Hier beschrijven we een gedetailleerd protocol waarin een nieuwe TL kleuring techniek voor de detectie van de totale proteïne in polyacrylamide gels. Het protocol maakt gebruik van een zilveren ion-specifieke fluorescentie turn-on sonde, die Ag+detecteert-eiwitcomplexen, en elimineert bepaalde beperkingen van traditionele chromogenic zilveren vlekken.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Fluorescerende zilveren kleuring van eiwitten in Polyacrylamide Gels
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Zilveren kleuring is een colorimetrische techniek op grote schaal gebruikt om te visualiseren van eiwitten bands in polyacrylamide gels na natrium dodecyl sulfaat-polyacrylamide gelelektroforese (SDS-pagina). De klassieke zilveren vlekken hebben bepaalde nadelen, zoals hoge achtergrond kleuring, slechte eiwit recovery, lage reproduceerbaarheid, een smalle lineaire dynamische bereik voor kwantificering en beperkte compatibiliteit met massaspectrometrie (MS). Nu, met het gebruik van een fluorogenic Ag+ sonde, TPE-4TA, ontwikkelde we een fluorescerende silver kleuring van de methode voor de totale eiwit visualisatie in polyacrylamide gels. Deze nieuwe vlek vermijdt de lastige zilveren vermindering stap in traditionele zilveren vlekken. Bovendien toont de fluorescerende zilveren vlek aan lineaire kwantificering detectie van eiwit, waardoor het een nuttige en praktische eiwit gel vlek, goede reproduceerbaarheid en gevoeligheid.
Inleiding
Vele kleuring methoden zijn gebruikt om te visualiseren van eiwitten na de Elektroforese van het gel, bijvoorbeeld met behulp van colorimetrische kleurstoffen zoals Coomassie briljant blauw, zilver vlek, fluorescentie, of radioactieve labeling van1,2, 3 , 4. Zilveren kleuring wordt beschouwd als een van de meest gevoelige technieken voor de detectie van de eiwitten die eenvoudige en goedkope reagentia. Het kan worden onderverdeeld in twee grote families: de ammoniumstikstof zilveren vlek en de zilvernitraat vlek5....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
1. voorbereiding van het Gel
Opmerking: De demonstratie volgt een standaardprotocol ter voorbereiding van het gel van kleuring kort na SDS-pagina12. Kortom, de volgende stappen beschrijven de voorbereiding van de monsters en gel elektroforese.
- SDS-pagina met 4% - 12% Bis-Tris eiwit gels (1 mm, 15-well) uitvoeren met behulp van een mini gel tank gevuld met 2-(N -morfolino) ethanesulfonic zuur (MES) buffer.
- Verdun de monsters met een mengsel van gedestilleerd water, lithium dodecyl sulfaat (LDS) buffer en een monster-reducerende agent.
- Laden van de eerste baan met dubbele van het ....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
De eiwit bands gekleurd door de fluorescerende zilveren vlek vertonen een intens groene fluorescentie onder een 365 nm UV lamp. Alle 14 eiwit bands (10-200 kDa), waren van boven naar beneden, duidelijk zichtbaar, correleren goed met degene rood-gekleurde 14 gekleurd door de SYPRO Ruby kleurstof (Figuur 2)10.
Met betrekking tot de kwantitatieve eiwit de detectie, de gels zijn .......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Hier is een nieuwe TL silver kleuring methode voor eiwitten in polyacrylamide gels. Deze strategie integreert conventionele zilveren vlekken en fluorescerende vlekken. De kleuring exploot de selectieve binding van zilveren ion aan eiwitten zoals in andere zilver vlekken maar maakt gebruik van een hooggevoelige fluorogenic silver sonde TPE-4TA aan het licht van de zilveren afhankelijke eiwitten. Aangezien de fluorogenic sonde TPE-4TA kan zin zilver-ionen in een vrij lage concentratie in d.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
Een octrooiaanvraag op deze TL zilveren kleuring is ingediend.
Dankbetuigingen
De auteurs bedank Patrick Chan in de Ming Wai Lau centrum voor herstellend geneeskunde, Karolinska Institutet, voor zijn technische ondersteuning. S. X. is dankbaar voor de steun van de Zweedse Onderzoeksraad (Grant No. 2017-06344).
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
LDS Sample Buffer (4X) | Thermo Fisher Scientific | NP0007 | Reagens |
4-12% Bis-Tris Protein Gels, 1.0 mm, 15-well | Thermo Fisher Scientific | NP0323BOX | Voorgevormd gel |
| Sample Reducing Agent (10X) | Thermo Fisher Scientific | NP0004 | Reagens |
| MES SDS Running Buffer (20X) | Thermo Fisher Scientific | NP0002 | Reagens |
| Mini Gel Tank | Thermo Fisher Scientific | A25977 | Apparatuur |
| 300W Power Supply (230 VAC) | Thermo Fisher Scientific | PS0301 | Apparatuur |
| Unstained Protein Ladder | Thermo Fisher Scientific | 26614 | Staal |
| Silver nitrate | Sigma-Aldrich | 31630-25G-R | Reagens |
| Ethanol | Bragg and co. | 42520J | Reagens |
| Acetic acid | J.T. Baker | 103201A | Reagens |
| Milli-Q Synthesis A10 | Merk | - | Leverancier van 18,2 MΩ.cm water |
| gel documentation system (c600 model) | Azure biosystems | - | Apparatuur |
Referenties
- Chevalier, F. Highlights on the capacities of "Gel-based" proteomics. Proteome Science. 8 (1), (2010).
- Harris, L. R., Churchward, M. A., Butt, R. H., Coorssen, J. R. Assessing detection methods for gel-based proteomic analyses. Journal of Proteome Research. 6 (4), 1418-1425 (2007).
- Gauci, V. J., Wright, E. P., Coor....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
