Deze techniek wordt beschreven real-time opname van zuurstofverbruik en extracellulaire verzuring tarieven in het netvlies weefsel transplanteren muis met behulp van een extracellulaire flux-analyzer.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Meting van de energie-stofwisseling in transplanteren retinale weefsel met behulp van extracellulaire Flux-analyse
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Hoge gezichtsscherpte visie is een zwaar energieverbruikende proces, en het netvlies heeft verscheidene unieke aanpassingen precies om dergelijke eisen met behoud van de transparantie van de visuele as ontwikkeld. Verstoringen op dit delicate evenwicht veroorzaken verblindende ziekten, zoals diabetische retinopathie. Het begrip van energie metabolisme veranderingen in het netvlies tijdens ziekte is dus noodzakelijk om de ontwikkeling van rationele therapieën voor verschillende oorzaken van vison verlies. De recente komst van verkrijgbare extracellulaire flux analyzers heeft de studie van retinale energiemetabolisme toegankelijker gemaakt. Dit protocol beschrijft het gebruik van dergelijke een analysator voor het meten van bijdragen aan het netvlies energievoorziening door haar twee beginsel wapens - oxidatieve fosforylatie en glycolyse - door het kwantificeren van de veranderingen in het zuurstof verbruik (OCR) en extracellulaire verzuring tarieven (ECAR) als proxy's voor deze trajecten. Deze techniek wordt gemakkelijk uitgevoerd in transplanteren retinale weefsel, vergemakkelijking van de beoordeling van reacties op meerdere farmacologische agenten in een enkele experiment. Metabole handtekeningen in het netvlies van de dieren ontbreekt staaf fotoreceptor signalering worden vergeleken met wild-type besturingselementen met behulp van deze methode. Een belangrijke beperking bij deze techniek is het gebrek aan vermogen om te discrimineren tussen licht aangepast en dark-adapted energie gebruik, een belangrijke fysiologische overweging in netvlies weefsel.
Inleiding
Het netvlies is een van de meest energie-eisen weefsels in het centrale zenuwstelsel1. Zoals de meeste weefsels genereert het adenosine trifosfaat (ATP) via glycolyse in het cytosol of via oxidatieve fosforylatie in de mitochondriën. De energieke voordeel van oxidatieve fosforylatie over glycolyse te produceren van ATP van één molecuul glucose is duidelijk: 36 moleculen van ATP gegenereerd op basis van de voormalige vs. 2 moleculen van ATP gegenereerd op basis van de laatste. Dienovereenkomstig, retinale neuronen is voornamelijk afhankelijk van mitochondriale ademhaling voor energievoorziening en dit komt tot uiting d....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Protocollen gevolgd van de Association for Research in visie en oogheelkunde-instructie voor het gebruik van dieren en zijn goedgekeurd door de Universiteit van Washington.
1. dierlijke voorbereiding
- Dieren houden in standaard behuizing met een 12 uur donker aan 12 uur licht cyclus. Begin experimenten op gestandaardiseerd keer circadiane-effecten te vermijden, meestal in de ochtend kort na de lichten zijn ingeschakeld.
2. oplossing voorbereiding
- Base media voor te bereiden door het oplossen van 8.4 mg poeder media in tweemaal gedestilleerd H2O (ddH2van O) en breng a....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Met behulp van de beschreven technieken (samengevat in Figuur 1), werden retinale explantaten van 8 weken oude wild type (WT) muizen vergeleken met leeftijd - en achtergrond-matched transducine null muizen (Gnat1- / -). Omdat Gnat1- / - dieren ontbreken de machines te sluiten cyclische-nucleotide gated ionenkanalen in reactie op lichte stimuli, hun rod researchdieren blijven depolarized zelfs in lichte
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
OCR en ECAR worden gemakkelijk gemeten in transplanteren retinale weefsel met behulp van een bioanalyzer met behulp van de beschreven technieken. Deze methode vertrekt van die van andere groepen in verschillende kritische stappen. Netvlies weefsels zijn geïsoleerd door middel van een grote cornea incision zonder enucleating van de hele wereld, zoals oorspronkelijk beschreven door Winkler15. Deze methode van retinale isolatie zorgt voor een snelle overdracht van het oog van de levende in de weefsel.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben niets te onthullen.
Dankbetuigingen
Wij danken Dr. Alexander Kolesnikov en Dr. Vladimir Kefalov voor het verstrekken van Gnat1- / -muizen, voor nuttige feedback en advies en voor het lezen van het manuscript.
Dit werk werd gesteund door NIH EY025269 (RR), het onderzoekscentrum van de Diabetes aan de Washington University - NIH DK020579 (JRM en RR), een carrière ontwikkeling Award van onderzoek te voorkomen blindheid (RR), de Horncrest Foundation (RR), een carrière ontwikkeling Award van JDRF () JRM), NIH DK101392 (CFS), DK020579 (CFS), DK056341 (CFS) en DK114233 (JRM).
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Seahorse XF24 Extracellular Flux Analyzer | Agilent, Santa Clara, CA | ||
| Seahorse XF24 Islet Capture FluxPak (includes: Islet Capture Microplate, Sensor Cartridge and Calibrant Solution) | Agilent, Santa Clara, CA | 101174-100 | Bevat islet capture microplate, sensor cartridge en calibrant oplossing |
| RPMI 1640 Media (Poederachtig medium) | Millipore-Sigma | R1383 | RPMI 1640 Media met L-Glutamine en zonder glucose of natriumbicarbonaat |
| D-Glucose | Millipore-Sigma | G8270 | 1M D-Glucose gefilterd, voor mediavoorbereiding |
| Natriumpyruvaat | Corning | 25000CI | 100 mM natriumpyruvaat |
| Antimycin-A | Millipore-Sigma | A8674 | Mitochondriale stressprotocol component |
| FCCP | Millipore-Sigma | C2920 | Mitochondriale stressprotocol component |
| Rotenone | Millipore-Sigma | R8875 | Mitochondriale stressprotocol component |
| 2-deoxyglucose | Millipore-Sigma | D6134 | Glycolyseprotocol component |
| 1 mm huidbiopsie ponsen met plunjer | Integra-Miltex | 33-31AA-P/25 | Explantatietool voor retinaweefsel |
| Dumont Mini-Forceps Recht | Fine Science Tools | 11200-10 | Explantatietool voor retinaweefsel |
| Dumont Medisch #5/45 Forceps- Hoek 45 graden | Fine Science Tools | 11253-25 | Explantatietool voor retinaweefsel |
| Dumont #7 Forceps - Gebogen | Fine Science Tools | 11271-30 | Explantatietool voor retinaweefsel |
| Quant-iT Picogreen dsDNA Assay Kit | Fisher Scientific | P7589 | Loading normalisatie assay |
| Trizma base (Tris base) | Millipore-Sigma | T6066 | Component van lysis buffer |
| Triton X-100 (polyethyleenglycol tert-octylfenylether) | Millipore-Sigma | X100 | Component van lysis buffer |
| 0.5M EDTA pH 8.0 | Ambion | AM9262 | Component van lysis buffer |
| C57BL/6J muizen | Jackson Laboratories | Stam 000664 | Dieren |
| Gnat1-/- en achtergrond-gematchte Gnat1+/+ | Vladimir Kefalov, PhD; Washington University School of Medicine | Dieren |
Referenties
- Wong-Riley, M. T. Energy metabolism of the visual system. Eye and brain. 2, 99-116 (2010).
- Ames, A. 3rd, Li, Y. Y., Heher, E. C., Kimble, C. R. Energy metabolism of rabbit retina as related to function: high cost of Na....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
