We beschrijven de oprichting van een lymfkliertest model voor de ziekte van Parkinson met behulp van MPTP en gedrags evaluaties met behulp van cilinder en open veldproeven voor het meten van de motorische functie. We gebruiken dan levodopa een voorbeeldfunctie te laten zien hoe dit model in de studie van PD drugs van toepassing.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Gedrags evaluaties van spontane voortbewegen in een lymfkliertest MPTP-geïnduceerde ziekte Parkinson's Model
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
De ziekte van Parkinson (PD) is een gemeenschappelijk neurodegeneratieve stoornis ziekte, veroorzaakt het verschijnsel schudden, stijfheid en traagheid van beweging en dementie. 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine (MPTP) kan leiden tot bepaalde Parkinson-achtige symptomen door het vernietigen van de Dopaminerge neuronen in de substantia nigra van de hersenen. Het is dus gebruikt om PD modellen in verschillende dierstudies. Hier, muizen ontvangen MPTP injecties (20 mg/kg/dag) voor zeven dagen en de gedragsmatige tests worden uitgevoerd op de achtste dag. Dit model is efficiënt in de studie van PD aangepast. Hier de gedrags tests omvatten de cilinder en de veldtest van het open. Het experiment van de cilinder wordt gebruikt voor het detecteren van de dieren kunnen heffen hun voorste poten waarop in een andere omgeving gebracht. Als de PD model muizen Toon overkoepelende — de muis bogen zijn rug — het aantal paw liftings daling. Deze test is eenvoudig uit te voeren. Het open veldtest wordt gebruikt voor het detecteren van de hoeveelheid tijd dat de muizen op hardlopen, wandelen, en resterende immobiel. Wij analyseren van dieren bewegingen in open veld met behulp van software en gegevens te verkrijgen. Tot slot, we gebruiken levodopa, een van de meest gebruikte PD drugs, als een voorbeeld om te tonen hoe toe te passen van dit model op de studie van PD drugs. Onze resultaten wijzen erop dat MPTP neurotoxiciteit induceert motor tekort, die kan worden verzacht door levodopa.
Inleiding
De ziekte van Parkinson (PD), een van de meest voorkomende ziekten onder oudere personen, is een lange termijn neurodegeneratieve stoornis1. Patiënten weergeven altijd het fenomeen schudden, stijfheid en traagheid van beweging en dementie die over tijd2verergeren. Andere symptomen zoals zintuiglijke, zijn slaap, en emotionele problemen ook vaak waargenomen2. De oorzaak van PD is nog onduidelijk, maar het is algemeen aangenomen dat zowel genetische en ecologische factoren, die leiden verlies van de Dopaminerge neuronen in de substantia nigra3, en ontwikkeling van Lewy organen en Lewy neurites in verschillende regio's van tot de hersenen4.
Tussen de studies van PD, wordt 1-Methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine (MPTP)5 wijd aangepast in het herscheppen van sommige symptomen PD in experimentele modellen. In 1984 vond Langston et al. eerst dat injecties van MPTP in doodshoofdaapjes in parkinsonisme6 resulteerde. Hoewel de MPTP knaagdier model niet de aanwezigheid van Lewy lichamen, oftewel de biomerker voor PD toont, veroorzaakt MPTP Parkinson-achtige symptomen door het vernietigen van de Dopaminerge neuronen in de substantia nigra van de hersenen-7. In vergelijking met andere drugs-model voor PD zoals die geïnduceerd door 6-hydroxydopamine (6-OHDA)8 en 1-methyl-4-phenylpyridinium (MPP +)9, injectie van MPTP is gemakkelijk uit te voeren en het MPTP-model kost minder tijd. Muizen ontvangen MPTP injecties (20-30 mg/kg/dag) voor zeven dagen, en de gedragsmatige tests worden uitgevoerd op de achtste dag10.
Het open veld test11 werd eerst ontwikkeld door Calvin S. Hall, een Amerikaanse12. In verschillende studies, worden verschillende soorten gedrag getest. In onderzoek dat zich op Parkinson ziekten richt, gedrag zoals motoriek activiteiten en de snelheid van voortbewegen worden getest om te zien als invloed van het dier mogelijkheid te bewegen. Vergeleken met andere methoden gebruikt voor het testen van de oprichting van PD dieren, open veldtest is eenvoudig uit te voeren omdat de apparatuur die nodig eenvoudig is, en prototyping en data analysesoftware (b.v., MATLAB, Excel) kan worden gebruikt om gemakkelijk te verzamelen en grafiek de gegevens. Ook is de variatiecoëfficiënt relatief klein13, wat betekent dat het resultaat van open veldtest betrouwbaar is. Een ander voordeel ten opzichte van andere methoden is dat de gedragingen die zijn opgenomen in dit experiment gemakkelijk zijn te onderscheiden; de muizen kunnen lopen, wandelen of stilstaat. Meestal kan de open veldtest op knaagdieren worden gebruikt wanneer de onderzoeker moet evalueren de certificaathouder mobiliteit.
De cilinder-test is een afkorting voor de test van asymmetrische gebruik van de voorpoten. Bij deze test eerst ontworpen is, werd gebruikt om te testen het asymmetrische gebruik van de rat voorpoten14. Hier, gebruiken we deze test om te analyseren van het dier kunnen strekken en zowel van haar voorpoten te gebruiken om nieuwe omgeving te verkennen. Wanneer de substantia nigra en de corpus striatum zijn beschadigd door de MPTP in de hersenen, het dier heeft de neiging om de boog zijn rug en wordt minder waarschijnlijk te strekken en de onbekende omgeving verkennen. Deze test is eenvoudig uit te voeren en een voorlopige resultaten kan geven. Echter heeft deze test hoge interne variabiliteit, dus het algemeen met samen met andere gedrag-experimenten gebruikt wordt.
Nemen van levodopa, die ook bekend staat als levodopa of L-3,4-dihydroxyphenylalanine, is een gemeenschappelijke manier om de ziekte van Parkinson te behandelen aangezien één oorzaak van PD is de daling van dopamine in de. Levodopa is de voorloper van dopamine. Maar in tegenstelling tot dopamine, kan het de bloed - hersen barrière, wat betekent dat het zal efficiënter zijn bij het vergroten van de concentratie van dopamine in de hersenen gebied cross. Nadat het kruist de bloed - hersen barrière, wordt levodopa omgezet in dopamine door L-amino acid decarboxylase15.
Hier beschrijven we de meting en analyse van motor functie in MPTP-induced-PD model muizen met behulp van een cilinder test14 en een gemodificeerde open veldtest. Wij beheren levodopa een voorbeeldfunctie te laten zien hoe dit model in de studie van PD drugs van toepassing. Onze resultaten wijzen erop dat MPTP induceert motor tekort, die kan worden verzacht door levodopa.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Deze studie is uitgevoerd volgens de regels van het internationaal, nationaal en institutioneel gezien van dierproeven. Het studie-protocol werd goedgekeurd door het Comité dierenethiek van Nankai Universiteit.
1. MPTP en levodopa administratie
Opmerking: Tien weken oude vrouwelijke BALB/c muizen werden verstrekt door het Instituut voor Dierkunde, Chinese Academie van Wetenschappen. Muizen werden gehuisvest zes per cage onder een 12u licht/donker cyclus (lichten op op 08:00-20:00), een constante temperatuur van 21-22 ° C en een relatieve vochtigheid van 55% ± 5%. Gesteriliseerde met autoclaaf standaard muizen chow van de dezelfde formulering en water ad libitum werd gegeven aan alle dieren.
- Na een week van acclimatisatie, door de dieren te verdelen in drie groepen van elk zes muizen.
- Naar groep 1, beheren intraperitoneaal injecties (zie stap 1.5) van 250 µL/muis/dag zoutoplossing vanaf dag 1 tot dag 7 en voer intragastric beheer (zie stap 1.6) van 250 µL/muis zoutoplossing op dag 8.
- Groep 2, beheren intraperitoneaal injecties van 20 mg/kg/dag van de MPTP elke dag vanaf dag 1 tot dag 7 en voer intragastric beheer van 250 µL/muis zoutoplossing op dag 8.
- Groep 3, beheren intraperitoneaal injecties van 20 mg/kg/dag voor MPTP vanaf dag 1 tot dag 7 en voer intragastric toediening van levodopa 5 mg/kg op dag 8.
- De intraperitoneale injectie als volgt uitvoeren.
- Laad de drug in een steriele 1 mL injectiespuit met een naald 26 G. Verwijder lucht uit de spuit.
- Nekvel de muis met zijn buik naar boven. Houd het hoofd, de nek en het lichaam van de muis in een rechte lijn evenals met het hoofd vast.
- Hoek de naald te doordringen van het buikvlies. De naald voor een juiste afstand duwen totdat er weinig weerstand is, en vervolgens de drug te injecteren. Trek de naald soepel.
- Voer de intragastric beheer als volgt.
- Bereiden de medicatie in een steriele 1 mL injectiespuit met een naald oral-maagsonde. Verwijder lucht uit de spuit.
- Houd de muis met zijn buik naar boven. Houd het hoofd, de nek en het lichaam van de muis in een rechte lijn met het hoofd vast.
- Houd de naald evenwijdig aan het lichaam van de muis, en het uit de hoek van de muis de mond, de tong ingedrukt te duwen tegen de bovenkaak innerlijke invoegen.
- Met weinig weerstand, waaruit blijkt dat de naald is het invoeren van de slokdarm soepel, duw voorzichtig de naald in een juiste afstand. Voordat het puntje van de naald het onderste deel van de borst bereikt, injecteren de medicatie.
- Trek de naald soepel.
2. cilinder test
Opmerking: De gedrags tests werden uitgevoerd op dag 8. Levodopa werd geïnjecteerd aan de derde groep van muizen 40 min vóór de gedrags tests. Als de gedrags test wordt niet uitgevoerd in dezelfde kamer waar de dieren zijn ondergebracht, moeten dieren worden acclimated aan de nieuwe ruimte voor 30-60 min vóór de test.
- Voer de test 24 h uit na de laatste dosis van MPTP.
- Plaats een transparante glazen cilinder (hoogte = 19.5 cm, diameter = 15 cm, gewicht ≥1 kg) in het midden van een tabel. Omgeven door de cilinder aan drie zijden bekleed met zwart karton aan het effect van licht op het milieu verminderen. Laat één kant van de cilinder geconfronteerd met de camera voor video-opname.
Opmerking: De afstand tussen de karton en de cilinder moet ongeveer 4 tot 8 cm. - Hechten van een camera (> 1 miljoen-pixelresolutie) bij ~ 40-60 cm afstand van de cilinder om ervoor te zorgen dat de volledige cilinder zichtbaar is.
Nota: Dit is ook het nabije noch te ver om de muis niet te storen tijdens het opnemen van de video van de beweging. - Plaats van een muis in de cilinder op een moment en start tegelijk filmen. Stoppen met filmen na 3 min.
Opmerking: Tijdens dit proces, probeer te voorkomen dat lawaai of licht verandert in volgorde te vermijden van de muis gedrag te beïnvloeden. - Plaats de muis terug in hun kooi na het testen.
- De cilinder met water schoon en vervolgens 70% v/v ethanol te spuiten over de binnenwand het zuiveren en verwijderen van geuren van de muis. Veeg de cilinder droog voordat een andere muis in wordt geplaatst.
- Het afspelen van de video in een tempo van 0,5 x de normale snelheid en het aantal paw liften tegen de muur van elke muis.
Opmerking: Paw liften optreden wanneer de muis omhoog op haar hindlimbs opsteekt, roept beide voorpoten boven schouderhoogte en landerijen. Één voorpoot lift niet meegeteld. Gewoonlijk verhoogt een muis haar voorpoten te raken van de muren van de cilinder. Als de muis haar voorpoten boven schouderhoogte meerdere malen continu zonder landing verhoogt, moet het slechts als één keer worden geteld.
3. open veldtest
- Het open veldtest 24 h uitvoeren na toediening van MPTP.
Opmerking: Het kan worden uitgevoerd op hetzelfde moment van de test van de cilinder. - Een vak van transparante open veld reactie voor te bereiden (45 cm L x 45 cm W x 25 cm H) met een houten plaat cover aan de onderkant door een zwarte doek. Repareren van een camera (> 1 miljoen-pixel resolutie) over het veld op een hoogte van 1 m.
Opmerking: De kleur van het open veld vak onder verschillend moet zijn van de geteste muis kleur om de kleurcontrast in de video. - Aanpassen van de camera om ervoor te zorgen dat het vak van de reactie open veld in het midden van de video ligt.
- Een test muis gestoken in het vak, en laat de muis zich vertrouwd te maken met het milieu voor ongeveer 1 minuut.
- Record een 5 min video met behulp van de camera op de computer aangesloten.
- Analyseren van de video met behulp van software-instrumenten (b.v., MATLAB) om de beweging trace figuur, de verdeling van de statische (snelheid < 1 cm/s), lopen (snelheid 1-20 cm/s) en uitvoeren (snelheid > 20 cm/s) tijd, de totale reisde afstand en gemiddelde snelheid van elke geteste muis.
Opmerking: Bij het analyseren van de video, we volgen het hele lichaam van de muis. De gemiddelde snelheid van een instantie betekent dit dat de totale lengte van het pad onder, gedeeld door de verstreken tijd. Daarom, als een muis niet beweegt, de momentane snelheid zou worden beschouwd als nul. - Clean-up elke ontlasting in het reactie veld openen. Spray van 70% ethanol op het vak en veeg het.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
In de test van de cilinder, werd de daling van steigert tegen de muur waargenomen in muizen (groep 2) behandeld met MPTP vanaf dag 1 tot dag 7 en zoute op dag 8 ten opzichte van saline-behandelde muizen (groep 1), terwijl een verhoging van steigert werd waargenomen in de muizen (groep 3) behandeld met MP TP vanaf dag 1 tot en met dag 7 en levodopa op dag 8 ten opzichte van de muizen (groep 2) behandeld met MPTP vanaf dag 1 tot dag 7 en zoute op dag 8 (Figuur 1
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Als gevolg van de vernietiging van de Dopaminerge neuronen in de substantia nigra van de hersenen veroorzaakt MPTP Parkinson-achtige symptomen in muizen7. Levodopa is de meest aangewezen geneesmiddel voor PD ooit sinds het klinische gebruik ervan, omdat het helpt bij het handhaven van de normale dagelijkse activiteiten bij patiënten met PD, met effectieve onderdrukking van motor afwijkingen, met inbegrip van de Akinesie en rigiditeit15. De muizen behandeld met MPTP toonde b...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben niets te onthullen.
Dankbetuigingen
Ons werk wordt gefinancierd door Tianjin Undergraduate opleidingen voor innovatie en ondernemerschap (Grant nr. 63183004). Dit project werd gestart in de staat sleutel laboratorium voor geneeskrachtige chemische biologie Nankai Universiteit. De auteurs verklaren dat er geen conflicten van belangen.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| 70% Ethanol | Ruiboxing Company | RBX-64175 | |
| Camera | BASLER | acA645-100gm | |
| Cylinder test | Gemaakt in-house aan Nankai University | N/A | |
| Excel | Microsoft | N/A | |
| Levodopa | Sigma-Aldrich | 72816 | |
| Matalb 2017a | Mathworks | N/A | |
| Mice | Institute of Zoology, Chinese Academy of Sciences | Balb/c | Volwassen vrouwelijke muizen (10 weken) |
| MPTP | Yuanye Biological Technology Company Ltd., Shanghai | S31504-500mg | |
| Open field test | Gemaakt in-house aan Nankai University | N/A | |
| Spuit | Solelybio | S-xsgwz-w | Irrigation |
| Spuit | Jiangxi Fenglin Medical Application Co. | hc3824 | Intraperitoneale injectie |
Referenties
- Dehay, B., Bourdenx, M., Gorry, P., Przedborski, S., Vila, M., Hunot, S., Singleton, A., Olanow, C. W., Merchant, K. M., Bezard, E. Targeting -synuclein for treatment of Parkinson's disease: mechanistic and therapeutic considerations. Lancet Neurology. 14, 855-866 (2015).
- Weintraub, D., Comella, C., Horn, L., S, Parkinson's disease - Part 1: Pathophysiology, symptoms, burden, diagnosis, and assessment. American Journal of Managed Care. 14, 40-48 (2008).
- Ismaiel, A. A., et al. Metformin, besides exhibiting strong in vivo anti-inflammatory properties, increases mptp-induced damage to the nigrostriatal dopaminergic system. Toxicology and Applied Pharmacology. , 19-30 (2016).
- Bayliss, J. A., et al. Ghrelin-AMPK signaling mediates the neuroprotective effects of calorie restriction in Parkinson's disease. Journal of Neuroscience. 36, 3049-3063 (2016).
- Olanow, C. W., Stern, M. B., Sethi, K. The scientific and clinical basis for the treatment of Parkinson disease. Neurology. 72 (21 Supplement 4), (2009).
- Chiba, K., Trevor, A., Castagnoli, N. Metabolism of the neurotoxic tertiary amine, MPTP, by brain monoamine oxidase. Biochemical & Biophysical Research Communications. 120 (2), 574-578 (1984).
- Bakay, R. A., et al. Biochemical and behavioral correction of MPTP parkinson-like syndrome by fetal cell transplantation. Annals of the New York Academy of Sciences. 495 (1), 623-638 (2010).
- Kelly, P. H., Seviour, P. W., Iversen, S. D. Amphetamine and apomorphine responses in the rat following 6-OHDA lesions of the nucleus accumbenssepti and corpus striatum. Brain Research. 94 (3), 507-522 (1975).
- Langston, J. W., Irwin, I., Langston, E. B., Forno, L. S. 1-methyl-4-phenylpyridinium ion (MPP+): identification of a metabolite of MPTP, a toxin selective to the substantia nigra. Neuroscience Letters. 48 (1), 87-92 (1984).
- Katila, N., et al. Metformin lowers α-synuclein phosphorylation and upregulates neurotrophic factor in the MPTP mouse model of Parkinson's disease. Neuropharmacology. 125, (2017).
- Goldberg, N. R. S., Haack, A. K., Lim, N. S., Janson, O. K., Meshul, C. K. Dopaminergic and behavioral correlates of progressive lesioning of the nigrostriatal pathway with MPTP. Neuroscience. 180, 256-271 (2011).
- Schwarting, R. K., Sedelis, M., Hofele, K., Auburger, G. W., Huston, J. P. Strain-dependent recovery of open-field behavior and striatal dopamine deficiency in the mouse MPTP model of Parkinson's disease. Neurotoxicity Research. 1 (1), 41(1999).
- Shiguang, S., et al. The open field test as a method for ethology in Kunming mice: test-retest reliability. Chinese Journal of Behavioral Medicine and Brain Science. 19 (12), 1093-1095 (2010).
- Roome, R. B., Vanderluit, J. L. Paw-Dragging: a Novel, Sensitive Analysis of the Mouse Cylinder Test. Journal of Visualized Experiments. (98), e52701(2015).
- Cotzias, G. C., Van Woert, M. H., Schiffer, L. M. Aromatic amino acids and modification of Parkinsonism. New England Journal of Medicine. 282, 31-33 (1967).
- Cassady, J. C., Johnson, R. E. Cognitive test anxiety and academic performance. Contemporary Educational Psychology. 27 (2), 270-295 (2002).
- Rogalewski, A., et al. Semaphorin 6A improves functional recovery in conjunction with motor training after cerebral ischemia. Plos One. 5 (5), 0010737(2010).
- Chen, W., Qiao, D., Liu, X., Shi, K. Treadmill exercise improves motor dysfunction and hyperactivity of the corticostriatal glutamatergic pathway in rats with 6-ohda-induced parkinson's disease. Neural Plasticity. 2017, 2583910(2018).
- Colas-Zelin, D., et al. The imposition of, but not the propensity for, social subordination impairs exploratory behaviors and general cognitive abilities. Behavioural Brain Research. 232 (1), 294-305 (2012).
- Spurney, C., et al. Preclinical drug trials in the mdx mouse: Assessment of reliable and sensitive outcome measures. Muscle Nerve. 39, 591-602 (2009).
- Valle, F. P. Effects of strain, sex, and illumination on open-field behavior of rats. American Journal of Psychology. 83, 103-111 (1970).
- Tatem, K. S., et al. Behavioral and Locomotor Measurements Using an Open Field Activity Monitoring System for Skeletal Muscle Diseases. Journal of Visualized Experiments. (91), e51785(2014).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
