Fluorescerende zilveren kleuring van eiwitten in Polyacrylamide Gels

Samenvatting

Hier beschrijven we een gedetailleerd protocol waarin een nieuwe TL kleuring techniek voor de detectie van de totale proteïne in polyacrylamide gels. Het protocol maakt gebruik van een zilveren ion-specifieke fluorescentie turn-on sonde, die Ag⁺detecteert-eiwitcomplexen, en elimineert bepaalde beperkingen van traditionele chromogenic zilveren vlekken.

Samenvatting

Zilveren kleuring is een colorimetrische techniek op grote schaal gebruikt om te visualiseren van eiwitten bands in polyacrylamide gels na natrium dodecyl sulfaat-polyacrylamide gelelektroforese (SDS-pagina). De klassieke zilveren vlekken hebben bepaalde nadelen, zoals hoge achtergrond kleuring, slechte eiwit recovery, lage reproduceerbaarheid, een smalle lineaire dynamische bereik voor kwantificering en beperkte compatibiliteit met massaspectrometrie (MS). Nu, met het gebruik van een fluorogenic Ag⁺ sonde, TPE-4TA, ontwikkelde we een fluorescerende silver kleuring van de methode voor de totale eiwit visualisatie in polyacrylamide gels. Deze nieuwe vlek vermijdt de lastige zilveren vermindering stap in traditionele zilveren vlekken. Bovendien toont de fluorescerende zilveren vlek aan lineaire kwantificering detectie van eiwit, waardoor het een nuttige en praktische eiwit gel vlek, goede reproduceerbaarheid en gevoeligheid.

Inleiding

Vele kleuring methoden zijn gebruikt om te visualiseren van eiwitten na de Elektroforese van het gel, bijvoorbeeld met behulp van colorimetrische kleurstoffen zoals Coomassie briljant blauw, zilver vlek, fluorescentie, of radioactieve labeling van^{1,2, 3 , 4}. Zilveren kleuring wordt beschouwd als een van de meest gevoelige technieken voor de detectie van de eiwitten die eenvoudige en goedkope reagentia. Het kan worden onderverdeeld in twee grote families: de ammoniumstikstof zilveren vlek en de zilvernitraat vlek^5,6. In de alkalische ammoniumstikstof zilveren methode, is de zilver-diamine-complex geproduceerd met ammoniak en natriumhydroxide en gereduceerd tot metallisch zilver tijdens de ontwikkeling met behulp van een zure formaldehyde-oplossing. De vlek herbergt efficiënt voor fundamentele eiwitten maar toont een gecompromitteerde prestaties voor zure en neutrale eiwitten en is bovendien beperkt tot klassieke glycine en taurine elektroforetische systemen. Ter vergelijking: de zilvernitraat vlekken exploiteren de hoge bio-affiniteit van zilver ionen aan proteïne, voornamelijk de sulfaatzuurstof carboxyl groepen van de zijketens en de neiging om vlekken van zure eiwitten efficiënter⁷. Na zilver ion bindend, een derde oplossing (meestal gemaakt van een oplossing van de metalen carbonaat met formaldehyde en natrium thiosulfaat) wordt toegepast ter vermindering van zilver-ionen tot metallisch zilver korrels, die een kleur bruin-naar-dark opbouwen te visualiseren de eiwit bands.

Hoewel zilver kleuring goed-gekend voor zijn veelzijdigheid en hoge gevoeligheid sinds haar ontwikkeling in de jaren 1970-^{8 is}, wordt de methode vaak beschouwd als lastig. Zilver-kleuring methoden hebben tijd-beperkte stappen en reproduceerbaarheid van de lage tonen. Omdat de kleur van de zilveren vlek meestal niet is uniform en afhankelijk van de vermindering van de stap, die moeilijk te controleren is, de zilveren vlek is niet een kwantitatieve methode en, dus, niet aanbevolen voor gel vergelijking studie en eiwit kwantificering⁹. Methoden geoptimaliseerd in gevoeligheid kunnen gebruik maken van aldehyden die kunnen ook zorgen voor een meer uniform kleuring¹⁰. Dit is echter ten koste van verder stroomafwaarts analyse als gevolg van het crosslinking van eiwitten door aldehyden. Snelle protocollen meestal combineren of verkorten stappen ter vermindering van de tijd, de reproduceerbaarheid en de eenvormigheid van de vlek⁵in gevaar te brengen. Dientengevolge, zijn er talrijke zilver kleuring varianten binnen eiwit gel kleuring, elk geoptimaliseerd voor bepaalde wensen; bijvoorbeeld, eenvoud, gevoeligheid, of peptide terugvinding voor downstream-analyse. Deze kenmerken kunnen ook een invloed hebben op elkaar kan, en die voldoen aan alle eisen in één protocol moeilijk.

In dit werk introduceren wij een nieuwe TL silver methode voor de detectie van de eiwitten in polyacrylamidegel kleuring. In deze methode gebruiken we een fluorogenic-sonde voor zilver-ionen, TPE-4TA (Figuur 1), te visualiseren de zilver-geïmpregneerd eiwitten¹¹. TPE-4TA is ontworpen door de aggregatie-geïnduceerde emissie (AIE)-principe. Het is niet-emissieve wanneer opgelost in waterige oplossing, maar is zeer emissieve in aanwezigheid van een zilver-ionen. Door vervanging van de chromogenic ontwikkeling in traditionele zilveren vlekken met een fluorogenic ontwikkeling van de stap, kunt de fluorescerende zilveren methode de robuuste kleuring van totale eiwitten met een beperkte achtergrond.

Bovendien bleek de fluorescerende zilveren vlek een goede dynamisch lineaire bereik voor eiwit kwantificering, die vergelijkbaar is met de veel gebruikte SYPRO Ruby vlek niet haalbaar is met traditionele zilveren vlekken en. De gel kan worden beeld op documentatiesystemen gebruikte gel met een UV-lamp (excitatie golflengte: 302/365 nm kanaal; emissie: ~ 490-530 nm) bij vele biologische labs.

Protocol

1. voorbereiding van het Gel

Opmerking: De demonstratie volgt een standaardprotocol ter voorbereiding van het gel van kleuring kort na SDS-pagina¹². Kortom, de volgende stappen beschrijven de voorbereiding van de monsters en gel elektroforese.

1. SDS-pagina met 4% - 12% Bis-Tris eiwit gels (1 mm, 15-well) uitvoeren met behulp van een mini gel tank gevuld met 2-(N -morfolino) ethanesulfonic zuur (MES) buffer.
2. Verdun de monsters met een mengsel van gedestilleerd water, lithium dodecyl sulfaat (LDS) buffer en een monster-reducerende agent.
3. Laden van de eerste baan met dubbele van het bedrag van aandelen (10 µL), gevolgd door de normale voorraad bedrag (5 µL) en een reeks tweevoudige verdunningen van het materieel daarna (13 verdunningen, van 2 x tot 8192 x).
4. Stel de gel met een constante spanning van 200 V voor 30 min.

2. de fixatie van het Gel

1. Na elektroforese, dompelen de gels in een 100 mL oplossing van 40% ethanol/10%-azijnzuur op een roteerschudapparaat 50 rpm bij kamertemperatuur 2 x (elk gedurende 30 minuten), of 's nachts bij 4 ° C.
2. De gels 3 x 10 minuten, elk in ultrazuiver water in een schone recipiënt te wassen. De wassen stap is essentieel. Als het zuur uit de fixing oplossing is niet correct verwijderd in de derde stap van fluorogenic, de buitensporige TPE-4TA wordt geactiveerd door het zuur en leiden tot sterke achtergrond fluorescentie in de gel.

3. voorbereiding van de AgNO₃oplossing en zilveren impregneren van het Gel

1. Om de oplossing₃ AgNO (0,0001%) voor de impregnering, de eerst los 0.01 g van AgNO₃ in 10 mL ultrazuiver water voor te bereiden van een stamoplossing van 0,1% AgNO₃ . Voeg 100 µL van de stockoplossing van 0,1% AgNO₃ vervolgens in 100 mL ultrazuiver water om de werkoplossing.
   Opmerking: De AgNO₃ oplossing moet worden opgeslagen in het donker vóór gebruik.
2. De gel met 100 mL werkoplossing gedurende 1 uur op een roteerschudapparaat 50 rpm in een gesloten glazen container zilver impregneren. Het is van cruciaal belang voor het uitvoeren van de zilveren impregnering onder een zuurkast, beschermd tegen licht met aluminiumfolie.
3. Wassen van de gel met ultrazuiver water (ongeveer 100 mL) in een schone container voor 2 x 60 s.

4. Fluorogenic ontwikkeling van het Gel

1. Ter voorbereiding van de stockoplossing kleurstof (0.1 mM), in 50 mL ultrazuiver water met toevoegen van 3,0 mg van de kleurstof TPE-4TA . Bewerk ultrasone trillingen ten de oplossing voor een paar minuten en sommige NaOH-oplossing (bijvoorbeeld 1 M) om te helpen oplossen van de kleurstof toe te voegen.
2. Controleer de fluorescentie van de oplossing onder een 365 nm UV lamp om ervoor te zorgen dat de kleurstof molecule volledig is opgelost. Zwakke of nonemissive oplossingen geven alleen volledige ontbinding.
   Opmerking: De kleurstof die TPE-4TA werd gesynthetiseerd volgende het protocol onlangs gemeld door Xie et al. ¹⁰ de TPE-4TA oplossing is zeer stabiel en kan worden bewaard in het donker voor maanden.
3. Ter voorbereiding van 100 mL van de fluorogenic ontwikkelen oplossing (10 µM), voeg toe 10 mL van de stockoplossing van TPE-4TA in 90 mL ultrazuiver water. Controleer de pH van de oplossing met behulp van een pH-meter en het af te stemmen op 7-9 met behulp van een natriumhydroxide-oplossing (1 µM).
4. De gel overbrengen in een schone en afsluitbare container met 100 mL van de fluorogenic ontwikkelen oplossing. Zorg ervoor dat de gel is volledig ondergedompeld in de oplossing. Het verzegelen van de container. Van licht het deksel, en schud het 's nachts op een roteerschudapparaat 50 rpm bij kamertemperatuur. Als alternatief, de incubatie stap kan ook worden verkort tot ongeveer ~ 2 h door de voorverwarming van de oplossing AIE ontwikkelen tot 80 ° C voor vlekken en dan het verlaten bij kamertemperatuur.

5. destaining en beeldvorming

1. Breng de gel aan een schone container en het destain in 100 mL 10% ethanol voor 30 min.
   Opmerking: Alleen Water kan worden gebruikt om te wassen van de gel. Het is echter tijd efficiënter te gebruiken van een 10% ethanol-oplossing voor de destaining. Dit zal helpen te verminderen van het destaining proces van uur tot 30 min.
2. Spoel de gel in ultrazuiver water gedurende 5 minuten.
3. Het imago van de gel op de 365 nm-kanaal of 302 nm kanaal door een gel documentatie machine.

Resultaten

De eiwit bands gekleurd door de fluorescerende zilveren vlek vertonen een intens groene fluorescentie onder een 365 nm UV lamp. Alle 14 eiwit bands (10-200 kDa), waren van boven naar beneden, duidelijk zichtbaar, correleren goed met degene rood-gekleurde 14 gekleurd door de SYPRO Ruby kleurstof (Figuur 2)¹⁰.

Met betrekking tot de kwantitatieve eiwit de detectie, de gels zijn ...

Discussie

Hier is een nieuwe TL silver kleuring methode voor eiwitten in polyacrylamide gels. Deze strategie integreert conventionele zilveren vlekken en fluorescerende vlekken. De kleuring exploot de selectieve binding van zilveren ion aan eiwitten zoals in andere zilver vlekken maar maakt gebruik van een hooggevoelige fluorogenic silver sonde TPE-4TA aan het licht van de zilveren afhankelijke eiwitten. Aangezien de fluorogenic sonde TPE-4TA kan zin zilver-ionen in een vrij lage concentratie in d...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
LDS Sample Buffer (4X)	Thermo Fisher Scientific	NP0007	Reagens
4-12% Bis-Tris Protein Gels, 1.0 mm, 15-well	Thermo Fisher Scientific	NP0323BOX	Voorgevormd gel
Sample Reducing Agent (10X)	Thermo Fisher Scientific	NP0004	Reagens
MES SDS Running Buffer (20X)	Thermo Fisher Scientific	NP0002	Reagens
Mini Gel Tank	Thermo Fisher Scientific	A25977	Apparatuur
300W Power Supply (230 VAC)	Thermo Fisher Scientific	PS0301	Apparatuur
Unstained Protein Ladder	Thermo Fisher Scientific	26614	Staal
Silver nitrate	Sigma-Aldrich	31630-25G-R	Reagens
Ethanol	Bragg and co.	42520J	Reagens
Acetic acid	J.T. Baker	103201A	Reagens
Milli-Q Synthesis A10	Merk	-	Leverancier van 18,2 MΩ.cm water
gel documentation system (c600 model)	Azure biosystems	-	Apparatuur