Hier presenteren we een protocol voor het onderzoek naar het effect van de ongeldigheidsverklaring van gustation-gerelateerde genen op immuunresponsen bij een dextran sulfaat natrium (DSS)-geïnduceerde muismodel van inflammatory bowel disease (IBD).
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Effecten van smaak signalering eiwitten afschaffing op ontsteking van de darm in een muismodel van Inflammatory Bowel Disease
* These authors contributed equally
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Ontstekingsdarmziekte (IBD) is één van de immuun-gerelateerde gastro-intestinale aandoeningen, met inbegrip van colitis ulcerosa en de ziekte van Crohn, dat is van invloed op de levenskwaliteit van miljoenen mensen wereldwijd. IBD symptomen zijn buikpijn, diarree, en rectale bloeden, dat uit de interacties tussen de darmflora, voedingsbestanddelen, intestinale epitheliale cellen en immuuncellen voortvloeien kan. Het is van bijzonder belang voor het beoordelen van de invloed van elke belangrijke gen uitgedrukt in de intestinale epitheliale en immuun cellen op ontsteking in de dikke darm. G eiwit-gekoppelde smaak receptoren, waaronder G eiwit subeenheid α-gustducin en andere signalering eiwitten, gevonden in de darmen. Hier, gebruiken we α-gustducin als vertegenwoordiger en beschrijven een dextran sulfaat natrium (DSS)-geïnduceerde IBD model te evalueren van het effect van smaak genmutaties op gut mucosale immuniteit en ontsteking. Deze methode combineert gentechnologie knock-out met het chemisch geïnduceerde IBD-model, en dus kan worden toegepast voor de beoordeling van de resultaten van smaak gene ongeldigheidsverklaring evenals andere genen die kunnen exuberate of temperen de DSS-geïnduceerde immuunrespons in de dikke darm. Mutant muizen worden met DSS beheerd gedurende een bepaalde periode waarin hun lichaamsgewicht, kruk en rectale bloeden worden gecontroleerd en geregistreerd. Op verschillende tijdstippen tijdens beheer, zijn sommige muizen euthanized, dan de maten en gewichten van hun milt en dubbele punten worden gemeten en darmen weefsels worden verzameld en verwerkt voor histologisch en gen expressie analyses. De gegevens tonen aan dat de resultaten van de knock-out α-gustducin in overmatig gewichtsverlies, diarree, intestinale bloedingen, weefselschade en ontsteking vs. wild-type muizen. Omdat de ernst van de ontsteking geïnduceerde wordt beïnvloed door muis stammen, huisvesting, milieu en voeding, is optimalisatie van DSS concentratie en administratie duur in een proefproject bijzonder belangrijk. Door deze factoren aan te passen, kan deze methode worden toegepast om te beoordelen van zowel anti - en pro-inflammatoire effecten.
Inleiding
De twee belangrijkste vormen van ontstekingsdarmziekte (IBD), ziekte van Crohn (CD) en colitis ulcerosa (UC) worden gekenmerkt door chronische remittent of progressief inflammatoire aandoeningen van de darm met multifactoriële etiologie1,2 . De ontwikkeling van IBD is afhankelijk van genetische alsmede bepaalde omgevingsfactoren, zoals voeding, antibioticagebruik, en belangrijker, pathogene infecties. De etiologie en regulerende moleculaire mechanismen ten grondslag liggen aan IBD zijn echter nog onduidelijk. Vandaar, zijn vele chemisch geïnduceerde IBD diermodellen gebouwd en toegepast om te bakenen de pathogenese en de regulerende mechanismen en de doeltreffendheid van menselijke therapeutics3.
Smaak receptoren zijn G eiwit-gekoppelde receptoren (GPCRs) en zijn geclassificeerd als twee belangrijke types: type I (T1Rs), en type II (T2Rs) die zoete, umami en bittere stoffen te detecteren. Smaak signalering cascades worden ingeleid door tastant te binden aan T1Rs of T2Rs, het activeren van de heterotrimeric G eiwitten bestaande uit α-gustducin en een Gβγ dimeer en leidt tot het vrijgeven van de subeenheden van Gβγ. De Gβγ groep stimuleert op zijn beurt de stroomafwaartse effector enzym phospholipase C-β2 (PLC-β2). Geactiveerde PLC-β2 dan phosphatidylinositol-4,5-difosfaat ontstabiel in twee intracellulaire secundaire boodschappers [inositol-1,4,5-trisphosphate (IP-3) en diacylglycerol], en IP-3 bindt aan en open het kanaal-receptor IP-3 R3, het vrijgeven van calciumionen uit het endoplasmatisch reticulum. Dit leidt uiteindelijk tot de opening van voorbijgaande receptor potentiële ionkanaal Trpm5 en vrijlating van de neurotransmitter ATP op de smaak zenuwen4,5,6,7. Toch zijn de signaalroutes van zoute en zure smaak andere en onafhankelijke van zoete, umami en bittere smaken8. Bovendien, bestaan de componenten van smaak GPCRs en downstream eiwitten in verschillende extra mondelinge weefsels. Recente studies aangegeven dat α-gustducin, is de belangrijkste component van de smaak signalering, gevonden moet worden uitgedrukt in de intestinale mucosa. Verdere studies zijn nodig om te begrijpen van de functies van deze smaak signalering van componenten in extra mondelinge weefsels9,10.
De hier beschreven methode wordt gebruikt om aan te geven van de functies van de smaak signalering eiwitten uitgedrukt in extra mondelinge weefsels. Wij combineren een transgene muis lijn ontwikkeld voor signalering cascades in smaakpapillen met het chemisch geïnduceerde colitis model uitgezet. Grotendeels te wijten aan de procedurele eenvoud en pathologische gelijkenissen met menselijke colitis ulcerosa, de dextran natrium (DSS) sulfaat-geïnduceerde IBD model heeft zijn meest gebruikte onder de verschillende chemisch geïnduceerde colitis modellen11. In deze studie gebruikten we α-gustducin-deficiënte muizen als een representatieve muis lijn te onthullen van de nieuwe functies van α-gustducin in de darm mucosale immuniteit en ontsteking door 1) analyseren morfologische veranderingen in het weefsel en 2) keuring van de verschillen in de expressie van cytokines gerelateerde tot ontsteking in de dikke darm. Deze methode kan worden gebruikt voor kwantitatief en kwalitatief bepalen de bijdragen van smaak signalering eiwitten (en andere eiwitten uitgedrukt in de darm) tot weefselschade en darmontstekingen, wanneer genetisch gemodificeerde muis voor de genen van lijnen belang zijn beschikbaar. Voordelen van deze methode zijn toelatend gebruikers om geïntegreerde gegevens als gevolg van acties van zowel de chemische DSS en tekort aan het gen van belang te verkrijgen. Deze methode kan verder worden verbeterd om te verhogen van de gevoeligheid en onthullen subtiele intestinale veranderingen op cellulair en moleculair niveau.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Alle experimenten met muizen werden herzien en goedgekeurd door de institutionele Animal Care en gebruik commissies van Zhejiang Universiteit. Het is aangeraden om te dragen van geschikte persoonlijke beschermingsmiddelen alvorens dit protocol uit te voeren.
1. bereiding van muizen en DSS
- De knock-out (α-gustducin- / -) muizen en leeftijd - geslacht- en lichaam gewicht-matched wild-type controle houden (α-gustducin+/ +) C57BL/6 muizen individueel in schone kooien.
Opmerking: De knock-out muizen met C57BL/6 muizen voor meer dan 20 generaties hebben zijn backcrossed en hebben een bijna 100% C57BL/6 genetische achtergrond. - Los 30 g dextran sulfaat natrium (DSS) poeder in 1 L gesteriliseerde met autoclaaf water. Meng tot de oplossing blijkt om ervoor te zorgen dat de uiteindelijke concentratie van de werken 3% (m/v is).
Opmerking: De DSS-oplossing of kan worden opgeslagen op kamertemperatuur voor maximaal 1 week bij 4 ° C tot gebruik.
2. inductie en evaluatie van DSS Colitis bij muizen
- Wegen en registreren van elke muis eerste lichaamsgewicht. Plaats de muizen individueel in de standaard kunststof kooien en label van de kooien.
- Vervang regelmatig drinkwater met 3% DSS oplossing voor een totaal van 7 dagen waarop beide groepen van muizen toegang ad libitum hebben.
- Meten van de muis lichaamsgewicht, opnemen van DSS oplossing consumptie, en verzamelen en onderzoeken van de ontlasting van elke muis dagelijks tijdens de DSS-administratie. De ernst van de diarree, en rectale bloeden observeren en converteer dit naar de DSS-geïnduceerde ziekte index12.
- Tijdens het experiment wordt berekend welk percentage van verlies van het gewicht in vergelijking met begingewicht en de index van de ziekte te evalueren van de symptomen van colitis.
Opmerking: De index van de ziekte is georkestreerd door het combineren van waarnemingen van diarree, en rectale bloeden en worden als volgt gedefinieerd: 0 (normale stoelgang, geen bloed), 1 (zachte ontlasting, geen bloed), 2 (zachte ontlasting, weinig bloed), 3 (zeer zachte ontlasting, bescheiden bloeden), en 4 (waterige ontlasting, belangrijke bloeden)12. De ziekte-index wordt dagelijks geanalyseerd voor elke muis. - Tegen het einde van de 7-daagse DSS behandeling, offeren de muizen door cervicale dislocatie en ga verder met de resterende experimenten.
3. bereiding van weefselmonsters
- Plaatst u de muisaanwijzer in de liggende positie en reinig de huid van de buik met 70% ethanol. Maak een 3 cm lange middellijn incisie in de buik met een kleine schaar te bloot van de buikholte.
- Gebruik een paar pincet te scheiden van de milt van andere weefsels, dan verwijder voorzichtig de milt en het meten van de omvang.
- Identificeren en til de dikke darm met een tang en scheiden van de omliggende mesenterium. Trek de hele dikke darm totdat de blindedarm en endeldarm zichtbaar zijn.
- Het isoleren van de dikke darm door het transecting in de marge van de colonocecal en diep in het bekken te bevrijden van de proximale en distale dikke darm, respectievelijk. Vervolgens meten en registreren van de lengte van de geïsoleerde dubbele punt. Wees voorzichtig niet te beschadigen het Colon weefsel tijdens de ontleden procedure.
- Spoelen van de dikke darm met 10 mL ijskoud-fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) met een 10 mL spuit uitgerust met een maagsonde naald om de ontlasting en bloed, totdat het eluaat volledig helder is.
- Voor histologisch identificatie, de weefselmonsters even in drie delen verdelen: proximale, distale en midden. Dan, fix het weefsel met 4% paraformaldehyde (PFA) 's nachts bij 4 ° C.
- Voor de analyse van cytokine-expressie, bevriezen van de hele dikke darm snel met vloeibare stikstof en opslaan bij-80 ° C tot gebruik.
4. histologische beoordeling van de ernst van DSS-geïnduceerde Colitis
- De Haematoxyline en eosine (H & E) kleuring
- Dompelen na fixatie, het weefsel in een oplossing van 30% sucrose in 1 x overnachting in een tube van 15 mL PBS te cryoprotect de monsters.
- Insluiten van het weefsel in optimale scherpe temperatuur (OCT) samengestelde en plaats deze bij-20 ° C, totdat de LGO verhardt.
- Overdracht van het blok van de OCT bevat het weefsel naar een cryostaat, de dikte wijzerplaat instellen in de cryostaat 12 µm en segment en verzamelen van 12 µm-dikke bevroren secties.
- Verwarm de verzamelde weefselsecties uit een cryostaat bij 65 ° C gedurende 20 minuten op een hete plaat.
- Wassen van de secties kort in gedestilleerd water. Vlekken hen met haematoxyline kleurstofoplossing gedurende 5 minuten en vervolgens spoelen met stromend kraantjeswater voor 5 min.
- Onderscheiden van de secties met 0,5% zoutzuur-ethanol voor 30 s en spoel ze in lopen leidingwater voor 1 min. Vervolgens voeren de wash in 1 x PBS voor 1 min en vervolgens spoelen met stromend kraantjeswater voor 5 min.
- Wassen van de weefselsecties uitvoeren in 70%, 75%, 80% en 95% alcohol, elk voor 10 s. Counterstain in eosine kleurstofoplossing gedurende 2 minuten.
- Telkens uitdroging door middel van 95% alcohol en 2 wijzigingen van absolute alcohol voor 5 min uitvoeren. Duidelijk in 2 wijzigingen van xyleen gedurende 5 minuten.
- Score van weefselschade van de proximale, distale en middelste dikke darm van elke muis voor zowel de gene knock-out en de wild-type groepen op basis van de resultaten van de bovenstaande H & E kleuring.
Opmerking: De index van de ziekte is een gecombineerde score van epitheliale beschadiging en ontsteking in de mucosa, submucosa muscularis en sereus vlies regio's, die wordt als volgt gedefinieerd: 0 (geen weefselschade en ontsteking), 1 (focal weefselschade en ontsteking), 2 (fragmentarisch weefselschade en ontsteking), en 3 (diffuus weefselschade en ontsteking)12,,13. Drie scores per muis voor de proximale, middelste en distale delen van de dikke darm worden dan opgeteld om het verkrijgen van een totale score voor elk dier. De gemiddelde scores voor elke groep worden vervolgens berekend.
- Immunohistochemistry14
- Verwarm de verzamelde weefselsecties uit een cryostaat bij 65 ° C gedurende 20 minuten op een hete plaat. Het wassen van de secties in 1 x PBS 3 keer, voor elke 10 min. Incubeer de weefselsecties in 3% waterstofperoxide voor 10 min te elimineren endogene peroxidase. Wassen van de secties 3 keer. Blokkeren de weefsels met het blokkeren van de buffer (3% BSA 0,3% niet-ionogene wasmiddel, 2% geit serum, natriumazide 0,1% in 1 x PBS) bij kamertemperatuur gedurende 1 uur of meer.
- Vervangen van de buffer met blokkerend met een oplossing die de volgende immuun cel type-specifieke primaire antilichamen: CD45 voor leukocyten CD3 voor T-cellen, B220 voor B-cellen, CD11b voor macrofagen en Ly6G voor de neutrofielen. Bij 4 ° C na een nacht bebroeden.
- Verwijder de primaire antilichamen van weefselsecties door aspiratie. Wassen van de secties met 1 x PBS 3 keer, voor elke 10 min. Incubeer de secties met secundair antilichaam biotinyleerd gevolgd door incubatie met het daar-HRP-complex bij kamertemperatuur.
- Incubeer de secties 3, 3'-diaminobenziding (DAB) oplossing voor het ontwikkelen van een kleur licht of donker-bruin - en visualiseren van de immunoreactive cellen.
- Counterstain van de secties met haematoxyline en 0,3% (v/v), verdunde ammoniak. Neem heldere-veld beelden bij 10 X vergroting onder een microscoop.
- Een beeld processing programma gebruiken voor het identificeren en kwantificeren van de bevolking van de gemarkeerde immuuncellen in het epithelium zowel de lamina propria (onder het epitheel) door 2 maskers instellen: gebruik het eerste masker de kleur kubus-gebaseerde functie om de detectie van een kleur drempel en meten van de gekleurde DAB-reactieve gebieden; Gebruik de tweede masker om te bepalen van de totale bebouwde epitheel of de laminaire propria in de onderzochte sectie. Express de immunoreactive celpopulatie als een verhouding van de kleuring ruimte van de geïnfiltreerde cellen aan de oppervlakte van het onderzochte weefsel.
5. gen expressie beoordeling van DSS-geïnduceerde Colitis
- De dikke darm weefsels ophalen in de DSS-behandelde gene knock-out en wild-type muizen uit een diepvriezer-80 ° C en 0,6 mL lysisbuffermengsel toevoegen aan 25 mg van weefsel, dan Meng in een homogenizer.
- Volg de RNA extractie kit protocol om uit te pakken van de totale RNA en DNase ik wordt gebruikt voor het elimineren van alle contaminerende genomic DNA.
- Voer een agarose gel om te controleren de kwaliteit van de uitgepakte RNA. Als haar 28 RNA band lichter dan 18S band is, is het bruikbaar. Neem 1 µL van het RNA-monster te bepalen van de RNA-concentratie op een microspectrophotometer.
- Meng 1 µg voor de totale RNA met 2,5 µL van 20 mM oligo (dT)12,13,14,15,16,17,18 primers en 1 µL van Moloney lymfkliertest leukemie virus (MMLV) reverse-transcriptase. Incubeer bij 42 ° C gedurende 60 minuten te bereiden cDNA.
- Real-time PCR reacties instellen door het mengen van 1µL van cDNA met 0,5 µL van voorwaartse en omgekeerde qPCR primers voor TNF, IFN-γ, IL-5, IL-13, IL-10, TGF-β1 en β-actine als een controle naast 2 x fluorescente groene kleurstof.
- De qPCR worden uitgevoerd met de volgende parameters: 95 ° C gedurende 10 min, gevolgd door 45 cycles van 95 ° C voor 10 s, 50 ° C voor 25 s, en 72 ° C gedurende 20 s.
- Bereken de relatieve kwantificering van de genexpressie door gebruik te maken van de 2--ΔΔCt methode15. Relatief analyseren de gen expressie niveaus in de knock-out vs. wild-type muizen.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Een DSS-geïnduceerde IBD-procedure werd opgericht door het beheer van 3% DSS in drinkwater α-gustducin-knock-out (KO) en wild-type (WT) muizen. Vergeleken met WT muizen, tentoongesteld de knock-out muizen meer ernstige colitis met overmatig gewichtsverlies, diarree en intestinale bloeding (Figuur 1). Na een 7-daagse DSS toediening, de verschillen in weefsel integriteit werden geanalyseerd met H & E kleuring als de histologische methode en meer verergerd weefs...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Deze methode kan worden gebruikt om te quantitively bepalen van het effect van mutaties van specifieke smaak genen op ontsteking in een muismodel van DSS-geïnduceerde IBD. U kunt optimaal profiteren, is optimale inductie van IBD een belangrijke stap. De ontwikkeling van colitis is beïnvloed door verschillende factoren, inclusief muis stam, huisvesting, milieu, intestinale microflora, evenals de genen van belang. Het is raadzaam voor het uitvoeren van een proefproject met een klein aantal muizen om te testen verschillende...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen hebben.
Dankbetuigingen
Dit werk wordt ondersteund door subsidies van de nationale natuurwetenschappen Stichting van China (81671016, 31471008 en 31661143030) en de National Institutes of Health (DC010012, DC015819) en door de Stichting Siyuan.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Antibody | |||
| CD45 | BD Biosciences | 550539 | |
| CD3 | BD Biosciences | 555273 | |
| B220 | BD Biosciences | 550286 | |
| CD11b | BD Biosciences | 550282 | |
| Ly6G | BD Biosciences | 551459 | |
| Reagens | |||
| Dextran Sulfaat Natriumzout (DSS) | MP Biomedicals | 2160110 | |
| Streptavidine-HRP-complex | BD Pharmingen | 551011 | |
| H&E Kleurset | BBI Life Sciences | E607318 | |
| Fosfaat Buffered Saline (PBS) | Sangon Biotech | B548117 | |
| FastStart Universal SYBR Green Master(ROX) | Roche | 4913850001 | |
| MMLV Reverse Transcriptase, GPR | Clontech,TaKaRa | 639574 | |
| TaKaRa MiniBEST Universal RNA Extractie Kit | TaKaRa | 9767 | |
| BD 10 mL Spuit | BD Biosciences | 309604 | |
| Instrumenten en apparatuur | |||
| weegschaal | |||
| scharen | |||
| pincetten | |||
| centrifuge | |||
| qPCR-machine | |||
| kleurvaten | |||
| Software | |||
| Imag-Pro Plus | Media Cybernetics, Inc. |
Referenties
- Kaser, A., Zeissig, S., Blumberg, R. S. Inflammatory Bowel Disease. Annual Review of Immunology. 28 (1), 573-621 (2010).
- Benoit, C., D, A. J., Madhu, M., Matam, V. K. Dextran Sulfate Sodium (DSS)-Induced Colitis in Mice. Current Protocols in Immunology. 104 (1), 11-14 (2014).
- Chassaing, B., Darfeuille-Michaud, A. The Commensal Microbiota and Enteropathogens in the Pathogenesis of Inflammatory Bowel Diseases. Gastroenterology. 140 (6), 1720-1728 (2011).
- Chandrashekar, J., Hoon, M. A., Ryba, N. J. P., Zuker, C. S. The receptors and cells for mammalian taste. Nature. 444 (7117), 288-294 (2006).
- Gilbertson, T. A., Khan, N. A. Cell signaling mechanisms of oro-gustatory detection of dietary fat: Advances and challenges. Progress in Lipid Research. 53, 82-92 (2014).
- Huang, L., et al. Gγ13 colocalizes with gustducin in taste receptor cells and mediates IP3 responses to bitter denatonium. Nature Neuroscience. 2 (12), 1055-1062 (1999).
- Perez, C. A., et al. A transient receptor potential channel expressed in taste receptor cells. Nature Neuroscience. 5 (11), 1169-1176 (2002).
- Shigemura, N., Ninomiya, Y. Recent Advances in Molecular Mechanisms of Taste Signaling and Modifying. International Review of Cell and Molecular Biology. 323, 71-106 (2016).
- Bezençon, C., et al. Murine intestinal cells expressing Trpm5 are mostly brush cells and express markers of neuronal and inflammatory cells. Journal of Comparative Neurology. 509 (5), 514-525 (2008).
- Lu, P., Zhang, C. -H., Lifshitz, L. M., ZhuGe, R. Extraoral bitter taste receptors in health and disease. The Journal of General Physiology. 149 (2), 181-197 (2017).
- Wirtz, S., Neufert, C., Weigmann, B., Neurath, M. F. Chemically induced mouse models of intestinal inflammation. Nature Protocols. 2, 541-546 (2007).
- Chassaing, B., Aitken, J. D., Malleshappa, M., Vijay-Kumar, M. Dextran sulfate sodium (DSS)-induced colitis in mice. Current Protocols in Immunology. 104 (25), Unit 15 (2014).
- Feng, P., et al. Aggravated gut inflammation in mice lacking the taste signaling protein α-gustducin. Brain, Behavior, and Immunity. 71, 23-27 (2018).
- Feng, P., et al. Immune cells of the human peripheral taste system: Dominant dendritic cells and CD4 T cells. Brain, Behavior, and Immunity. 23 (6), 760-766 (2009).
- Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods. 25 (4), 402-408 (2001).
- Kim, J. J., Shajib, M. S., Manocha, M. M., Khan, W. I. Investigating Intestinal Inflammation in DSS-induced Model of IBD. Journal of Visualized Experiments. (60), 3678(2012).
- Axelsson, L. -G., Landström, E., Goldschmidt, T. J., Grönberg, A., Bylund-Fellenius, A. -C. Dextran sulfate sodium (DSS) induced experimental colitis in immunodeficient mice: Effects in CD4+-cell depleted, athymic and NK-cell depleted SCID mice. Inflammation Research. 45 (4), 181-191 (1996).
- Egger, B., et al. Characterisation of Acute Murine Dextran Sodium Sulphate Colitis: Cytokine Profile and Dose Dependency. Digestion. 62 (4), 240-248 (2000).
- Whittem, C. G., Williams, A. D., Williams, C. S. Murine Colitis Modeling using Dextran Sulfate Sodium (DSS). Journal of Visualized Experiments. (35), 1652(2010).
- Howitt, M. R., et al. Tuft cells, taste-chemosensory cells, orchestrate parasite type 2 immunity in the gut. Science. 351 (6279), New York, N.Y. 1329-1333 (2016).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
