Functionele oppervlak-immobilisatie van genen met behulp van meerstaps Strand Displacement lithografie

Summary

Op een ondergrond, die kan worden gebruikt voor het uitvoeren van cel-vrije gen expressie experimenten op biochips beschrijven we een eenvoudige lithografische procedure voor de immobilisatie van gen-lengte DNA moleculen.

Abstract

Immobilisatie van genen op lithographically gestructureerde oppervlakken kan de studie van verzuilde gen expressie processen in een open microfluidic bioreactor systeem. In tegenstelling tot andere benaderingen naar kunstmatige cellulaire systemen zorgt een dergelijke opstelling voor een continue aanvoer gen expressie reagentia en gelijktijdige aftappen van afvalproducten. Dit vergemakkelijkt de tenuitvoerlegging van cel-vrije gen expressie processen gedurende langere perioden van tijd, die belangrijk is voor de realisatie van dynamische gene regelgevende feedbacksystemen. Hier bieden we een gedetailleerd protocol voor de fabrikatie van genetische biochips met behulp van een eenvoudige-en-klare lithografische techniek gebaseerd op DNA strand displacement reacties, die uitsluitend verkrijgbare onderdelen gebruikt. We bieden ook een protocol over de integratie van de verzuilde genen met een Polydimethylsiloxaan (PDMS)-gebaseerde microfluidic systeem. Bovendien laten we zien dat het systeem compatibel is met totale interne reflectie (TIRF) fluorescentie microscopie, die kan worden gebruikt voor de directe observatie van moleculaire interacties tussen DNA en de moleculen die zijn opgenomen in de expressie mix.

Introduction

Cel-gratis genexpressie reacties van groot belang voor diverse toepassingen in de biochemie, biotechnologie en synthetische biologie zijn. Cel-vrije expressie van eiwitten speelde voor de bereiding van zuivere EiwitSteekproeven, die de basis voor tal van studies in de structurele biologie vormden. Bijvoorbeeld, werden cel-vrije systemen met succes gebruikt voor de expressie van eiwit complexen¹ of membraan eiwitten², die zijn moeilijk te produceren met behulp van cel-gebaseerde expressie. Met name, cel-gratis genexpressie reacties ook gebruikt werden om het verhelderen van de structuur van de genetische code, beginnend m....

Protocol

Opmerking: Een tijdschema voor de stappen in de verschillende secties wordt gegeven in de aanvullende informatie (sectie 1).

1. chip Fabrication

Opmerking: als substraten, gebruik silicium wafers (100 mm diameter, 0.525 mm dikte) met een 50 nm dikke laag van siliciumdioxide of glas dia's (24 mm x 24 mm, no. 1.5; 22 mm x 50 mm, nr. 4). Afhankelijk van de toepassing, andere maten en diktes mogelijk geschikter zijn.

1. Schoonmaken van de substraten via een RCA schoon procedure (water, ammoniumhydroxide NH₃(aq) 30% en waterstofperoxide H₂O₂ 30%, met een onderlinge verh....

Results

In twee stappen Litho: Figuur 5 toont het resultaat van een lithografische proces van twee stappen op een glasplaatje met overlappende patronen van fluorescently geëtiketteerde DIS strengen.

Uitdrukking van een fluorescente proteïne van een gen borstel: Figuur 6 toont de expressie van de fluorescente proteïne YPet van geïmmobiliseerdet DNA. Op verschillende punten in ti.......

Discussion

Bephore lithografie is een robuuste en veelzijdige techniek voor het patroon immobilisatie van DNA of RNA. Nog, is de procedure omvat verschillende stappen, die - gewijzigd - kunnen er een oorzaak voor de storing of verminderde prestaties van het systeem.

Een cruciale stap in de fabricage van Bephore chips is de PEGylation van de drager vervagen, waardoor de biocompatibiliteit van het oppervlak. Hier, is de schoonmaak stap met een RCA-procedure belangrijk, omdat het ook het oppervlak voor de l.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Silicon wafer with 50 nm silicon dioxide (Bephore substrate)	Siegert Wafer		Thickness (µm): 525 ±25, Diameter (mm): 100
Silicon wafer (for PDMS master mold)	Siegert Wafer		Thickness (µm): 525 ±25, Diameter (mm): 76.2 (3”)
Glass slides no. 4	Menzel		22 mm x 50 mm
Glass slides no. 1.5	Assistent		24 mm x 24 mm
Biotin-PEG-Silane	Laysan Bio		MW 5,000
Anhydrous toluene	Sigma Aldrich (Merck)	244511
Streptavidin	Thermo-Fisher Scientific	S888
DNA	Integrated DNA Technologies (IDT)
Phusion High-Fidelity PCR Master Mix with HF Buffer	New England Biolabs	M0531S	PCR kit
Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System	Promega	A9281	Spin-column PCR clean-up kit
PURExpress	New England Biolabs	E6800S	Cell-free expression system
PDMS	Dow Corning	Slygard 184
FluoSpheres	Thermo-Fisher Scientific	F8771
PTFE tubing (ID: 0.8mm, OD: 1.6 mm)	Bola	S 1810-10
EpoCore 20	micro resist technology GmbH		Photoresist
mr-Dev 600	micro resist technology GmbH		Photoresist developer
Ti-Prime	MicroChemicals		Adhesion promoter
Two-component silicon glue	Picodent	Twinsil
UV-protection yellow foil	Lithoprotect (via MicroChemicals)	Y520E212
Equipment
Masks for photolithography	Zitzmann GmbH		64.000 dpi, 180x240 mm
Upright microscope	Olympus	BX51	Photolithography and fluorescence imaging
60x water immersion objective	Olympus	LumPlanFl	Used with Olympus BX51, NA 0.9
20x water immersion objective	Olympus	LumPlanFl	Used with Olympus BX51, NA 0.5
Camera	Photometrics	Coolsnap HQ	Used with Olympus BX51
Ligtht source	EXFO	X-Cite 120Q	Used with Olympus BX51
Inverted microscope	Nikon	Ti2-E	Fluorescence imaging of gene expression
4x objective	Nikon	CFI P-Apo 4x Lambda	Used with Nikon Ti2-E
Camera	Andor	Neo5.5	Used with Nikon Ti2-E
Light source	Lumencor	SOLA SM II	Used with Nikon Ti2-E
Cage incubator	Okolab	bold line	Used with Nikon Ti2-E
Pressure Controller	Elveflow	OB1 MK3
NanoPhotometer	Implen		DNA concentration measurement
Plasma cleaner	Diener	Femto	200 W, operated at 0.8 mbar with the sample in a Faraday cage