dit in een vriezer-80 ° C.
   3. Als extra plasmiden (b.v., fluorescerende verslaggever plasmiden) moeten worden omgezet, maken de bevoegde cellen^11,12 van de pDawn-Ag43 getransformeerd stam en herhaal het transformatie proces^{11 , 12} voor de extra plasmiden zoals nodig.
      Opmerking: Als electroporation⁸gebruikt, is het mogelijk om cotransform van meerdere plasmiden (met inbegrip van pDawn-Ag43) tegelijkertijd; echter is een gelijktijdige transformatie niet aanbevolen referentiemethoden chemisch te worden verwerkt, zoals de grote omvang (> 10 kB) van pDawn-Ag43 betekent transformatie efficiëntie worden verlaagd.

2. voorbereiding van de Projector optische Set-up voor verhelderend bacteriën

1. Verkrijgen van een bacteriële incubator met niet-transparante muren en een gat voor het doorgeven van kabels, een draagbare projector geschikt voor montage en functioneren binnen de bacteriële incubator, en een laptop uitgerust met software voor presentatie-projectie (Zie tabel van Materialen). Wanneer het kiezen van de projector en de incubator, ervoor zorgen dat de minimale scherpstelafstand van de projector is minder dan de binnenhoogte van de incubator.
2. Plaats de projector in de incubator aan de onderkant, met de diafragma wijzen direct naar boven, naar het plafond, waar de biofilm cultuur kamer is gekoppeld (Figuur 2).
3. Correctie van de projector in plaats door de aanleg van een installatie met een optische breadboard basis verbonden aan een verticale post, verbonden op zijn beurt met een horizontale post welke schroeven in de projector (Figuur 2). Merk op dat deze set-up kan worden gewijzigd, afhankelijk van de projector/beschikbare onderdelen. Uiteindelijk is het belangrijkste vereiste is dat de projector stevig wordt bevestigd in de buurt van de onderkant van de incubator, met de opening naar boven wijzen.
4. Sluit de laptop via de kabel van weergave (bijvoorbeeldHDMI) aan op de projector in de incubator.
5. Als de oppervlakken — vooral het plafond — van het interieur van de incubator worden reflecterende (bijvoorbeeldmetalen gepolijste oppervlak), dek ze af met donkere matte oppervlakken te minimaliseren reflecties.
6. Tape gebruiken om een lege 'dummy' cultuur schotel hechten aan het plafond van de incubator. Merk op dat, zoals met de projector, er meerdere aanvaardbaar manieren zijn om het koppelen van een schotel van cultuur; Zorg ervoor dat het oppervlak van de transparante onderstuk van de kamer van de cultuur, waar verlichting voorkomt, niet bedekt is.
7. De focus op de projector aanpassen door te draaien aan de focus knop zodat het scherpstellen vliegtuig met de onderkant van de schotel van de cultuur van de biofilm (bijvoorbeeldeen goed plaat samenvalt) gekoppeld aan het plafond van de incubator (Figuur 2). De projector moet het verlichten van een scherpe, niet-wazig beeld op de bodem van de schotel cultuur. Verwijder de 'dummy' cultuur schotel zodra de projectie is geoptimaliseerd.
8. Laptop softwarematig, direct de projector voor de verlichting van het volledige gezichtsveld met maximale blauwe verlichting (bijvoorbeeldRGB = [0, 0, 255]) door de indiening van een volledige blauwe dia.
9. Meet de intensiteit van de verlichting van de projector met behulp van een optische Energiemeter door het hoofd van de foto-elektrische cel plaatsen bij de incubator plafond en de intensiteit van de overeenkomstige Energiemeter gekalibreerd tot licht golflengte 460 nm te lezen. Volg de instructies over het aansluiten en het kalibreren van de foto-elektrische cel voor de specifieke Energiemeter gebruikt.
   1. Omgevingslicht te verminderen (b.v., kamer lichten uit te schakelen, of de incubator plaats uit de buurt van lichtbronnen) zo veel mogelijk alvorens de verlichting intensiteit metingen.
10. Pas de intensiteit van de verlichting met behulp van een verstelbare neutrale-opaciteitsfilter geplaatst op de opening van de projector. Draai het filter om aan te passen van de intensiteit van de verlichtingssterkte gemeten door de Energiemeter, totdat de intensiteit van de verlichting in het midden van de blauw-licht geprojecteerde regio 50 μW/cm^{2 leest}.
    Opmerking: Hoewel het mogelijk is om de intensiteit van de verlichting met behulp van lagere blauw RGB-waarden aan de software kant, met behulp van een filter terwijl het maximaliseren van de waarde voor blauw RGB-het voordeel heeft van het maximaliseren van de optische contrast van het systeem tussen verlichte versus. donkere regio's.
11. Tekenen van willekeurige patronen met behulp van de software van de presentatie/projector op de laptop en deze patronen weergeven op het plafond van de incubator, met behulp van de projector.
    Opmerking: Biofilm-vormende regio's moeten worden getekend met maximale blauwe verlichting (bijvoorbeeldRGB = [0, 0, 255]), niet-biofilm-vorming van regio's met geen verlichting (bijvoorbeeldRGB = [0, 0, 0]).

3. het kweken van patroon Biofilms

1. Vóór de verlichting, de pDawn-Ag43-bacteriën, vanaf de glycerol vriezer voorraad, zodat ze op betrouwbare wijze worden veroorzaakt in de late fase van de exponentiële groei voor verlichting (figuur 3A) te bereiden.
   1. Strijk een pDawn-Ag43-stam uit glycerol voorraad op LB + spec agar platen. Toestaan van kolonies groeien overnachting (37 ° C).
      Opmerking: Vanaf hier tot de verlichting cultuur stap, zorgen de cellen blijven zo veel mogelijk in het donker — korte perioden op ambient verlichting (bijvoorbeeldvoor subdilution) zijn aanvaardbaar.
   2. Enten van een kolonie van pDawn-Ag43 bacteriën uit een agarplaat in LB + spec Bouillon en groeien de cultuur 's nachts aan de stationaire fase (in een schudden incubator bij ~ 250 omwentelingen per minuut, 37 ° C, voor ~ 16 h).
   3. Subdilute van de cultuur in een verhouding van 1:1,000 met LB + spec Bouillon (bv1 μL van overnachting cultuur toevoegen aan 1 mL verse LB + spec).
   4. Laat de subdiluted cultuur te groeien tot de laat-exponentiële/vroeg-stationaire groeifase (OD ~ 1.0, ~ 6 h in een schudden incubator bij ~ 250 omwentelingen per minuut, 37 ° C).
   5. Tijdens het wachten voor de cultuur te groeien, bereiden M63 media met 1 x M63 zouten, 1 mM MgSO₄, 0,2% glucose, 0,1% casamino zuren en 50 μg/mL spectinomycine in water (zorgen voor de samenstellende delen zijn steriel).
   6. Subdilute de cultuur van de laat-exponentiële-fase bij een verhouding van 1:100 met M63 media aangevuld met 50 μg/mL spectinomycine. De verdunning in een biofilm cultuur schotel vervolgens, in te voeren (bijvoorbeeldhet verdunde monster Pipetteer in een goed plaat).
      Opmerking: De hoeveelheden die nodig zijn voor deze 1:100 subdilution hangt de schotel van de cultuur wordt gebruikt (bijvoorbeeld, als met een 6-well polystyreen goed plaat [niet--Weefselkweek behandeld], één sample zou vereisen 20 μL van cultuur aan 2 mL M63 + spec, toe te voegen als de standaard goed volume van een 6-well plaat is ~ 2 mL).
2. Als de monsters nu gereed voor verlichting zijn, tape de cultuur schotel aan het plafond van de incubator, ervoor te zorgen dat het oppervlak aan de onderkant van de schotel transparant voor de verlichting van onderaf door de projector is.
   Opmerking: Het is belangrijk om ervoor te zorgen dat het plafond van de incubator niet reflecterende is, tot een minimum beperken van verdwaalde verlichting. Verdwaalde verlichting kan ook worden verminderd door het gebruik van zwart-ommuurde platen als cultuur gerechten, hoewel dit niet strikt noodzakelijk is — als dergelijke platen gebruikt, controleert de onderkant is transparant.
3. De biofilms aan cultuur in de incubator's nachts (16 h met geen schudden, bij 37 ° C) toestaan. Merk op dat sommige projectoren minder betrouwbaar bij hogere temperaturen worden. Als dat het geval, houdend cultuur bij lagere temperaturen (bijvoorbeeld30 ° C), in mening dat de incubatietijd worden verhoogd moeten kan, afhankelijk van de stam E. coli .

4. imaging patroon Biofilms

1. Na de overnachting groei van de biofilm monsters, de cultuur schotel uit de incubator te verwijderen. Het gerecht zal hebben biofilm bacteriën gekoppeld aan de onderkant, waar het heeft zijn verlicht, evenals planktonische bacteriën verspreid in de vloeibare media hierboven.
2. Gooi de planktonische cellen door het verwijderen van het vloeibare media uit de cultuur schotel (bijvoorbeelddoor met een pipet zachtjes zuigen).
3. Spoel het monster 2 x-fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) oplossing voor het verwijderen van de resterende planktonische cellen (figuur 3B) door het voorzichtig pipetteren in PBS, gevolgd door aspiratie.
4. Als de cellen zijn fluorescently gecodeerd, direct het imago van de monsters met behulp van fluorescentie microscopie¹³ (b.v., breed-gebied¹³, 3D-confocale¹⁴, enz.).
   Opmerking: TL biofilms kunnen ook worden bewaard met behulp van een zelf verharden montage medium. Toepassen van één druppel media een biofilm steekproef te monteren, bedek het met een dekglaasje glas aan, niet te vangen luchtbellen onder, het verzorgen en laten harden's nachts voor imaging.
5. Als de gebruikte bacteriële cellen fluorescently niet zijn gecodeerd, gelden de kristalviolet vlek techniek¹⁵ (figuur 3B) van biofilm contrast verbeteren voorafgaand aan de beeldvorming.

5. protocol wijzigingen/alternatieven

1. PDawn-Ag43 bacteriën op verschillende oppervlakken te groeien.
   1. Glas- of poly-dimethyl-siloxaan (PDMS) kortingsbonnen (bijvoorbeeld, coverslips of dunne reepjes van PDMS) gestoken met goed platen voordat het prestatiemeteritembestand van een bacteriële monster/verlichting, en volg hetzelfde protocol als voorheen naar patroon pDawn-ag43 biofilms op glas en PDMS.
2. PDawn-Ag43 bacteriën in een transparante, gesloten cultuur kamer groeien.
   1. Het genereren van een schimmel cultuur kamer voor PDMS.
      1. Genereren voor een fundamentele cultuur kamer, schimmel door een harde, rechthoekige Prisma op een plat oppervlak (de prism zal een holte in de PDMS die als de cultuur zaal fungeert zodra de schimmel wordt geworpen worden). Merk op dat meer ingewikkelde cultuur kamer mallen kunnen worden vervaardigd met behulp van zachte lithografie¹⁶.
   2. Een holte PDMS voorstemmen PDMS in de mal gieten en het te genezen (Zie voor een gedetailleerde zachte litho-protocol, JoVE van Science Education Database¹⁶).
   3. Na uitharding trim eventuele overtollige PDMS, punch inlaat/uitlaat kanalen in de bedwelmingsruimte holte/cultuur en de holte op een plat oppervlak (bijvoorbeeld, glas/polystyreen) band door stevig op de PDMS op de vlakke ondergrond, waardoor de holte tussen het oppervlak en het PDMS plafond als de biofilm cultuur kamer.
      Opmerking: Meer permanente hechting op basis van plasma behandeling¹⁶ kan ook worden gebruikt, maar de chips zal dan niet herbruikbaar zijn.
   4. Volg het protocol van de cultuur als voorheen, met behulp van een spuit met het botte uiteinde naalden (in plaats van een pipet) te introduceren het bacteriële monster in de cultuur kamer/spoelen met PBS buffer (Figuur 3 c).
      1. Als met een tijdelijk gekleefde Holte, gebruikt u alleen negatieve druk te trekken van de kamer, om ervoor te zorgen dat de holte niet unbonded van het onderliggende oppervlak van het glas/polystyreen tot vloeibare in/out.
3. PDawn-Ag43-bacteriën met behulp van een photomask film voor gestructureerde verlichting groeien.
   1. Het ontwerp van een patroon van de biofilm met behulp van CAD software compatibel is met een film photomask printer/print service. Het ontwerp van de film photomask moeten duidelijk in regio's waar de biofilm is bedoeld om te worden afgedrukt, en zwart/ondoorzichtig elders. Als alles klaar is, het photomask-bestand naar de printer/afdrukservice verzendt en wachten op de terugkeer van de fysieke photomask.
   2. Instrueren van de projector voor het verlichten van een volledige gezichtsveld met maximale blauwe verlichting (bijvoorbeeldRGB = [0, 0, 255]) laptop softwarematig.
   3. Knip uit een regio van belangstelling van de grotere photomask van de film, en tape het rechtstreeks naar de onderkant van de biofilm cultuur schotel vóór invoering van het bacteriële monster voor overnachting verlichting (figuur 3D). Cultuur van de biofilms als voorheen en verwijder de photomask na het kweken, voorafgaand aan de beeldvorming.

Resultaten

Zoals te zien in figuur 4A, pDawn-Ag43-bacteriën werden gebruikt voor het genereren van biofilms patroon in polystyreen goed platen met projector verlichting (de projector werd ingesteld op het verlichten van een polka-dot patroon), beeld via helderveld microscopie met kristal Violet vlek als contrast agent, en fluorescentie microscopie met rood-fluorescerende-eiwit-uiting van bacteriën. Fluorescerende biofilm monsters kunnen ook worden beeld met behulp van de confocal microscopie¹⁴ te verkrijgen van beelden van de biofilm met 3D-opmaak (figuur 4B). In figuur 4Cillustreren we de high-resolution patronen mogelijk met behulp van een photomask film bieden gedessineerde verlichting aan de biofilm monster. Ten slotte in Figuur 4 d en 4E, we tonen voorbeelden van patronen op glas en PDMS oppervlakken, evenals ingesloten PDMS cultuur chambers — deze illustreren de verschillende soorten omgevingen waar pDawn-Ag43 patronen kan worden toegepast.

Figuur 1: opstelling van pDawn-Ag43-bacteriën (protocol sectie 1). PDawn-Ag43 bacteriën kunnen licht-gereglementeerde biofilm vorming voorbereiding omvat zuiveren van pDawn-Ag43 plasmide vanaf een host klonen stam, transformeren in een stam E. coli van belang en het maken van bacteriële vriezer materieel voor lange termijn opslag. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figuur 2: voorbereiding van een optische set-up voor de biofilm monster verlichting (protocol sectie 2). De optische set-up is gehuisvest in een bacteriële incubator en bestaat uit een computer verbonden projector verlichten van een biofilm monster. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figuur 3: Cultuur protocol voor patronen biofilms (protocol sectie 3). (A) voorafgaand aan verlichting, pDawn-Ag43-bacteriën zijn bereid vóór patronen zodat ze op betrouwbare wijze worden veroorzaakt in de juiste groeifase. (B) na 's nachts groei verlicht, een patroon biofilm aanwezig zal zijn aan de onderkant van de schotel van cultuur, samen met planktonische cellen in de vloeibare media, en na enkele verdere verwerking, de biofilm is klaar voor de beeldvorming. (C) als een alternatief voor goed platen, biofilms kunnen worden gekweekt in gesloten cultuur kamers zoals een gegoten PDMS holte. In dit geval kunnen spuiten gekoppeld aan botte uiteinde naalden worden gebruikt in te voeren van het monster en spoelen van vloeistoffen uit de zaal. (D) als alternatief voor projector gebaseerde verlichting patronen, patronen kunnen ook worden gegenereerd door taping film fotomaskers rechtstreeks naar de onderkant van biofilm cultuur kamers. In dit geval moet de projector worden ingesteld voor het verlichten van blauw licht over het volledige veld. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figuur 4: representatieve resultaten van biofilms patroon met behulp van pDawn-Ag43. Alle resultaten werden verkregen met behulp van een stam van de host MG1655 E. coli . (A) pDawn-Ag43 bacteriën werden gebruikt voor het genereren van biofilms patroon in polystyreen goed platen met projector verlichting (de projector werd ingesteld op het verlichten van een polka-dot patroon), beeld via helderveld microscopie met kristalviolet vlek als een contrast agent, en fluorescentie microscopie met rood-fluorescerende-eiwit-uiting van bacteriën. (B) TL biofilm monsters zijn beeld met confocale microscopie verkrijgen van 3D-beelden van de biofilm. (C) met een hoge resolutie biofilms kunnen worden patroon met een photomask van de film te bieden gedessineerde verlichting aan de biofilm monster. (D) Biofilms kunnen worden patroon op glas en PDMS oppervlakken. (E) Biofilms kunnen worden patroon in de gesloten cultuur kamers. Dit percentage is aangepast van eerdere werk³zijn. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Probleem	Mogelijke oorzaken/oplossingen
Tranforming pDawn-Ag43 in host strain - geen koloniën	Lage concentratie van de plasmide - plasmide concentratie op spectrometer controleren. Een typische miniprep van pDawn-Ag43 moet opleveren ten minste 100 ng/l; uitputten aan 10-100 ng voor transformatie
Selectievakje/remake bevoegde cellen: bevoegde cellen moet transformatie-efficiëntie ten minste 10 ^ 6 cfu/µg geverifieerd met behulp van een standaard plasmide zoals pUC19 - zoniet remake bevoegde cellen
Verkeerd (mate van) antibiotica op LB agarplaat - zorg ervoor dat u 50 μg/mL spectinomycine voor selectie
Projector verlichting schakelt uit / inconsistent's nachts	Uitschakelen problematische software zoals: automatische overnachting software/OS updates, nachtelijke blauw-licht filteren
Projector kan worden oververhitting - set incubator op lagere temperatuur, terwijl de projector is ingeschakeld (bijvoorbeeld 30 ° C in plaats van 37 ° C) - Opmerking projector als warmtebron incubator buiten instelpunt oververhitten kan
Verwijder geen onnodige bronnen van vochtigheid uit incubator, zoals deze van invloed kunnen zijn op de projector elektronica
Geen/lage niveaus van biofilm gevormd na nachtelijke verlichting, geen groei van de planktonische cellen ofwel (d.w.z. vloeibare is duidelijk)	Verkeerd (mate van) antibiotica - Maak gebruik van 50 μg/mL spectinomycine
Check die alles goed aan M63 recept is toegevoegd
Geen/lage niveaus van biofilm gevormd na nachtelijke verlichting, alleen planktonische cellen (d.w.z. vloeibare is bewolkt)	Controleer licht niveau, projector moet worden verlicht blauw licht op 50 μW/cm ^ 2 bij 460 nm golflengte
Probeer te laten bacteriën groeien korter/langer na 1:1000 LB subdilution stap voorafgaand aan toe te voegen aan M63
Restreak bacteriën op LB plaat, vanaf vers kolonie voor het genereren van overnachting stationaire fase cultuur
Zorgen van de projector is consequent 's nachts werken - zie punt hierboven
Fuzzy biofilm patronen, hoge niveaus van achtergrondgeluiden	Verminderen van strooilicht van optische verlichting systeem, reflecterende oppervlakken op interieur van incubator dekken
Overweeg het gebruik van gestructureerde verlichting gebaseerde photomask (in tegenstelling tot projector-gebaseerd)
Controleren van de projector is juist gericht op de onderkant van de biofilm cultuur kamer

Tabel 1: Common problemen.

Discussie

In het licht van de behoefte aan onderzoekstools waarmee voor biofilm structuur controle, hebben we een easy-to-use-protocol voor de patronen van bacteriële biofilms met behulp van de pDawn-Ag43 optogenetic constructie gepresenteerd. Met deze techniek, kunnen E. coli biofilms optisch worden patroon op verschillende oppervlakte omgevingen, met inbegrip van de bijgevoegde kamers, met een ruimtelijke resolutie onder 25 μm.

Globaal, dit protocol kan worden onderverdeeld in vier secties: (1) de opstelling van de pDawn-Ag43-bacteriën, (2) de opstelling van de optische en cultuur set-up hardware, (3) de pre verlichting bacteriële groei stappen en (4) de post verlichting gespoeld en beeldvorming.

De kritische deel van sectie 1 is de geslaagde transformatie van pDawn-Ag43-plasmide in de E. coli stam van belang. Dit wordt vergemakkelijkt door kwalitatief hoogwaardige gezuiverde plasmide isoleren en het genereren van kwalitatief hoogwaardige bevoegde cellen voor transformatie (tabel 1, probleemoplossing).

Het kritische deel van sectie 2 is de optimalisatie van de set-up van de projector zodat de intensiteit van de verlichting is aangepast aan de 50 μW/cm² bij de 460-nm golflengte, en de projector juist op de hoogte van de biofilm monster gericht is. Merk op dat in dit protocol, beschrijven we de set-up van een omgekeerde verlichting waar de projector licht van onderaf, omhoog richting de biofilm monster schijnt. Het voordeel van deze opzet is dat het licht maar nodig heeft om te reizen via de onderkant van de schotel cultuur alvorens de biofilm vorming oppervlak. Verlichting uit bovenstaande betekent dat het licht hebben zou om te reizen via de vloeibare media boven het oppervlak van de biofilm, die, in de loop van de groei, bewolkt met planktonische cellen krijgt. Naast deze zorgen, is het ook belangrijk om te minimaliseren van strooilicht in de optische set-up zoveel mogelijk, bijvoorbeeld door het bedekken van reflecterende oppervlakken aan de binnenkant van de incubator — hierdoor scherper gedessineerde biofilms te verkrijgen. Op een verwante nota, kunnen scherper biofilm patronen ook worden verkregen met behulp van een photomask om te controleren van verlichting patronen (figuur 3D, figuur 4C). Veelvoorkomende problemen vereisen probleemoplossing omvatten projector betrouwbaarheidsproblemen bij hogere temperaturen (b.v., 37 ° C), die kunnen worden geminimaliseerd door de biofilm groei bij lagere temperaturen (b.v., 30 ° C) incuberen, evenals computersoftware die zorgt ervoor dat updates van het besturingssysteem of blauw licht filteren tijdens nachtelijke groei (tabel 1). Het is ook belangrijk op te merken dat, afhankelijk van de projector en incubator model gebruikt, het is ook mogelijk dat de warmte van de projector in een hogere binnentemperatuur resulteren zal dan de incubator instellen temperatuur, die mogelijk moet worden gecorrigeerd.

Het kritische deel van hoofdstuk 3 is het verkrijgen van betrouwbare en herhaalbare bacteriële monsters voordat ze door de verlichting worden veroorzaakt. Om deze reden, is het aanbevolen om het verkrijgen van klonen bacteriekolonies pDawn-Ag43 door ze uit op een agarplaat strepen en vervolgens met behulp van de vloeibare cultuur stappen om ervoor te zorgen dat de bacteriën verlicht/veroorzaakte in de late fase van de exponentiële groei in een herhaalbare wijze.

Tot slot, het kritische deel van hoofdstuk 4 is grondig, maar ook zacht, weg te wassen de planktonische cellen die overblijven na de biofilm patronen protocol; Dus, is het aanbevolen om meerdere zachte spoelen stappen met PBS.

In vergelijking met bestaande technieken voor cel patronen^5,heeft⁶, optische biofilm patronen op basis van pDawn-Ag43 een redelijk lage barrière van binnenkomst te gebruiken, in die zin dat het vereist geen microfabrication, schoon-kamer faciliteiten, complex chemie, of de voorbehandeling van het oppervlak, is nog stilstaand kundig voor patroon met de hoge resolutie (25 μm) die doorgaans samenhangen met microfabrication technieken. De methode breidt vorige werk op bacteriële fotolithografie voor het beheersen van gen expressie¹⁷. PDawn-Ag43-plasmide is momenteel beperkt tot E. coli, maar het maakt gebruik van een pUC gebaseerde oorsprong van replicatie, pDawn en Ag43 beide compatibel in andere (gramnegatieve) bacteriesoorten zijn. Genetische technieken zijn beschikbaar voor de potentieel invoering van licht-gereglementeerde biofilm vorming aan verschillende bacteriesoorten en vertegenwoordigt een mogelijke richting voor toekomstig onderzoek. Een andere mogelijke beperking van de techniek is dat het werkt door het verhogen van de vorming van de biofilm in stammen met zwakke inheemse biofilm vorming (b.v., MG1655 E. coli). Echter, de stammen met sterke inheemse biofilm vorming hebben biofilms vorm ongeacht verlichting voorwaarden, uitschakeling van patroon biofilm vorming met behulp van pDawn-Ag43 zoals beschreven hier; nog blijken optogenetic technieken nog steeds die van toepassing zijn bij het reguleren van biofilm vorming. Wij stellen vast dat in andere contexten, alternatieve methoden van biofilm patronen beschikbaar, zoals via optische c-di-GMP modulatie¹⁸kunnen zijn.

Globaal, pDawn-Ag43 gebaseerd patronen zullen geschikt zijn voor gebruik in toepassingen die onderzoeken van het effect van biofilm structuur op functie¹ en dus kon profiteren van afstembare controle over biofilm patronen — een bijzonder relevant in het volgende voorbeeld wil is de studie van microbiële ecologie in biofilms². Toekomstige richtingen omvatten maken patroon biomaterialen^8,9 en/of gestructureerde bacteriële Gemeenschappen. Alternatieve toepassingen van dit toegankelijk protocol ook bio-art¹⁹, gegeven het duidelijke esthetische potentieel, evenals de biowetenschappen formele en informele onderwijs^20,21,22. Vanuit educatief oogpunt, het protocol hier beschreven combineert vele relevante technieken (bacteriële cultuur, transformatie, optica/optogenetics) en is ook modulair uitbreidbaar (b.v.microfluidics omvatten).

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
DH5alpha/pDawn-Ag43	Addgene	107742	DH5alpha kloneringsstam met het pDawn-Ag43 plasmide - plasmide moet worden overgezet naar de E. coli stam van belang voor gebruik
MG1655 E. coli	Coli Genetic Stock Center - Yale University	CGSC #6300	MG1655 werd gebruikt als E. coli stam van belang in de representatieve resultaten van dit artikel
RFP expressieplasmide	iGEM biobricks	J04450-pSB4K5bb	Er bestaan veel opties om fluorescerende bacteriën te verkrijgen - zorg er bij gebruik van een plasmide voor dat de backbone niet in conflict is met de colE1 ori van pDawn-Ag43
Plasmidemoniteringskit	Qiagen	27104
LB-bouillonpoeder	Affymetrix	75852	Voeg 20 g/L toe aan water, autoclaveer, voeg 50 μg/mL spectinomycine toe om steriele LB+spec te krijgen
LB-agarpoeder	Affymetrix	75851	Voeg 35 g/L toe aan water, autoclaveer, voeg 50 μg/mL spectinomycine toe, giet in petrischalen om steriele LB+spec platen te krijgen
Petrischalen	Fisherbrand	431760
Spectinomycine hydrochloride pentahydraat	abcam	ab141968	Maak een 1000x stockoplossing van 50mg/mL in water, filter steriliseer en verdun in media zoals nodig
Glycerol	Sigma-Aldrich	G5516	Meng in een 1:1 verhouding met water, steriliseer door autoclaven of filteren om 50% glycerol te verkrijgen
M63 mediazouten 5X oplossing	Bio-world	705729	Voeg cas-aminozuren, glucose en MgSO4 toe, breng naar 1X zoutenconcentratie door steriele water toe te voegen
Casaminozuren	Amresco	J851	Maak 20% stockoplossing in water, filter steriliseer en voeg toe aan M63 als supplement (uiteindelijke concentratie 0,1%)
D-glucose	Sigma-Aldrich	G8270	Maak 20% stockoplossing in water, filter steriliseer en voeg toe aan M63 als supplement (uiteindelijke concentratie 0,2%)
Magnesiumsulfaat	Sigma-Aldrich	M7506	Maak 1 M stockoplossing in water, autoclaveer en voeg toe aan M63 als supplement (uiteindelijke concentratie 1 mM)
Kristalviolet	Acros organics	212120250	Verdun tot 0,1% in water voor gebruik
Zelfhardende montagemedia (Shandon immumount)	Thermo Scientific	9990402	Gebruik om monsters op lange termijn te bewaren voor fluorescentiebeeldvorming
Fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) oplossing	Gibco	10010023	Kan ook PBS gebruiken dat is bereid uit poeder / tabletten
6-welplaat	Fisherbrand	351146	Gebruikt als biofilm kweekschaal voor representatieve resultaten
PDMS-kit	Dow	SYLGARD 184	Kan worden gebruikt om gesloten microkamerholtes te maken met behulp van zachte lithographie
1 mL spuit	BD spuit	309659	Voor gebruik met vloeistofverwerking met gesloten microkamers
Bote punt naald	CML supply	901-23-050	Bevestigt aan 1 mL spuit
Lab tape	Fisherbrand	15-901	Gebruik om kweekkamer aan incubator plafond te bevestigen
Bacteriële incubator	Sheldon Manufacturing	SMI6	Zorg ervoor dat de binnenhoogte van de incubator voldoende is om de projector op het plafond te focussen
Draagbare projector	Ivation	IV-PJ-PRO-4-1	Er bestaan veel draagbare projectormodellen, pDawn-Ag43 is getest met meerdere modellen, inclusief LED/laser gebaseerd, met blauw lichtkanaal variërend van 450-460nm centrale golflengte
Optische breadboardbasis	ThorLabs	MSB6	Basis voor optisch opstelling om projector vast te houden - vele andere opstellingen mogelijk, moet projector slechts stevig aan de onderkant van de incubator worden vastgehouden, naar boven gericht
Optische paal	ThorLabs	TR8	2 palen nodig - een om verticaal uit te breiden vanaf breadboardbasis, een horizontaal bevestigd via rechthoekige klem
Optische paal rechthoekige klem	ThorLabs	RA90	Verbindt verticale en horizontale palen
Monteringsbasis	ThorLabs	BA1S	Verbindt optische breadboardbasis en verticale paal
1/4"-20 schroef	ThorLabs	SH25S050	Bevestigt verticale paal aan montagebasis, montagebasis aan breadboardbasis
1/4"-20 instelschroef	ThorLabs	SS25E63D	Verbindt horizontale paal met projector via statief schroefgat
Optische vermogensmeter	Newport	840	Gebruik met vermogensmeterdetector om projectorverlichtingsintensiteit te meten - er bestaan veel vermogensmetermodellen, het gebruik van een die een uitbreidbare detector heeft, zal het meten vergemakkelijken
Optische vermogensmeterdetector	Newport	818-UV	Verbindt met vermogensmeter (boven) - UV-detector is niet strikt noodzakelijk omdat blauw licht binnen het zichtbare bereik ligt
Instelbare ND-filter	K&F Concept	SKU0689	Instelbaar (door te draaien) neutraal dichtheidsfilter - plaats boven projectoropening
Presentatie-projectorsoftware	Microsoft	Powerpoint	Elke software die tekenen / presenteren mogelijk maakt, is voldoende
CAD-software	Autodesk	AutoCAD	Gebruikt voor het ontwerpen van fotomaskers, veel maskerprintdiensten zijn compatibel met AutoCAD-bestanden
Filmfotomasker	Fineline Imaging	n/a	Er bestaan veel fotomaskerprinterdiensten voor hoge resolutie (>30000DPI) filmfotomaskerprinten