Method Article

Functionele oppervlak-immobilisatie van genen met behulp van meerstaps Strand Displacement lithografie

DOI:

10.3791/58634

⸱

October 25th, 2018

 ,  ,  , 
1Physics Department, Technical University of Munich

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Op een ondergrond, die kan worden gebruikt voor het uitvoeren van cel-vrije gen expressie experimenten op biochips beschrijven we een eenvoudige lithografische procedure voor de immobilisatie van gen-lengte DNA moleculen.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Immobilisatie van genen op lithographically gestructureerde oppervlakken kan de studie van verzuilde gen expressie processen in een open microfluidic bioreactor systeem. In tegenstelling tot andere benaderingen naar kunstmatige cellulaire systemen zorgt een dergelijke opstelling voor een continue aanvoer gen expressie reagentia en gelijktijdige aftappen van afvalproducten. Dit vergemakkelijkt de tenuitvoerlegging van cel-vrije gen expressie processen gedurende langere perioden van tijd, die belangrijk is voor de realisatie van dynamische gene regelgevende feedbacksystemen. Hier bieden we een gedetailleerd protocol voor de fabrikatie van genetische biochips met behulp van een eenvoudige-en-klare lithografische techniek gebaseerd op DNA strand displacement reacties, die uitsluitend verkrijgbare onderdelen gebruikt. We bieden ook een protocol over de integratie van de verzuilde genen met een Polydimethylsiloxaan (PDMS)-gebaseerde microfluidic systeem. Bovendien laten we zien dat het systeem compatibel is met totale interne reflectie (TIRF) fluorescentie microscopie, die kan worden gebruikt voor de directe observatie van moleculaire interacties tussen DNA en de moleculen die zijn opgenomen in de expressie mix.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Cel-gratis genexpressie reacties van groot belang voor diverse toepassingen in de biochemie, biotechnologie en synthetische biologie zijn. Cel-vrije expressie van eiwitten speelde voor de bereiding van zuivere EiwitSteekproeven, die de basis voor tal van studies in de structurele biologie vormden. Bijvoorbeeld, werden cel-vrije systemen met succes gebruikt voor de expressie van eiwit complexen1 of membraan eiwitten2, die zijn moeilijk te produceren met behulp van cel-gebaseerde expressie. Met name, cel-gratis genexpressie reacties ook gebruikt werden om het verhelderen van de structuur van de genetische code, beginnend met de baanbrekende experimenten door Nirenberg en Matthaei in 19613.

Onlangs is er een hernieuwde belangstelling voor cel-vrije methoden in de biotechnologie en synthetische biologie4,5,6. Cel-vrije systemen kunnen worden aangevuld met niet-biologische verbindingen, en onderdelen van diverse biologische oorsprong is cumuleerbaar gemakkelijker7. Hoewel cel-vrije systemen hebben de schijnbare nadeel dat ze niet "groeien en verdelen", is het denkbaar om te bereiden open cel-vrije bioreactoren met metabole basisfuncties en laat ze synthetiseren metabolieten wanneer voorzien van eenvoudige koolstof en energie ingangen8. Op het opkomende gebied van synthetische biologie beloven cel-vrije systemen om een meer voorspelbare "chassis" voor de uitvoering van synthetische biologische functies.

Momenteel, cel-vrije gen expressie reacties worden uitgevoerd hetzij met behulp van cel haalt (uit verschillende bronnen, zoals bacteriën, gist, insecten), of transcriptie/vertaling-systemen die zijn geoptimaliseerd voor verschillende toepassingen (bijvoorbeeld prokaryote vs. Eukaryotische genexpressie, productie van membraaneiwitten, enz.). Een populair protocol voor de bereiding van het extract van de bacteriële cel (vaak genoemd TXTL) is onlangs geleverd door V. Noireaux en collega's9. De biofysische eigenschappen geweest grondig gekarakteriseerd10, en het TXTL-systeem heeft al met succes gebruikt voor het uitvoeren van een reeks complexe biochemische taken: bijvoorbeeld, de vergadering van functionele bacteriofagen via cel-vrije expressie van de bacteriofaag genoom11, de synthese van de bacteriële eiwitten door samensmelting van filamenten12of de uitvoering van cel-vrije gene circuits13,14.

Een ander systeem populair in cel-vrij van synthetische biologie is het PURE systeem, dat opnieuw is samengesteld uit gezuiverde onderdelen15,16. Vergeleken met het TXTL-systeem, bevat het geen nucleasen of eiwit afbraak machines. Terwijl de afbraak van lineaire DNA is RNA-moleculen of eiwitten minder een probleem in het PURE systeem, verval trajecten zijn eigenlijk belangrijk is voor de uitvoering van dynamische functies. Teneinde het effect van exonuclease afbraak van lineaire gene sjablonen in het TXTL systeem (via RecBCD), dient het eiwit GamS beveiligen met een einde te worden toegevoegd. Zowel de TXTL als het PURE systeem zijn commercieel verkrijgbaar.

Een onderwerp verwant nauw aan cel-vrije biologie betreft de studie van het effect van de brandcompartimentering op biochemische reacties, en verder de oprichting van kunstmatige cel-achtige structuren of protocells17,18,19 ,20. Onderzoek naar kunstmatige cellen betekent meestal dat de inkapseling van een biochemische reactie systeem binnenkant van vesiculaire compartimenten fosfolipiden of andere amfifielen in mindering gebracht. Hoewel dergelijke systemen helpen om fundamentele aspecten van brandcompartimentering, of de opkomst van buiten en zelfreplicerende structuren te verkennen, ze geconfronteerd met de typische problemen van gesloten systemen: in het ontbreken van een goed functionerende stofwisseling en passende membraan vervoer mechanismen, is het moeilijk om te houden van de verzuilde Reacties lopen voor langere tijd - brandstof moleculen zijn opgebruikt en afvalstoffen zich ophopen.

Een interessant alternatief voor brandcompartimentering binnenkant van dergelijke cel nabootsen compartimenten is de ruimtelijke organisatie van genetisch materiaal photolithographic referentiemethoden. Immobilisatie van "genen op een chip" was gepionierd door de Bar-Ziv-groep aan het Weizmann Instituut meer dan tien jaar geleden21. Onder de belangrijke kwesties die moesten worden opgelost waren de aspecifieke adsorptie van DNA en de mogelijke denaturatie van eiwitten op het oppervlak van de chip. Bar-Ziv et al. ontwikkelde een speciale fotolithografie weerstaan genoemd "Daisy", die bestond uit een reactieve terminal silane voor immobilisatie van de moleculen resist op silicium dioxide oppervlakken, een lange polyethyleenglycol (PEG)-spacer die verzekerd biocompatibiliteit en een photocleavable headgroup, die werd omgebouwd tot een reactief amine bij bestraling met ultraviolet (UV) licht. Het is aangetoond dat Daisy kan worden gebruikt voor het immobiliseren van gen-lengte DNA moleculen (met een lengte van enkele kilo-basenparen (kbp)) op een oppervlak van de chip. Vanuit een polymeer natuurkunde oogpunt vertegenwoordigd de systemen polymeer borstels geënt op een stevige ondergrond. Vanwege de aard van de polyelectrolyte van DNA, is de conformatie van deze borstels sterk beïnvloed door osmotische en andere ion-specifieke effecten22,23.

Bovenal is het aangetoond dat substraat-geïmmobiliseerd genen nog steeds functionele zijn en kunnen getranscribeerde en vertaald in RNA en eiwitten. Gene borstels zijn toegankelijk voor RNA polymerase van oplossing24, en de complexe macromoleculaire mengsel van de transcriptie/vertaling is niet gedenatureerd aan het oppervlak. Een van de voordelen van immobilisatie van genetische componenten op een substraat is dat ze kunnen worden bediend in een open microfluidic reactor systeem dat voortdurend wordt geleverd met de voorloper van de kleine moleculen en uit welke afvalstoffen verwijderde25 kunnen , 26.

Wij recent ontwikkelde een variant op deze methode genoemd Bephore (voor biocompatibel elektronenbundel en fotoresist)27, die was uitsluitend gebaseerd op verkrijgbare onderdelen en volgorde-specifieke DNA strand invasie reacties voor gebruikt de realisatie van een eenvoudig te implementeren meerstaps litho-procedure voor de oprichting van chip gebaseerde kunstmatige cellen. Een schematisch overzicht van de procedure is afgebeeld in Figuur 1. Het is gebaseerd op DNA haarspeld moleculen bevat een photocleavable-groep, die zijn geïmmobiliseerd op een biocompatibele PEG-laag. Photocleavage van de haarspeld bloot een single-stranded steunpunt reeks, door welke DNA moleculen van belang (met de "displacing" DIS volgorde) aangesloten via steunpunt-gemedieerde strand invasie worden kunnen.

Terwijl Bephore mogelijk eenvoudiger is te implementeren, Daisy laat de realisatie van de zeer dichte en schoon "gene borstels", die heeft voordelen in bepaalde toepassingen. In principe echter kan Daisy en Bephore lithografie gemakkelijk gecombineerd worden. Een verwante lithografie methode met behulp van DNA strand verplaatsing voor het structureren van DNA borstels op goud werd eerder ontwikkeld door Huang et al., maar werd niet gebruikt in het kader van cel-vrije gen expressie28,29.

In het volgende protocol bieden wij dat een gedetailleerde beschrijving van de productie van DNA borstels voor cel-vrije genexpressie met behulp van de methode Bephore. We beschrijven hoe de gene chips zijn vervaardigd en voorbeelden van het gebruik van meerdere stappen foto-lithografie voor het ruimtelijk gestructureerde immobilisatie van genen op een chip. We bespreken ook de fabricage van reactie kamers en de toepassing van microfluidics voor de uitvoering van de op de chip gen expressie reacties.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opmerking: Een tijdschema voor de stappen in de verschillende secties wordt gegeven in de aanvullende informatie (sectie 1).

1. chip Fabrication

Opmerking: als substraten, gebruik silicium wafers (100 mm diameter, 0.525 mm dikte) met een 50 nm dikke laag van siliciumdioxide of glas dia's (24 mm x 24 mm, no. 1.5; 22 mm x 50 mm, nr. 4). Afhankelijk van de toepassing, andere maten en diktes mogelijk geschikter zijn.

  1. Schoonmaken van de substraten via een RCA schoon procedure (water, ammoniumhydroxide NH3(aq) 30% en waterstofperoxide H2O2 30%, met een onderlinge verhouding 5:1:1)
    1. Meng water en ammoniak oplossing in een bekerglas van glas en verwarm het mengsel tot 70 ° C op een hete plaat tijdens het roeren.
    2. Voeg de waterstofperoxide en het substraat. Voor hogere doorvoer, plaatst u meerdere substraten (met name de kleine glazen dia's) in een houder van polytetrafluorethyleen (PTFE).
    3. Na 30 min, nemen het substraat, spoel het grondig met water uit een fles wassen en droog het met een stikstof-pistool. Meteen doorgaan met de PEGylation van het substraat.
      Let op: Draag een beschermingsmiddel voor huid en ogen en werken in een zuurkast. Sluit niet de afval container strak zodat de vrijlating van gas uit het mengsel.
  2. PEGylation van het substraat
    Opmerking: Herhaalde bevriezen en ontdooien van de voorraad Biotine-PEG-Silane vermindert de reactiviteit van de silane als gevolg van condensatie van lucht vocht. Daarom bereiden 5 mL-buizen met de juiste hoeveelheden Biotine-PEG-Silane (b.v. 10-20 mg) en vul ze met droge argon voor bevriezing hen tot gebruik.
    1. Biotine-PEG-Silane in droge tolueen opgelost door vortexing (5 mg/mL).
    2. Plaats het substraat in een glazen petrischaaltje (120 cm doorsnede, 2 cm hoogte) in een zuurkast.
    3. Pipetteer van de oplossing (≈200 µL voor een enkel glas cover slip, een paar mL voor een grote silicium wafer) op de drager vervagen, die betrekking hebben op het gehele oppervlak, maar voorkomen dat de oplossing stroomt over de rand van het substraat.
    4. Sluit de petrischaal. Verklein drogen van het substraat en voeg een extra dekking met een natte papieren handdoek.
    5. Na 30 min, voeg ongeveer 40 ml isopropyl alcohol, dan nemen het substraat, nogmaals grondig spoelen met isopropyl alcohol en droog het met een pistool stikstof (voor glas dia's, herinneren de gepegyleerde kant). Het bewaren van het substraat in het donker tot gebruik.
      Let op: Draag een beschermingsmiddel voor huid en ogen en werken in een zuurkast.

2. voorbereiding van genen voor immobilisatie

Opmerking: Primer sequenties, DNA wijzigingen en een voorbeeldige PCR protocol worden gegeven in de aanvullende informatie (secties 2-4).

  1. Gebruik aangepaste inleidingen aan het versterken van het gen van belang door de polymerase-kettingreactie (PCR). Een primer draagt een fluorophore voor visualisatie in fluorescentie microscopie, en de andere primer is gescheiden van de DIS-reeks door een triëthyleenglycol glycol spacer om te houden van de DIS-reeks single-stranded tijdens de PCR.
  2. Zuiveren van het DNA met een spin kit voor de zuivering van de kolom en het meten van de concentratie ervan met een fotometer absorptie. De concentratie moet niet veel lager dan 100 nM.
  3. Aanpassen van de concentratie van NaCl tot 1 M met behulp van een geconcentreerde NaCl-oplossing van 5 M. De hoge zoutconcentratie vergemakkelijkt de DNA borstel assemblage proces22.

3. fotolithografie

Opmerking: De photocleavable DNA (PC) worden behandeld als alleen in een geel-light milieu. Geel folie voor kiemvrije ruimten kan worden gebruikt voor het filteren van het licht van de conventionele wit licht lampen.

  1. Bereiding van het substraat
    1. Voorbereiden van de Bephore-mix (1 µM daar, 1,5 µM PC DNA, 7,5 µM PH DNA in 1 x PBS (phosphate buffered saline)) en de passivering mix (10 µM ongelabelde DIS DNA, 1 mg/mL BSA (bovien serumalbumine), in 1 x PBS). Beide kunnen worden opgeslagen in het donker in de koelkast voor enkele weken.
    2. Snijd het substraat in kleinere stukken (een paar cm2) met behulp van een glassnijder of door het breken van een silicium wafer langs een kristal-lijn door te drukken op een rand met een scalpel. Als een eenvoudige uitlijning merk, maakt u een korte kras vanuit het midden naar de rand van het substraat met behulp van de glassnijder. Klap kleine deeltjes off de chip met een stikstof-pistool.
    3. Meng twee druppeltjes van twee componenten siliconen lijm, het bijvoorbeeld met een pipet tip, roeren en toepassen van de lijm aan de oppervlakte van de chip, het gebied rond het puntje van de kras leeg laat (figuur 2A). De lijm vormt een hydrofobe barrière die vergemakkelijkt wassen stappen en vermindert de hoeveelheid DNA dat vereist is voor incubations. In een latere stap, kan de lijm gemakkelijk worden gepeld uit.
    4. Incubeer 10 µL (of zoveel als nodig is ter dekking van de chip) van de Bephore-mix op kamertemperatuur (RT) op de chip. Tijdens de incubatie, plaats de chip in een doos, bijvoorbeeld een pipet tip doos gedeeltelijk gevuld met water om verdamping.
    5. Na 1 h, wassen de chip unbound meerdere malen (5 x met 50 µL) door pipetteren met 1 x PBS te verwijderen Bephore-mix.
    6. Opstijgen zoveel buffer mogelijk zonder drogen van de chip en incubeer 10 µL van de passivering-mix op de chip op RT.
    7. Na 2 uur was de chip meerdere malen (10 x met 50 µL) door pipetteren met 1 x PBS voor het verwijderen van niet-afhankelijke passivering agenten.
  2. Projectie lithografie
    Opmerking: Voor lithografie, een rechtop Microscoop met een 60 x water onderdompeling doelstelling kan worden gebruikt. Verlichting keer is afhankelijk van de doelstelling, de lichtbron, het masker, het substraat (silicium chip of glazen schuif) en de gewenste DNA oppervlakte dichtheid. Met een doelstelling van 60 x, varieerden de typische blootstelling tijden minder dan één minuut voor een tweestaps litho met overlappende regio's (15 s voor silicium chips, 45 s voor glas dia's) aan 2-3 min voor een volledige blootstelling. Gebruik een cover slip (met uitzondering van gesmolten kwarts) op de top van het substraat, niet omdat het UV-licht blokkeert.
    1. Knippen van een gedrukte photomask (Zie aanvullende bestand met voorbeeldige lithografie maskers en aanvullende sectie 5) naar een juiste maat aan de houder van een geschikt masker, die kunnen worden ingevoegd op de positie van het veld stop (figuur 2B). Voor precieze scriptingregel lithografie, uitlijnen met uitlijning merken op de houder op het masker.
    2. Plaats het substraat op een dia microscopie en verplaats het naar de Microscoop fase. Invoegen voor het patroon van de muziek van Bephore glas dia's, zwarte folie (bijvoorbeeld vrije folie van de afgedrukte fotomaskers) tussen microscopie dia en Bephore dia een donkere achtergrond voorzien lithografie.
    3. Een rood filter invoegen met het pad van verlichting, focus op het oppervlak van het substraat en navigeer naar de regio van de coating, die zal worden blootgesteld, bijvoorbeeld de regio op het puntje van de kras.
    4. Voegt de masker-houder, blokkeren van de verlichting en verandert de UV-filter (figuur 2C). Bij een lage lichtintensiteit, open de sluiter en het gebruik van de camera snel richten het masker op het substraat.
    5. Blokkeren het licht pad naar de camera en het substraat op een hoge lichtintensiteit te verlichten voor de gewenste blootstellingstijd.
    6. Haal het monster van de Microscoop en verwijder voorzichtig zoveel buffer mogelijk van het substraat zonder drogen.
    7. Voeg 10-20 µL van het DNA met DIS opeenvolging. Plaats het substraat in een natte doos om te voorkomen dat het drogen. Incubeer het DNA op het substraat voor 2 h (oligonucleotides bij een micromolar concentratie) of meerdere uren/'s nachts (kbp durende DNA bij ongeveer 100 nM concentratie) op RT.
    8. Verwijderen van het DNA van de chip en meerdere malen wassen met 1 x PBS. Ter beperking van de verspilling van DNA (vooral voor langere fragmenten), het DNA ontleend aan het substraat opslaan en opnieuw gebruiken.
  3. Scriptingregel lithografie
    Opmerking: Voor nauwkeurige uitlijning van twee of meer vorderingen in een gemeenschappelijke ruimte, houd het monster op het podium om te voorkomen dat de hoekige afwijking. Zorg ervoor dat de chip droogt niet omhoog. Voor de plaatsing van verschillende DNA borstels in verschillende regio's op een substraat, gebruik een gemotoriseerde stadium te rijden naar het aangewezen gebied of een substraat met juiste uitlijning merken.
    1. Na de eerste blootstelling (punt 3.2), incubeer DNA met DIS opeenvolging op de drager vervagen. Het is belangrijk dat alle bandplaatsen als gevolg van de eerste blootstelling worden ingenomen. Daarom, incubeer oligonucleotides (10 µM) voor ongeveer 3 h op RT.
    2. Om te immobiliseren DIS gelabelde genen, plaats ze op het substraat voor enkele uren of overnachting in RT, dan wassen van het monster en de passivering mix voor een ander 2 h toevoegen op RT. Ga verder met de volgende blootstelling.
    3. Herhaal de vorige stap voor extra posities, (3.2.3 - 3.3.2).

4. PDMS apparaten

Opmerking: Bij voorkeur werken in een schone kamer. De fabricage van een apparaat PDMS volgt een standaardprotocol, zoals beschreven door McDonald et al. 30

  1. Fabricage van meester mallen via fotolithografie
    1. Reinigen van een silicium wafer (76,2 mm diameter, 525 µm dikte) met het ultrasoonapparaat in aceton gedurende 5 minuten op hoog vermogen en afspoelen met water en -geïoniseerde isopropyl alcohol. Plaats daarna de wafer op een hete plaat bij 150 ° C gedurende 15 minuten.
    2. Optioneel, ter verbetering van de hechting van weerstaan aan de wafer, voeg 2-3 mL hechting promotor en draaien op 3000 rpm voor 30 s. warmte de wafer tot 120 ° C gedurende 2 minuten.
    3. Over 2-3 mL fotoresist toevoegen (Zie Tabel van materialen). Draai de wafer voor 15 s bij 500 t/min, dan bij 3000 t/min voor 30 s. Dit moet resulteren in een 20 µm dikke laag fotoresist. Laat de laag van de fotoresist ontspannen bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten.
    4. Voor de pre blootstelling bak, plaatst u het zegel op een hete plaat bij 50 ° C gedurende 2 minuten, dan bij 85 ° C gedurende 5 min.
    5. Plaats de wafer onder de photomask met de blauwdruk van de compartimenten. Bij voorkeur, gebruik een masker-aligner. De photomask moet hebben een resolutie van 64.000 dpi (Zie aanvullende bestand met litho maskers en aanvullende sectie 5).
    6. De wafer voor 1 min met UV-licht (-line 5-10 mW/cm2) via de photomask bloot.
    7. Voor de post-exposure bak, plaatst u de wafer bij 50 ° C gedurende 2 minuten, waarna bij 85 ° C gedurende 5 min. Laat de wafer afkoelen en ontspannen gedurende 1 uur bij kamertemperatuur.
    8. Plaats de wafer in een schotel met ontwikkelaar gedurende 3 minuten terwijl het bekerglas zachtjes te schudden. Spoel de wafer met isopropyl alcohol en droog het met een stikstof-pistool. Plaats het zegel op een hete plaat bij 130 ° C voor 45 min.
  2. Voorbereiding van het PDMS apparaat
    1. Mix PDMS base en PDMS genezen agent in een verhouding 10:1 en giet het op het zegel in een gesloten recipiënt tot een laag van ongeveer 5 mm boven het zegel heeft gevormd. Voor het verkrijgen van een apparaat PDMS van slechts 1 mm dikte, spin in plaats daarvan jas de wafer met PDMS bij 100 omwentelingen per minuut gedurende 2 minuten.
    2. Plaats de container in een exsiccator en toepassen van een vacuüm (ongeveer 85 kPa) voor ongeveer 30 min. Vervolgens verwarm het PDMS tot ongeveer 70° C gedurende 1-2 uur in een oven.
    3. Scheiden het PDMS apparaat van het zegel. Snijd de PDMS in platen zodat elk stuk een aantal compartimenten bevat. In het geval dat de PDMS zal worden aangesloten op een microfluidic setup, punch gaten (1 mm doorsnede) als een inlaat en uitlaat aan de uiteinden van het aanvoerkanaal.
    4. De PDMS met isopropyl alcohol en -geïoniseerd water schoon en droog het met een stikstof-pistool. Bewaar het PDMS stofvrij.

5. de verzuilde genexpressie

Opmerking: De volgende procedure beschrijft de vergadering van een monsterhouder (Figuur 3) voor de observatie van de verzuilde genexpressie op een omgekeerde Microscoop met een kooi incubator voor temperatuurregeling. De houder is gebouwd met behulp van gemakkelijk beschikbare materialen en hulpmiddelen (3.5-5 mm dikke PVC (polyvinylchloride) kunststoffen, schroeven en moeren, boor) en kan worden aangepast aan verschillende soorten microscopen. De stappen die worden beschreven in 5.1 en 5.2 moeten worden uitgevoerd, zodanig dat beide delen van de houder tegelijkertijd klaar zijn.

  1. Vergadering van de houder van de bodem
    1. Voorbereiden van een Bephore chip met uitlijning mark (bijvoorbeeld een kras) en lijm deze op de houder van de chip met dubbelzijdig plakband (figuur 3B). De chip moet groter zijn dan het PDMS-apparaat dat betrekking op het hebben zal.
    2. Immobiliseren van één of meerdere genen op de chip (Zie secties 2 en 3).
    3. Voeg sommige vacuüm vet rond het gat in het midden van de onderste houder, dan sluit de houder van de chip.
      Opmerking: De houder van de chip nu houdt zich aan de onderkant houder door middel van het vet, met behoud van de mogelijkheid voor re-positionering van de chip in het x-y-vlak.
  2. Top houder vergadering
    1. Bereiden een dunne PDMS chip met compartimenten met behulp van de spin coating procedure in stap 4.2.1. Snijd de PDMS zo klein mogelijk te houden, bloot aan één kant te voorzien in de uitwisseling van afvalstoffen en voorloper moleculen door diffusie van een kanaal.
    2. Reinigen van een glas cover slip (24 mm x 24 mm, no. 1.5) en de achterkant van het PDMS chip (kant zonder compartimenten) met zuurstof plasma voor 42 s (geopereerd op 200 W en 0.8 mbar met het monster in een kooi van Faraday).
    3. Plaats de PDMS-chip in het midden van het glasplaatje met de compartimenten naar boven gericht. Bak het glas met het PDMS gedurende 1 uur bij 70 ° C.
    4. Toevoegen sommige vacuüm vet rond het grote gat van de top houder.
    5. Voordat u het experiment start, schoon het glasplaatje en het PDMS chip met zuurstof plasma voor 42 s tot de PDMS hydrofiele renderen.
    6. Plaatst u het glasplaatje met de PDMS op de bovenste houder ( Figuur 3 c) en druk zachtjes op het glas op het vet (Figuur 3 c).
  3. Montage van de houder
    1. Bereiden van 100 µL van een cel-vrije expressie systemen en bewaar deze op ijs.
    2. Zorgvuldig verwijderen van de buffer van de chip en een keer wassen met 10 µL van cel-vrije expressie systeem. Vervolgens Voeg 60 µL van cel-vrije expressie systeem op de chip en de twee componenten siliconen lijm verwijderen door de randen van de chip (al verwijderd in figuur 3B).
    3. Voeg 20 µL van expressie systeem op het PDMS. Na het plaatsen van de druppel op het PDMS, snel controleren in de stereoscopische Microscoop of de compartimenten goed nat zijn en zonder luchtbellen. Als er luchtbellen, proberen om ze te wassen af met de rest van de cel-vrije expressie systeem.
    4. Te monteren op de twee stukken van de houder en als u wilt uitlijnen chambers en DNA borstels, werken onder een stereoscopische Microscoop en immobiliseren van de houder van de bodem met een grijper arm, dus de twee schroeven en wingnuts zijn gemakkelijk te bereiken met beide handen (figuur 3D-F ).
    5. Plaats de bovenste houder in de onderste houder en lager totdat de cel-vrije expressie systeem druppels fuse (figuur 3D). Controleren via de stereoscopische Microscoop of de compartimenten en de uitlijning is ingeschakeld in een vergelijkbare regio in het x-y-vlak, anders Trek de hoogste houder en opnieuw positie het glas schuif over de top houder.
    6. Van de bodem, schroef de wingnuts totdat ze aan de onderzijde van de houder raken. Draai voorzichtig vast de wingnuts, terwijl de aanpassing van de compartimenten en de chip in de x-y-plane via de ingang aan de onderkant van de chip houder (de 3E figuur). Eenmaal in contact, draai de wingnuts slechts zeer voorzichtig (figuur 3F).
      Opmerking: Deze stap vereist enige ervaring en hangt af van de experimentele opstelling. Onder de Microscoop, kunnen interferentie patronen die voortvloeien uit vloeistof tussen PDMS en glas aangeven dat de toegepaste kracht te klein, terwijl een lagere intensiteit van de fluorescentie (van een DNA-borstel of uitgedrukte proteïnen) in het midden van een compartiment hints op een te hoog is Druk (Zie ook aanvullende informatie, punt 6).
    7. Spray de spons in de anti-verdamping behuizing met water en de houder in het vak invoegen. Vul een 5 mL-spuit met tweecomponenten siliconen lijm en gebruik deze om verzegel de doos (Figuur 3 g).
    8. Het vak overbrengen in een temperatuurgevoelig Microscoop en beeld van het penseel van DNA en de reactie in fluorescentie microscopie. Zelfs zonder verlichting vervaagt de fluorescentie van het penseel van DNA in een cel-vrije expressie systeem. De borstel behoudt echter haar activiteiten als kan worden aangetoond door herhaalde genexpressie van hetzelfde penseel.
      Opmerking: Wanneer u een glasplaatje Bephore in plaats van een silicium chip, de positie (boven/onder) van PDMS en Bephore chip kan worden uitgewisseld, waardoor voor het gebruik van doelstellingen met kleinere afstanden van de werken.

6. duurzame expressie in Microfluidic apparaten

Opmerking: De experimentele opzet is samengesteld uit de onderdelen weergegeven in figuur 4A. Details op de vergadering van de etappe temperatuurgevoelig worden gegeven in de aanvullende informatie (hoofdstuk 7).

  1. Cel-vrije expressie systemen en buizen
    1. Het systeem van de cel-vrije expressie in een monsterbuisje (ongeveer 200 µL) voor te bereiden. Polystyreen kralen aangeduid met fluorescente kleurstoffen kunnen worden toegevoegd aan later monitor het debiet door middel van een aanvoerkanaal.
    2. De buis verbinden met een druk-controller. Plaats de buis in een grote ijs reservoir dat koude gedurende ongeveer 12 uur houdt. Bijvullen ijs indien nodig.
      Opmerking: Als alternatief voor een druk-controller, een spuitpomp biedt een constant debiet van cel-vrije expressie systeem, zelfs als de stroom weerstand verandert, bijvoorbeeld als gevolg van luchtbellen, die met lange termijn helpen kunnen experimenten.
    3. Verbinding maken met de tube met de cel-vrije expressie systeem PTFE slang (inwendige diameter van 0,8 mm), die naar de verwarmde fase bereikt. Breken van een naald van de spuit (diameter van 0,9 mm) in 1-2 cm stukken met stompe uiteinden en één tekstgedeelte invoegen in de PTFE-buis. Later zal dienen als connector naar het PDMS. Probeer te minimaliseren van de lengte van de slang tussen het podium en de buis (figuur 4C).
    4. Voor het koelen van de PTFE-buis, wikkel het rond de grotere rubberen buis die is aangesloten op een waterreservoir van ijs en een peristaltische pomp. Tape ze samen met plakband (figuur 4C).
  2. Top houder vergadering
    1. Reinig de vlakke kant van het PDMS chip met zuurstof plasma (42 s) en plaats deze op een dia microscopie rijggat montage inlaat en uitlaat van de PDMS (figuur 4B). De gaten in het glas kunnen vooraf worden geboord met een glas boren hoofd. Zorg ervoor dat de micro-kamers niet worden geconfronteerd met het glasplaatje.
    2. Toepassing dubbelzijdig plakband op de platte kant van de PDMS houder. Plak een stuk zwarte folie (bijvoorbeeld van een lithografie-masker) in het gebied tussen de twee gaten van de houder te vermijden achtergrond fluorescentie van het plakband.
    3. Plak het glasplaatje met de PDMS-chip aan de houder.
    4. Traktatie het PDMS en de PDMS houder met het bijgevoegde glas Schuif met zuurstof plasma in een plasma reiniger (42 s).
    5. Vacuüm vet rond het grote gat in de bovenste houder van toepassing en voeg de PDMS houder (figuur 4B). De houder van het PDMS nu voldoet aan de hoogste houder, met behoud van de mogelijkheid voor re-positionering in x-y richtingen.
    6. Sluit de PTFE-buis met de spuit-naald connector bij de inlaat van de PDMS-chip. Om te vergemakkelijken de toegang tot de PDMS via de bovenste houder, kan de plastic bovenplaat kort worden verwijderd voor dit en de volgende stap.
    7. Voeg een tweede bagagestuk van PTFE slang (ongeveer 5 cm) met een spuit-naald-connector aan de uitlaat (Figuur 4 d).
    8. Positie de PDMS houder in de bovenste houder dus het is vrij om te bewegen in alle richtingen. Plaats de bovenste houder losjes op de verwarmde podium zoals in figuur 4E zonder eventuele wingnuts aanscherping.
    9. Met de Microscoop, navigeer naar de positie van het PDMS compartimenten en hen midden in het gezichtsveld van de camera's. Verplaats niet het podium vanaf dit punt op.
    10. Verwijder de bovenste houder met de PDMS van het podium.
  3. Verwarmde fase en Bephore glasplaatje
    1. De temperatuur van de verwarmde etappe ingesteld op 37 ° C
    2. Lijm een glasplaatje Bephore (nr. 4) met de gene borstels strument temperatuurregeling van de omgekeerde fluorescentie Microscoop dubbele dubbelzijdig plakband, met het merk van de uitlijning ongeveer in het midden van het gezichtsveld van de Microscoop. Deze positionering van het merk uitlijning zorgt ervoor dat de compartimenten ongeveer zal worden verlaagd tot een zelfde regio.
    3. Nemen van een afbeelding in de bijbehorende fluorescentie-kanaal van het gen penseel en haar positie in het camera beeld markeren.
    4. De buffer van het gen penseel verwijderen, maar laat het droge gaan niet. 20 µL van de cel - vrije meningsuiting systeem toevoegen aan de gene borstel en gebruik van pincet voor het verwijderen van het siliconen lijm frame.
  4. Vergadering van het microfluidic-setup
    1. Druk aan het monsterbuisje toevoegen totdat de cel-vrije expressie systeem heeft de PTFE-buis gevuld en wordt weergegeven aan de onderkant van het PDMS-apparaat. Bovendien, Pipetteer 10 µL van cel-vrije expressie systeem op de micro-kamers op de PDMS. Zorg ervoor dat de compartimenten zijn vrij van luchtbellen.
    2. Zorgvuldig lager de top houder op het glasplaatje en uitlijnen van de micro-kamers met de gen-borstel. Voordat PDMS zowel uitlijning mark bereiken het dezelfde brandvlak, gebruik de kleine schroeven aan de achterkant van de houder van het PDMS nauwkeurig uitlijnen van de x-y-positie en oriëntatie van het PDMS apparaat met de gene borstel (figuur 4E).
    3. Houd de positie en druk op de PDMS op het glasplaatje door aanscherping van de wingnuts langs de schroeven die de hoogste houder verbinden met de Microscoop fase (figuur 4E).
    4. De druk in de buis met de cel-vrije expressie systeem en de monitor de stroom van de TL parels door middel van het aanvoerkanaal (stroom tarieven tussen 0,5 tot en met 5 µl per uur worden aanbevolen) (figuur 4F) te vergroten. Indien nodig, verhogen de druk van het PDMS op het glas door aanscherping van de wingnuts.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

In twee stappen Litho: Figuur 5 toont het resultaat van een lithografische proces van twee stappen op een glasplaatje met overlappende patronen van fluorescently geëtiketteerde DIS strengen.

Uitdrukking van een fluorescente proteïne van een gen borstel: Figuur 6 toont de expressie van de fluorescente proteïne YPet van geïmmobiliseerdet DNA. Op verschillende punten in ti...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bephore lithografie is een robuuste en veelzijdige techniek voor het patroon immobilisatie van DNA of RNA. Nog, is de procedure omvat verschillende stappen, die - gewijzigd - kunnen er een oorzaak voor de storing of verminderde prestaties van het systeem.

Een cruciale stap in de fabricage van Bephore chips is de PEGylation van de drager vervagen, waardoor de biocompatibiliteit van het oppervlak. Hier, is de schoonmaak stap met een RCA-procedure belangrijk, omdat het ook het oppervlak voor de l...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende belangen hebben.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

We mijn dankbaarheid uitspreken aan financiële steun voor dit project door de Volkswagen-Stiftung (grant nr. 89 883) en de European Research Council (subsidie overeenkomst nr. 694410 - AEDNA). M.S.-S. ondersteuning door de DFG via GRK 2062 erkent.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Silicon wafer with 50 nm silicon dioxide (Bephore substrate)Siegert WaferThickness (µm): 525 ±25, Diameter (mm): 100
Silicon wafer (for PDMS master mold)Siegert WaferThickness (µm): 525 ±25, Diameter (mm): 76.2 (3”)
Glass slides no. 4Menzel22 mm x 50 mm
Glass slides no. 1.5Assistent24 mm x 24 mm
Biotin-PEG-SilaneLaysan BioMW 5,000
Anhydrous tolueneSigma Aldrich (Merck)244511
StreptavidinThermo-Fisher ScientificS888
DNAIntegrated DNA Technologies (IDT)
Phusion High-Fidelity PCR Master Mix with HF BufferNew England BiolabsM0531SPCR kit
Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System PromegaA9281Spin-column PCR clean-up kit
PURExpressNew England BiolabsE6800SCell-free expression system
PDMS Dow CorningSlygard 184
FluoSpheresThermo-Fisher ScientificF8771
PTFE tubing (ID: 0.8mm, OD: 1.6 mm)BolaS 1810-10
EpoCore 20micro resist technology GmbHPhotoresist
mr-Dev 600micro resist technology GmbHPhotoresist developer
Ti-PrimeMicroChemicalsAdhesion promoter
Two-component silicon gluePicodentTwinsil 
UV-protection yellow foilLithoprotect (via MicroChemicals)Y520E212
Equipment
Masks for photolithographyZitzmann GmbH64.000 dpi, 180x240 mm
Upright microscopeOlympusBX51Photolithography and fluorescence imaging
60x water immersion objectiveOlympusLumPlanFlUsed with Olympus BX51, NA 0.9
20x water immersion objectiveOlympusLumPlanFlUsed with Olympus BX51, NA 0.5
CameraPhotometricsCoolsnap HQUsed with Olympus BX51
Ligtht sourceEXFOX-Cite 120QUsed with Olympus BX51
Inverted microscopeNikonTi2-EFluorescence imaging of gene expression
4x objectiveNikonCFI P-Apo 4x LambdaUsed with Nikon Ti2-E
CameraAndorNeo5.5Used with Nikon Ti2-E
Light sourceLumencorSOLA SM IIUsed with Nikon Ti2-E
Cage incubatorOkolabbold lineUsed with Nikon Ti2-E
Pressure ControllerElveflowOB1 MK3
NanoPhotometerImplenDNA concentration measurement
Plasma cleanerDienerFemto200 W, operated at 0.8 mbar with the sample in a Faraday cage

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Heyman, Y., Buxboim, A., Wolf, S. G., Daube, S. S., Bar-Ziv, R. H. Cell-free protein synthesis and assembly on a biochip. Nature Nanotechnology. 7 (6), 374-378 (2012).
  2. Jaehme, M., Michel, H. Evaluation of cell-free protein synthesis for the crystallization of membrane proteins - a case study on a member of the glutamate transporter family from Staphylothermus marinus. The FEBS Journal. 280 (4), 1112-1125 (2013).
  3. Nirenberg, M. W., Matthaei, J. H. The dependence of cell-free protein synthesis in E. coli upon naturally occurring or synthetic polyribonucleotides. Proceedings Of The National Academy Of Sciences Of The United States Of America. 47, 1588-1602 (1961).
  4. Harris, D. C., Jewett, M. C. Cell-free biology: exploiting the interface between synthetic biology and synthetic chemistry. Current Opinion in Biotechnology. 23 (5), 672-678 (2012).
  5. Hodgman, C. E., Jewett, M. C. Cell-free synthetic biology: Thinking outside the cell. Metabolic Engineering. 14 (3), 261-269 (2012).
  6. Smith, M. T., Wilding, K. M., Hunt, J. M., Bennett, A. M., Bundy, B. C. The emerging age of cell-free synthetic biology. FEBS Letters. 588 (17), 2755-2761 (2014).
  7. Estévez-Torres, A., et al. Sequence-independent and reversible photocontrol of transcription/expression systems using a photosensitive nucleic acid binder. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (30), 12219-12223 (2009).
  8. Opgenorth, P. H., Korman, T. P., Bowie, J. U. A synthetic biochemistry molecular purge valve module that maintains redox balance. Nature Communications. 5 (1), 4113(2014).
  9. Sun, Z. Z., et al. Protocols for implementing an Escherichia coli based TX-TL cell-free expression system for synthetic biology. Journal of Visualized Experiments. (79), e50762(2013).
  10. Karzbrun, E., Shin, J., Bar-Ziv, R. H., Noireaux, V. Coarse-Grained Dynamics of Protein Synthesis in a Cell-Free System. Physical Review Letters. 106 (4), 048104(2011).
  11. Shin, J., Jardine, P., Noireaux, V. Genome replication, synthesis, and assembly of the bacteriophage T7 in a single cell-free reaction. ACS Synthetic Biology. 1 (9), 408-413 (2012).
  12. Maeda, Y. T., et al. Assembly of MreB filaments on liposome membranes: a synthetic biology approach. ACS Synthetic Biology. 1 (2), 53-59 (2012).
  13. Shin, J., Noireaux, V. An E. coli Cell-Free Expression Toolbox: Application to Synthetic Gene Circuits and Artificial Cells. ACS Synthetic Biology. 1 (1), 29-41 (2012).
  14. Niederholtmeyer, H., et al. Rapid cell-free forward engineering of novel genetic ring oscillators. eLife. 4, e09771(2015).
  15. Shimizu, Y., et al. Cell-free translation reconstituted with purified components. Nature Biotechnology. 19 (8), 751-755 (2001).
  16. Shimizu, Y., Kanamori, T., Ueda, T. Protein synthesis by pure translation systems. Methods. 36 (3), 299-304 (2005).
  17. Pohorille, A., Deamer, D. Artificial cells: prospects for biotechnology. Trends In Biotechnology. 20 (3), 123-128 (2002).
  18. Adamala, K. P., Martin-Alarcon, D. A., Guthrie-Honea, K. R., Boyden, E. S. Engineering genetic circuit interactions within and between synthetic minimal cells. Nature Chemistry. 9 (5), 431-439 (2017).
  19. Tan, C., Saurabh, S., Bruchez, M. P., Schwartz, R., Leduc, P. Molecular crowding shapes gene expression in synthetic cellular nanosystems. Nature Nanotechnology. 8 (8), 602-608 (2013).
  20. van Nies, P., et al. Self-replication of DNA by its encoded proteins in liposome-based synthetic cells. Nature Communications. 9 (1), 1583(2018).
  21. Buxboim, A., et al. A single-step photolithographic interface for cell-free gene expression and active biochips. Small. 3 (3), 500-510 (2007).
  22. Bracha, D., Karzbrun, E., Daube, S. S., Bar-Ziv, R. H. Emergent properties of dense DNA phases toward artificial biosystems on a surface. Accounts Of Chemical Research. 47 (6), 1912-1921 (2014).
  23. Bracha, D., Bar-Ziv, R. H. Dendritic and nanowire assemblies of condensed DNA polymer brushes. Journal of the American Chemical Society. 136 (13), 4945-4953 (2014).
  24. Daube, S. S., Bracha, D., Buxboim, A., Bar-Ziv, R. H. Compartmentalization by directional gene expression. Proceedings Of The National Academy Of Sciences Of The United States Of America. 107 (7), 2836-2841 (2010).
  25. Karzbrun, E., Tayar, A. M., Noireaux, V., Bar-Ziv, R. H. Programmable on-chip DNA compartments as artificial cells. Science. 345 (6198), 829-832 (2014).
  26. Tayar, A. M., Karzbrun, E., Noireaux, V., Bar-Ziv, R. H. Propagating gene expression fronts in a one-dimensional coupled system of artificial cells. Nature Physics. 11 (12), 1037-1041 (2015).
  27. Pardatscher, G., Schwarz-Schilling, M., Daube, S. S., Bar-Ziv, R. H., Simmel, F. C. Gene Expression on DNA Biochips Patterned with Strand-Displacement Lithography. Angewandte Chemie-International Edition In English. 57 (17), 4783-4786 (2018).
  28. Huang, F., Xu, H., Tan, W., Liang, H. Multicolor and Erasable DNA Photolithography. ACS Nano. 8 (7), 6849-6855 (2014).
  29. Huang, F., Zhou, X., Yao, D., Xiao, S., Liang, H. DNA Polymer Brush Patterning through Photocontrollable Surface-Initiated DNA Hybridization Chain Reaction. Small. 11 (43), 5800-5806 (2015).
  30. McDonald, J. C., et al. Fabrication of microfluidic systems in poly(dimethylsiloxane). Electrophoresis. 21 (1), 27-40 (2000).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

DNA Strand DisplacementBephore LithographyGene ImmobilizationMicrofluidic IntegrationTIRF MicroscopyPDMS CompartmentsFluorescence MicroscopySubstrate PEGylationPhotocleavable DNASelf re Expression System

Related Articles