Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Verrijken en uit te breiden van zeldzame Antigen-specifieke T-cellen met magnetische nanodeeltjes

10.2K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/58640

⸱

17 november 2018

 , 
1Department of Biomedical Engineering, School of Medicine, Johns Hopkins University, 2Institute for Cell Engineering, School of Medicine, Johns Hopkins University, 3Institute for Nanobiotechnology, Johns Hopkins University, 4Department of Pathology, School of Medicine, Johns Hopkins University

In dit artikel

Samenvatting

Antigeen-specifieke T-cellen zijn moeilijk te karakteriseren of frametechnieken gebruiken in therapieën vanwege hun extreem lage frequentie. Hierin bieden we een protocol voor de ontwikkeling van een magnetische deeltjes die aan antigeen-specifieke T-cellen binden kan te verrijken van deze cellen en vervolgens uit te breiden ze verschillende keer voor zowel de karakterisering en de therapie.

Samenvatting

We hebben een tool om zowel verrijken en uit te breiden van antigeen-specifieke T-cellen ontwikkeld. Dit kan handig zijn in gevallen zoals zijn naar A) detecteren van de aanwezigheid van antigeen-specifieke T-cellen, B) sonde de dynamiek van antigeen-specifieke reacties, C) begrijpen de invloed van antigeen-specifieke reacties op ziekte staat zoals autoimmuniteit, D) demystificeren heterogene Responsie voor antigeen-specifieke T-cellen, of E) gebruik maken van antigeen-specifieke cellen voor therapie. De tool is gebaseerd op een magnetische deeltje dat we conjugaat antigeen-specifieke en T-cel co-stimulatory signalen, en dat we noemen als kunstmatige antigeen presentatie van cellen (aAPCs). Bijgevolg, aangezien de technologie eenvoudig te produceren, het kan gemakkelijk worden aangenomen door andere laboratoria; dus is ons doel hier om te beschrijven in detail de fabricage en het latere gebruik van de aAPCs. We uitleggen hoe u koppelt van antigeen-specifieke en co-stimulatory signalen aan de aAPCs, hoe om ze te verrijken voor antigeen-specifieke T-cellen te gebruiken, en hoe uit te breiden van antigeen-specifieke T-cellen. Bovendien zullen we benadrukken technisch ontwerp overwegingen gebaseerd op experimentele en biologische informatie van onze ervaring met het karakteriseren van antigeen-specifieke T-cellen.

Inleiding

Met de opkomst van de vele immuuntherapie is er een behoefte om te kunnen karakteriseren en beheren van de immuunrespons. Met name is de adaptieve immuunrespons van belang vanwege de specificiteit en de duurzaamheid van de cellen. Onlangs, chimeer-antigeen-receptor T celtherapieën zijn goedgekeurd voor kankertherapie; echter zijn de antigeen-receptoren gebaseerd uit het gemeenschappelijk cel surface antigeen CD19, in plaats van de antigenen die specifiek zijn voor de kanker-1. Buiten de specificiteit, kunnen immuuntherapie ook lijden aan het gebrek aan controle en beperkte begrip van de dynamische immuunrespons binnen kanker of autoimmuniteit.

Een van de uitdagingen van het bestuderen van antigeen-specifieke reacties is hun extreem lage frequentie, bijv., antigeen-specifieke T-cellen zijn 1 van elke 104 naar 106 T cellen2,3. Dus, om te onderzoeken welke T cellen aanwezig zijn of reageert, de cellen moeten ofwel worden verrijkt en uitgebreid, of hun signaal kan worden versterkt. Het is duur en moeilijk te handhaven van de cellen van de feeder met behulp van huidige technieken die gericht zijn op de uitbreiding van antigeen-specifieke cellen. Huidige technieken die gericht zijn op het versterken van het signaal van antigeen-specifieke T-cellen, zoals de immunospot van enzyme-linked (ELISPOT) assay, beperken het hergebruik van die T cellen4. Tot slot vanwege lage gevoeligheid moeten deze twee technieken vaak worden gecombineerd voor antigeen-specifieke opsomming.

Om deze kwesties te behandelen, hebben we de magnetische nanoparticle gebaseerde kunstmatige antigeen voorstellende cel (aAPC)5,6,7,8. De aAPC kan worden matiemaatschappij en een antigeen-specifieke signaal-peptide geladen grote histocompatibility complex (pMHC) - co-stimulatory moleculen -bv., een anti-CD28 antilichaam-zowel het verrijken van antigeen-specifieke T-cellen en dan vervolgens stimuleren hun expansie (Figuur 1). De deeltjes kunnen dus een kosteneffectieve off-the-shelf product dat kan worden zowel aangepast aan antigeen-specifieke stimulaties nog gestandaardiseerd over experimenten en patiënten. Uitvoeren van de verrijking en uitbreiding verwerken van resultaten in honderden tot duizenden-voudige expansie van antigeen-specifieke CD8 + T cellen en kan leiden tot frequenties tot 60 procent na één week, waardoor de karakterisering of het therapeutische gebruik van de grote aantal cellen. Hierin, we beschrijven hoe maak je nanoparticle aAPCs, sommige kritische overwegingen bij het kiezen van de nanoparticle eigenschappen, en enkele typische resultaten tonen met behulp van deze deeltjes in isoleren en zeldzame antigeen-specifieke CD8 + T cellen uit te breiden.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Alle muizen werden onderhouden per richtsnoeren goedgekeurd door de Johns Hopkins University's institutionele Review Board.

1. Laad Dimeric Major Histocompatibility Complex Immunoglobulin fusieproteïne (MHC-Ig) met gewenste antigeen Peptide opeenvolging.

Opmerking: Als u met behulp van H - 2Kb: Ig, dan volgt het protocol beschreven in stap 1.1; Als met behulp van H-2Db:Ig, dan volgt het protocol beschreven in stap 1,2.

  1. Actieve laden van peptide reeks in H - 2Kb: Ig.
    1. Nodige buffers voor te bereiden. Bereiden de denaturatie buffer door het maken van een oplossing van 150 mM NaCl en 15mM nb2CO3 in gedeïoniseerd water en vervolgens aan te passen de pH ten slotte op 11,5. Bereiden de buffer van de renaturatie door het maken van een oplossing van 250 mM Tris-HCl in gedeïoniseerd water en pH 6.8 aan te passen.
      Opmerking: Doorgaans, het vergt ongeveer 5 mL van zowel de denaturatie en renaturatie buffers voor 1 mg van H - 2Kb: Ig.
    2. Denatureren van H - 2Kb: Ig aan verbeterde peptide-binding toestaan. Brengen van de H - 2Kb: Ig concentratie tussen 0,5-2 mg/mL met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS). Dan Verdun de H - 2Kb: Ig om een eindconcentratie van 100-200 µg/mL met 5-10 volume equivalenten van denaturatie buffer en laat het broeden bij kamertemperatuur gedurende 15 minuten.
    3. Voeg 50 molaire overmaat van peptide sequentie (meestal voorraad peptide is gehouden op 1 mM bij-80 ° C) tot de H - 2 Kb: Ig oplossing.
      Opmerking: Meestal peptide-antigeen moet worden ontbonden binnen ten minste 10% dimethylsulfoxide (DMSO) en dan langzaam naar PBS te blijven, oplosbaar toegevoegd. Afhankelijk van de volgorde van de aminozuren, kan de hoeveelheid DMSO moet worden verhoogd.
    4. Renature H - 2Kb: Ig met peptide. Onmiddellijk na de toevoeging van de peptide, breng de oplossing aan een pH van 7,4 door renaturatie buffer toe te voegen. Toestaan dat de geneutraliseerde oplossing voor Incubeer gedurende 48 uur bij 4 ° C.
    5. Concentreren en wassen van peptide-geladen H - 2Kb: Ig. met behulp van een centrifugaal concentrator met een 50 kDa molecuulgewicht cut-off (MWCO), volg de aanwijzingen van de fabrikant om te wassen van de peptide-geladen H - 2Kb: Ig oplossing 3 keer met PBS, concentreren op ten minste 1 mg/mL en kwantificeren van de concentratie op een spectrofotometer.
  2. Actieve laden van peptide reeks in H-2Db:Ig.
    1. Nodige buffers voor te bereiden. Bereiden de denaturatie buffer door het maken van een oplossing van citroenzuur 131 mM, 150 mM NaCl en 124 mM nb2HPO4 in gedeïoniseerd water en vervolgens aan te passen de pH naar 6.5. Bereiden de buffer van de renaturatie door het maken van een oplossing van 120 mM Tris-HCl in gedeïoniseerd water en pH 8,8 aan te passen.
      Opmerking: Doorgaans, het vergt ongeveer 5 mL van de buffer denaturatie en 1 mL van de buffer van de renaturatie voor 1 mg van H-2Db:Ig.
    2. Denatureren van H-2Db:Ig voor verbeterde peptide-binding toestaan. Brengen van de H-2Db:Ig concentratie tot een uiteindelijke concentratie van 0,5-2 mg/mL met PBS. Dan Verdun de H-2Db:Ig om een eindconcentratie van 100-200 µg/mL met 5-10 volume-equivalenten van denaturatie buffer.
    3. Voeg 50 molaire overmaat van peptide sequentie (meestal voorraad peptide is gehouden op 1 mM bij-80 ° C) tot de H-2Db:Ig oplossing en laat het Incubeer gedurende 1 uur bij 37 ° C.
    4. Voeg β2-microglobulin en renature H-2Db:Ig met peptide. 2-fold molaire overmaat van β2-microglobulin toevoegen. Dan, breng de oplossing aan een pH van 7,4 door renaturatie buffer toe te voegen. Toestaan dat de geneutraliseerde oplossing voor Incubeer gedurende 24 uur bij 4 ° C.
    5. Concentreren en wassen van peptide-geladen H-2Db:Ig. met behulp van een centrifugaal concentrator met een 50 kDa MWCO, volg de aanwijzingen van de fabrikant om te wassen van de peptide-geladen H - 2 Kb: Ig oplossing 3 keer met PBS, concentreren op ten minste 1 mg/mL en kwantificeren van de concentratie op een spectrofotometer.

2. conjugaat MHC-peptide complexen en Co-Stimulatory moleculen op het oppervlak van magnetische nanodeeltjes tot kunstmatige antigeen Nanoparticle presentatie van cellen. Gebruik een van de drie verschillende methoden afhankelijk van deeltjesgrootte en toepassing.

Opmerking: Een aantal verschillende technieken kan worden gebruikt om de geconjugeerde van de eiwitten op het oppervlak van de deeltjes. Hierin, 3 aparte benaderingen zijn beschreven: amine beklede deeltjes (stap 2.1), N-hydroxysuccinimide (NHS)-gecoate deeltjes (stap 2.2), en anti-biotin beklede deeltjes (stap 2.3). Deze processen zijn ook beschreven in detail binnen de sectie methoden van twee papers gepubliceerde6,7. Voer alle stappen uit in een zuurkast bioveiligheid met steriele oplossingen om de steriliteit van de voorraad aAPC deeltjes.

  1. Jas van antigeen-specifieke en stimulerend signalen naar amine beklede magnetische deeltjes (Figuur 2). Dit proces wordt beschreven voor 100 nm, amine beklede superparamagnetische nanodeeltjes.
    Opmerking: Gedetailleerde protocollen voor het bijvoegen van het antilichaam aan het oppervlak van het gecoate deeltje van een amine kunnen gevonden worden op https://www.micromod.de/en/technotes-2.html, waar Technote 201 beschrijft hoe te thiolate antilichamen en geconjugeerde te maleimide functionalize deeltjes en 202 beschrijven het proces moest functionalize amine beklede deeltjes met maleimide functionele groepen. Hier, worden slechts lichte wijzigingen gemarkeerd voor de MHC-Ig en co-stimulatory signalen gekoppeld aan deze deeltjes.
    1. Thiolate de antistoffen met de Traut reagens (Technote 201).
      1. Een 10 x PBS-ethyleendiamminetetra azijnzuuroplossing (NA2EDTA) buffer (0,1 M PBS en 100 mM EDTA) voor te bereiden. Op een 1:10 de 10 x PBS-EDTA-buffer toevoegen aan de antilichamen in verhouding tot het voorkomen van de oxidatie van gratis thiolen toegevoegd aan de antilichamen.
      2. 20 molaire overmaat van Traut van reagens (2-iminothiolane) toevoegen aan het antilichaam en incubeer gedurende 2 uur bij kamertemperatuur met het mengen. Meet de de Traut reagens (droge poeder) binnen een chemische zuurkast te voorkomen dat ademhaling als het amine groepen om thiol-groepen zet.
      3. Grondig wassen met 1 x PBS-EDTA-buffer 3 keer met behulp van een centrifugaal concentrator met een 50 kDa MWCO en volg de aanwijzingen van de fabrikant, concentratie tot een eindvolume van 500 µL. meten van de concentratie van het antilichaam oplossing met behulp van een spectrofotometer.
    2. De amine functionele groepen op de magnetische nanoparticle omzetten in maleimide groepen met behulp van sulfosuccinimidyl 4-(N-maleimidomethyl) cyclohexaan-1-carboxylaat (Sulfo-SMCC, Technote 202).
      1. De 10 x PBS-EDTA-buffer toevoegen aan de antilichamen op een 1:10 verhouding aan de deeltjes.
      2. Ontbinden Sulfo-SMCC in gedeïoniseerd water en vortex aan resuspendeer bij een concentratie van 1 mg/mL. Meet de Sulfo-SMCC (droge poeder) binnen een chemische zuurkast te voorkomen dat ademhaling als het amine groepen omgezet in maleimide groepen.
      3. Voeg 0,016 nmol van de Sulfo-SMCC oplossing voor de oppervlakte van elke vierkante millimeter van de deeltjes. Gebruik voor 1 mg van de 100 nm deeltjes, 0.3 mg van Sulfo-SMCC. Wil je reageren gedurende 1,5 uur op kamertemperatuur.
      4. Wassen van de deeltjes met 1 x PBS-EDTA-buffer 3 keer met behulp van een magnetisch veld met een magnetische kolom en resuspendeer in 500 µL 1 x PBS-EDTA-buffer.
        Opmerking: Als deeltjes kleiner dan 200 nm, zoals de 100 nm deeltjes hierin, beschreven waarschijnlijk permanente magneten zal niet krachtig genoeg om te trekken de deeltjes voor wassen of concentreren doeleinden. Dus, om te wassen de kleinere deeltjes, een magnetische kolom samengesteld van Ferromagnetische bollen gebruiken om te versterken van het magnetisch veld.
    3. Maleimide-matiemaatschappij deeltjes met thiolated antilichamen (Technote 201) reageren.
      1. De deeltjes aan een glas Scintillatie flacon toevoegen, toevoegen van een mini-magnetische roer bar plaatsen slechts een inch boven een magnetische roer plaat en induceren magnetische vermenging van het deeltje oplossing.
      2. U wilt de mengoplossing, ontkleuring toevoegen de thiolated antilichamen (0.5 mg van antilichaam voor elk 1 mg van deeltjes). Laat 's nachts reageren bij kamertemperatuur.
      3. Wassen met 1 x PBS buffer 3 keer met behulp van een magnetisch veld en resuspendeer in 500 µL van 1 x PBS. Label en bewaren bij 4 ° C voor maximaal 6 maanden.
        Opmerking: Maximum vervoeging efficiëntie vindt plaats wanneer deeltjes maleimide-matiemaatschappij onmiddellijk worden gemengd met thiolated eiwit.
  2. Jas van antigeen-specifieke en stimulerend signalen naar NHS beklede magnetische deeltjes (Figuur 3). Dit proces wordt beschreven voor 200 nm, NHS beklede superparamagnetische nanodeeltjes.
    1. Bereiden de resuspensie buffer, blussen buffer en buffer van de opslag. De buffer resuspensie is 25 mM 2-(N-morfolino) ethanesulfonic zuur (MES) met 0,01% Tween 20 aan de pH 6.0 aangepast. De blussen buffer is een oplossing van de 100 mM Tris-HCl met een pH van 7,4. De buffer van de opslag is een oplossing van 10 mM PBS en 0,01% Tween met een pH van 7,4.
    2. Resuspendeer de gelyofiliseerd deeltjes in 1 mL van de resuspensie buffer. Vortex krachtig gedurende ten minste 15 min. zolang geen aggregaten niet zichtbaar zijn.
    3. Plaats de magnetische deeltjes op een magnetische stand te verwijderen van de bovendrijvende substantie, resuspendeer met 0,5 mL van resuspensie buffer en transfer naar een glazen Scintillatie ampul. Vortex zolang geen aggregaten niet zichtbaar zijn.
    4. Voeg 0,1 mg totaal eiwit per 1 mg geresuspendeerde deeltjes. Vortex te mengen en reageren bij kamertemperatuur gedurende 2,5 uur tijdens het mixen.
    5. Voeg 0,1 mL buffer blussen en reageren bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten tijdens het mixen.
    6. Plaats de ampul Scintillatie op een magnetische standaard en wassen van de deeltjes. Wacht totdat het supernatans helder te verwijderen is. De deeltjes verwijderen uit de magnetische stand, voeg 1 mL resuspensie buffer en vortex zolang geen aggregaten niet zichtbaar zijn. Herhaal dit proces drie keer en resuspendeer de deeltjes in 1 mL resuspensie buffer. Bewaar de deeltjes bij 4 ° C voor maximaal 6 maanden.
  3. Jas van antigeen-specifieke en stimulerend signalen aan anti-biotin beklede magnetische deeltjes (Figuur 4). Dit proces wordt beschreven voor 50-100 nm, anti-Biotine superparamagnetische nanodeeltjes.
    1. Biotinylate MHC-Ig of co-stimulatory moleculen.
      1. Aanpassen van de eiwitconcentratie aan 0,5-2 mg/mL in PBS buffer. Resuspendeer sulfo-NHS-Biotine bij een concentratie van 10 mg/mL in gedeïoniseerd water en Voeg 20-fold molaire overmaat aan stimulerend antilichaam. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 45 minuten.
      2. Grondig wassen met PBS 3 keer een centrifugaal concentrator met een 50 kDa MWCO, volg de aanwijzingen van de fabrikant, tot een eindvolume van 500 µL. meten van de concentratie van de oplossing van de antilichaam met een spectrofotometer concentreren.
    2. Geconjugeerde biotinyleerd MHC-Ig en/of co-stimulatory signalen naar anti-Biotine nanodeeltjes. Voor 500 µL van voorraad anti-Biotine deeltjes, Voeg 0,5 nmol van stimulerend antilichaam en na een nacht bebroeden bij 4 ° C.
    3. Wassen van geconjugeerd aAPC nanodeeltjes. Omdat deze deeltjes kleiner dan 200 zijn nm, een magnetische kolom NAT en zetten op een magnetische tribune.
    4. De schorsing van de deeltjes/proteïne aan de kolom toevoegen. Alle eiwit/deeltjes om volledig de kolom toestaan.
    5. Wassen door toevoeging van 0,5 mL PBS driemaal aan de kolom.
    6. Elueer door de kolom te verwijderen uit de magnetische stand, 0,5 mL PBS toe te voegen aan de kolom en het gebruik van de plunjer, expulse de aAPCs van de deeltjes in een glazen Scintillatie ampul. Opslaan deeltjes bij 4 ° C voor maximaal 6 maanden.
      Opmerking: Deeltjes zijn stabiel bij 4 ° C (moet niet worden bevroren) voor maximaal 6 maanden. Hogere temperaturen verminderen de functionaliteit van de deeltjes en de aggregatie van sommige deeltjes geconstateerd (gegevens niet worden weergegeven). Houd niet bij kamertemperatuur voor langere tijd als dit aanzienlijk de houdbaarheid van de deeltjes vermindert.

3. karakteriseren het eiwitgehalte op kunstmatige antigeen presentatie van cel nanodeeltjes met behulp van fluorescerende antilichamen detectie.

Opmerking: Dit is een nuttige controle van de kwaliteit van de geproduceerde kunstmatige antigeen presentatie van cellen. De hoeveelheid stimulerend signaal wordt ook gebruikt voor de productie van gelijkwaardige aAPC doses over batches en verschillende aAPC (bijv., verschillende maten).

  1. Het meten van de concentratie van deeltjes van gecoate aAPCs.
    1. Unconjugated deeltjes van de stamoplossing te gebruiken en maak een 1:2 dosis titratie in een oplossing van PBS over een weefselkweek platbodem 96-wells-plaat met 100 µL per putje.
    2. Lees de deeltjes op een plaat-lezing spectrofotometer op 405 nm tot een standaard curven maken uit een deeltje van de bekende concentratie.
    3. Neem een monster van het geconjugeerd aAPCs, Verdun in PBS tot een totaal volume van 100 µL en lees op de spectrofotometer.
  2. Verwijderen van een steekproef van gefabriceerde aAPCs en vlekken met fluorescerende antilichamen.
    1. Om te berekenen hoeveel monster schatten van het aantal antilichamen op het oppervlak van het deeltje te verwijderen.
      Noot: Voor deze technieken, gaan er een dichtheid van ongeveer 1000 antilichamen/µm2 van oppervlakte van de particle. Om te kunnen detecteren van de fluorescentie, is het ongeveer 1011 MHC-Ig of CD28 moleculen totaal per TL test vereist.
    2. Zodat het totale volume van aAPCs tot 100 µL in PBS, voeg de kleuring antilichamen bij een verdunning 1:100 toe en incubeer gedurende 1 uur bij 4 ° C.
      Opmerking: Voorbeeld antilichamen met succes gebruikt zijn FITC-geconjugeerd rat-anti-muis Ig λ1 λ2, λ3 lichtketting, R26 46 te sporen MHC-Ig en FITC-geconjugeerd muis anti Armeens/Syrische hamster IgG, kloon G192-1, om het detecteren van anti-muis CD28 kloon.
  3. Wassen van de deeltjes en lees de fluorescentie op een TL-afleesapparaat.
    1. Magnetisch wassen (zoals beschreven in stap 2) de gekleurde aAPC breuken driemaal met 0,5 mL PBS.
    2. Elueer de gewassen aAPCs met 0,5 mL PBS.
    3. Voeg 100 µL van de eluted aAPCs aan een platbodem 96-wells-plaat om te lezen van de concentratie met behulp van de extinctie zoals in stap 3.1.
    4. Neem de resterende 400 µL, opgesplitst in twee 200 µL aliquots en voeg toe aan twee putjes in een zwart, polystyreen plaat voor 96-Wells, platbodem. Titreer met een verhouding van 1:2 beneden de plaat door 100 µL van de oplossing en mengen met de volgende Nou dat 100 µL van PBS in elk goed ten minste viermaal heeft.
      Opmerking: Gemiddelde meerdere worden gerepliceerd van de meting ter vermindering van het lawaai in de meting.
    5. Breng op de dezelfde zwarte 96-wells-plaat, een standaard curve van het fluorescerende antilichaam gebruikt om vlek, toe te voegen aan 1:200 in een put met 200 µL van PBS en titrating neer op de verhouding van 1:2 voor ten minste 12 putten.
    6. Nadat zowel de aAPC als de fluorescerende antilichamen op de plaat zijn, lees de plaat met een TL-afleesapparaat.
  4. Bereken de hoeveelheid eiwit per deeltje. Bepaal de concentratie van antilichaam door vergelijking van de waarden op de standaard curve, waar de concentratie van antilichaam is bekend, uitgaande van een verhouding van 1:1 van de kleuring van antilichaam aan antilichaam ontdekt. Vervolgens delen deze concentratie van gedetecteerde antilichaam met de concentratie van deeltjes bepaald door de extinctie bepaling zal het geven van het aantal antilichamen per deeltje.

4. het verrijken van antigeen-specifieke CD8 + T cellen met kunstmatige antigeen bereide Nanoparticle presentatie van cellen.

  1. Isoleren van CD8 + T cellen.
    1. De dieren door blootstelling aan Isofluraan gevolgd door cervicale dislocatie euthanaseren.
    2. Verwijderen van de milt en de lymfeklieren van wildtype C57BL/6j muizen en plaatsen in een oplossing van PBS. De organen maceraat en elueer de cellen door een steriele 70 µm cel zeef met frequente wasbeurten van PBS.
    3. Om te elimineren niet - CD8 + T cellen, een neen-touch CD8 + T cel isolatie kit gebruiken en volg de instructies van de fabrikant.
      Opmerking: Elke antigeen-voorwaarde vereist minstens 3 x 106 CD8 + T cellen.
  2. De aAPCs van de nanoparticle te binden aan de CD8 + T cellen toevoegen.
    1. Na het isolement, concentreren op een volume van 100 µL in PBS met 0,5% bovien serumalbumine (BSA) en 2 mM EDTA.
    2. Het nummer bepalen van aAPCs toe te voegen door te berekenen op basis van de verhouding van 1011 aAPC-gebonden, peptide-geladen MHC-Ig voor elke 106 CD8 + T cellen.
    3. Incubeer aAPC deeltjes en CD8 + T cellen gedurende 1 uur bij 4 ° C onder voortdurend omzwenken in een steriele 5 mL polystyreen ronde onderkant buis.
  3. Bereiden aangevuld media en T cel groeifactor (TCGF) geeft aan Elueer en cultuur van CD8 + T cellen.
    1. Aanvulling voor aangevuld media, volledige RPMI 1640 media (met glutamine) met 1 x van niet-essentiële aminozuren, 1 mM natrium pyruvaat, 0,4 x vitamine oplossing, 92 µM 2-mercaptoethanol, 10 µM ciprofloxacine en 10% foetale runderserum (FBS).
    2. Aanbrengen van TCGF, de protocollen al gevestigde en waarnaar wordt verwezen hier9volgen.
      Opmerking: TCGF is een in-house cocktail van menselijk immuun cytokines die essentieel is om te T cellen voorzien van extra stimulatie signalen nodig om te groeien. TCGF kunnen worden ingewisseld voor bekende T cel stimulerend cytokines zoals IL-2, IL-7 of IL-15; echter, elk kan de T-cel-respons dienovereenkomstig polariseren. Het protocol hierin beschreven is niet geoptimaliseerd met deze cocktails; aldus andere technieken moeten worden geraadpleegd voor concentraties en combinaties als TCGF niet met voorbeelden gebruikt wordt vermeld10,11.
  4. Wassen en aAPC en CD8 + T cel mengsel te verrijken.
    1. Wassen van de magnetische deeltjes aAPCs zoals beschreven in stap 2. Echter, wassen eerst met behulp van de PBS-buffer met 0,5% BSA en 2 mM EDTA, media met behulp van de tweede aangevuld en met behulp van de derde aangevuld media met 1% TCGF.
    2. Elueer aAPCs en verrijkte CD8 + T cellen in 500 µL van aangevuld media met 1% TCGF.
    3. Telt de cellen met behulp van een hemocytometer en de plaat in een 96 U-bodem plaat in 160 µL per putje van aangevuld media met 1% TCGF bij een concentratie van 2, 5 x 105 CD8 + T cellen/mL.
    4. Als isoleren met behulp van aAPCs met alleen peptide-geladen MHC-Ig op het oppervlak (geen co-stimulatory signalen), vervolgens de volledige stap 4.5. Als isoleren met behulp van aAPCs met beide peptide-geladen MHC-Ig op het oppervlak en co-stimulatory signalen, gaat u verder met stap 5.
  5. De magnetische deeltjes bekleed met co-stimulatory signalen op het oppervlak op de verrijkte breuk en voeg toe een magnetisch veld als u wilt clusteren mede de stimulerend signalen op het oppervlak van de T-cellen.
    1. Naar de verrijkte breuken, een mengsel (of meer afhankelijk van de toepassing-Zie de sectie over de aAPC eigenschappen van besturingselement) toevoegen van stimulerend antilichaam aan het aantal peptide-geladen MHC-Ig op het deeltje.
    2. Toestaan van co-stimulatory magnetische deeltjes te binden aan verrijkt CD8 + T cellen gedurende 1 uur bij 4 ° C.
    3. Magnetisch veld toevoegen door het plaatsen van de cultuur-plaat tussen twee magneten van neodymium N52 schijf van 1,9 cm (0,75 inch) in lengte.
      Opmerking: N52 schijf magneten hebben een buitengewoon sterk veld. Zorg moet worden genomen zowel op te slaan met spacers tussen magneten, omdat het moeilijk is om uit elkaar te verwijderen, en bij het zetten van hen op de platen van de cultuur. Om te minimaliseren van de magneten van het vasthouden aan de metalen onderdelen van de incubator, plaats ze in 50 mL conische buis Styrofoam containers op zowel de bovenkant als de onderkant.

5. Vouw en detecteren van antigeen-specifieke CD8 + T cellen met kunstmatige antigeen bereide Nanoparticle presentatie van cellen.

  1. De 96 U-bodem goed plaat met aAPCs en CD8 + T cellen toevoegen in een bevochtigde 5% CO2, 37 ° C incubator voor 3 dagen. Op dag 3, meegenomen de cellen met 80 µL per putje van aangevuld media met 2% TCGF en plaats terug in de incubator tot dag 7.
  2. Op dag 7, de cellen gestimuleerd in een 5 mL ronde onderkant buis voor het tellen van de oogst.
  3. Eenmaal alle de oplossing wordt geoogst, spin down de geoogste cellen resuspendeer in 0,5 mL PBS met natriumazide 0,05% en 2% FBS. Aantal levensvatbare cellen door met trypan blauw kleuring en tellen op een hemocytometer.
  4. 50.000-500.000 getelde cellen verwijderen in twee nieuwe 5 mL ronde onderkant buizen voor antigeen-specifieke kleuring. Één buis zal worden gebruikt voor de cognaat peptide-MHC vlek, en de andere buis zal worden gebruikt voor de niet-cognate vlek om achtergrondkleuring.
  5. 1 microgram van biotinyleerd MHC-Ig (met behulp van de techniek beschreven in stap 2) toevoegen aan de respectieve cognate en de niet-cognate buizen in 100 µL van PBS met natriumazide 0,05% en 2% FBS met allophycocyanin (APC)-geconjugeerd rat-antimuis CD8a, 53-6,7 (verdunningsverhouding van klonen 1:100) gedurende 1 uur bij 4 ° C.
  6. Toevoegen van secundaire daar en leven van dode vlek. Wassen overtollige biotinyleerd MHC-Ig met PBS door middel van centrifugeren. Vervolgens vlek alle monsters met een verhouding van de 1:350 van phycoerythrin (PE)-label daar en 1:1000 ratio van een leven/dood corrigeerbare groene dode cel vlek gedurende 15 minuten staan bij 4 ° C.
  7. Lees alle monsters op een cytometer van de stroom om de specificiteit en het aantal antigeen-specifieke cellen te bepalen.
    1. Overtollige secundaire wassen en wonen/dode vlek door centrifugeren en resuspendeer met 150 µL van PBS buffer met natriumazide 0,05% en 2% FBS om te lezen over een stroom cytometer.
  8. Het bepalen van het aantal en percentage van antigeen-specifieke cellen met de software van de analyse van de gegevens.
    1. Om te bepalen van het percentage van antigeen-specifieke cellen, gebruikt u de volgende poorten in de respectievelijke volgorde live +, lymfocyt + (forward spreiding door kant scatter), CD8 + en dimeer +. Bepaal de dimeer + poort door het vergelijken van de niet-cognate op de cognaat vlek.
    2. Bepaal het percentage van antigeen-specifieke cellen in een steekproef door het percentage van dimeer + van de cognaat MHC-Ig vlek uit de niet-cognate MHC-Ig vlek af te trekken.
    3. Met behulp van dit percentage van antigeen-specifieke cellen, kunt u deze vermenigvuldigen met het aantal cellen geteld, het aantal antigeen-specifieke cellen resulterende opbrengst van de verrijking en de uitbreiding.
      Opmerking: Compensatie moet worden ingesteld op de stroom cytometer, aangezien er spectrale overlap met de fluorophores wordt gebruikt in dit deelvenster.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Om een succesvolle verrijking en uitbreiding van antigeen-specifieke T-cellen, moeten de peptide-geladen MHC-Ig en co-stimulatory moleculen worden met succes gekoppeld aan het aAPC deeltje. Op basis van de 3 methoden van deeltje bijlage, bieden wij enkele representatieve gegevens voor een succesvolle vervoeging procedure resultaat (figuur 5a). Inderdaad, als het ligand-dichtheid te laag is, dan zal niet er effectieve stimulatie van antigeen-specifieke CD8 + T...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Hebben we een nieuwe antigeen-specifieke T celtechnologie van de isolatie op basis van kunstmatige antigeen nanoparticle presenteren cellen (aAPCs). Nanoparticle-aAPCs peptide-geladen MHC op het oppervlak waarmee antigeen-specifieke T cel bindende en activering naast co-stimulatory activeren. aAPCs zijn ook paramagnetisch, en dus kan worden gebruikt voor het verrijken van zeldzame antigeen-specifieke T-cellen met behulp van een magnetisch veld. Wij hebben geoptimaliseerd en studeerde van belangrijke nanoparticle eigensch...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs verklaren de volgende concurrerende financiële interesseren: onder een licentieovereenkomst tussen NexImmune en The Johns Hopkins University, Jonathan Schneck is recht op een aandeel in de royalty's, ontvangen door de Universiteit op de verkoop van producten die worden beschreven in dit artikel. Hij was ook oprichter van NexImmune en bezit van aandelen in het bedrijf. Hij fungeert als een lid van de Raad van bestuur en de wetenschappelijke adviesraad van het NexImmune. De bepalingen van deze regelingen zijn herzien en goedgekeurd door The Johns Hopkins University overeenkomstig haar beleid van belangenverstrengeling.

Dankbetuigingen

Jwh bedankt de NIH kanker nanotechnologie Training Center in het Johns Hopkins Instituut voor nanobiotechnologie, National Science Foundation Graduate Research Fellowship (DGE-1232825) en de bogen foundation voor de ondersteuning van de fellowship. Dit werk werd gefinancierd door de steun van de National Institutes of Health (P01-AI072677, R01-CA108835, R21-CA185819), TEDCO/Maryland innovatie-initiatief en de Coulter Foundation (JPS).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
DimerX I: Recombinant Soluble Dimeric Human HLA-A2:Ig Fusion ProteinBD Biosciences551263
DimerX I: Recombinant Soluble Dimeric Mouse H-2D[b]:IgBD Biosciences551323
DimerX I: Recombinant Soluble Dimeric Mouse H-2K[b]:Ig Fusion ProteinBD Biosciences550750
Vivaspin 20 MWCO 50 000GE Life Sciences28932362
Vivaspin 2 MWCO 50 000GE Life Sciences28932257
Purified Human Beta 2 MicroglobulinBio-RadPHP135
nanomag-D-spio, NH2, 100 nm nanoparticlesMicromod79-01-102
Super Mag NHS Activated Beads, 0.2 µmOcean NanotechSN0200 
Anti-Biotin MicroBeads UltraPureMiltenyi130-105-637
EZ-Link NHS-BiotinThermoFisher20217
Sulfo-SMCC Crosslinker ProteoChemc1109-100mg
2-Iminothiolane hydrochlorideSigma-AldrichI6256 Sigma 
96 Well Half-Area Microplate, black polystyreneCorning3875
FITC Rat Anti-Mouse Ig, λ1, λ2, & λ3 Light Chain  Clone  R26-46  BD Biosciences553434
FITC Mouse Anti-Armenian and Syrian Hamster IgG  Clone  G192-1BD Biosciences554026
B6.Cg-Thy1a/Cy Tg(TcraTcrb)8Rest/J (transgenic PMEL) miceJackson Laboratory005023
C57BL/6J (B6 wildtype) miceJackson Laboratory000664
CD8a+ T Cell Isolation Kit, MouseMiltenyi130-104-075
MS ColumnsMiltenyi130-042-201
LS ColumnsMiltenyi130-042-401
Streptavidin-Phycoerythrin, SAv-PEBiolegend405203
N52 disk magnets of 0.75 inches K&J MagneticsDX8C-N52
APC anti-mouse CD8a Antibody, clone 53-6.7Biolegend100711
LIVE/DEAD Fixable Green Dead Cell Stain Kit, for 488 nm excitation ThermoFisherL-34969

Referenties

  1. Prasad, V. immunotherapy: Tisagenlecleucel-the first approved Car-t-cell therapy: implications for payers and policy makers. Nature Reviews Clinical Oncology. 15 (1), 11(2018).
  2. Jenkins, M. K., Moon, J. J. The role of naive T cell precursor frequency and recruitment in dictating immune response magnitude. The Journal of Immunology. 188 (9), 4135-4140 (2012).
  3. Rizzuto, G. A., et al. Self-antigen-specific CD8+ T cell precursor frequency determines the quality of the antitumor immune response. Journal of Experimental Medicine. 206 (4), 849-866 (2009).
  4. Newell, E. W., Davis, M. M. Beyond model antigens: high-dimensional methods for the analysis of antigen-specific T cells. Nature biotechnology. 32 (2), 149(2014).
  5. Perica, K., et al. Enrichment and expansion with nanoscale artificial antigen presenting cells for adoptive immunotherapy. ACS nano. 9 (7), 6861-6871 (2015).
  6. Kosmides, A. K., Necochea, K., Hickey, J. W., Schneck, J. P. Separating T Cell Targeting Components onto Magnetically Clustered Nanoparticles Boosts Activation. Nano Letters. , (2018).
  7. Hickey, J. W., Vicente, F. P., Howard, G. P., Mao, H. Q., Schneck, J. P. Biologically Inspired Design of Nanoparticle Artificial Antigen-Presenting Cells for Immunomodulation. Nano Letters. 17 (11), (2017).
  8. ,, et al. Efficient magnetic enrichment of antigen-specific T cells by engineering particle properties. Biomaterials. , (2018).
  9. Oelke, M., et al. Generation and purification of CD8+ melan-A-specific cytotoxic T lymphocytes for adoptive transfer in tumor immunotherapy. Clinical Cancer Research. 6 (5), 1997-2005 (2000).
  10. Riccione, K., Suryadevara, C. M., Snyder, D., Cui, X., Sampson, J. H., Sanchez-Perez, L. Generation of CAR T cells for adoptive therapy in the context of glioblastoma standard of care. Journal of visualized experiments: JoVE. (96), (2015).
  11. Ho, W. Y., Nguyen, H. N., Wolfl, M., Kuball, J., Greenberg, P. D. In vitro methods for generating CD8+ T-cell clones for immunotherapy from the naive repertoire. Journal of immunological methods. 310 (1-2), 40-52 (2006).
  12. Rudolf, D., et al. Potent costimulation of human CD8 T cells by anti-4-1BB and anti-CD28 on synthetic artificial antigen presenting cells. Cancer immunology, immunotherapy : CII. 57 (2), 175-183 (2008).
  13. Gulukota, K., Sidney, J., Sette, A., DeLisi, C. Two complementary methods for predicting peptides binding major histocompatibility complex molecules1. Journal of molecular biology. 267 (5), 1258-1267 (1997).
  14. Castle, J. C., et al. Exploiting the mutanome for tumor vaccination. Cancer research. 72 (5), 1081-1091 (2012).
  15. Duan, F., et al. Genomic and bioinformatic profiling of mutational neoepitopes reveals new rules to predict anticancer immunogenicity. Journal of Experimental Medicine. 211 (11), 2231-2248 (2014).
  16. Srivastava, P. K., Duan, F. Harnessing the antigenic fingerprint of each individual cancer for immunotherapy of human cancer: genomics shows a new way and its challenges. Cancer Immunology, Immunotherapy. 62 (5), 967-974 (2013).
  17. Yadav, M., et al. Predicting immunogenic tumour mutations by combining mass spectrometry and exome sequencing. Nature. 515 (7528), 572(2014).
  18. Gros, A., et al. Prospective identification of neoantigen-specific lymphocytes in the peripheral blood of melanoma patients. Nature medicine. 22 (4), 433(2016).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Meer artikelen verkennen

Artificiële antigeenpresenterende cellenVerrijkingsexpansietechniekFlowcytometrie-analyseCD8+ T-celisolatiePeptidebeladen MHC-IgT-celgroeifactorBiotine-gemarkeerd MHC-IgStreptavidine-geconjugeerd antilichaam
Verrijken en uit te breiden van zeldzame Antigen-specifieke T-cellen met magnetische nanodeeltjes
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.