Methodenartikel

Met behulp van hoog gehalte Imaging om te kwantificeren Target Engagement in Adherente cellen

DOI:

10.3791/58670

⸱

29 november 2018

 ,  , 
1Chemical Biology Consortium Sweden, Science for Life Laboratory, Karolinska Institutet, Solna, 2Department of Medical Biochemistry and Biophysics, Karolinska Institutet, Solna, 3Science for Life Laboratory, Department of Oncology-Pathology, Karolinska Institutet, Stockholm

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Metingen van de drug target betrokkenheid staan centraal in effectieve Geneesmiddelenontwikkeling en chemische sonde validatie. Hier, detail we een protocol voor het meten van de drug-target engagement met behulp van hoge inhoud imaging in een microplate-compatibele adaptie van de cellulaire thermische shift test (CETSA).

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Quantitating van de interactie van kleine moleculen met hun beoogde eiwit-doelstelling is essentieel voor de Geneesmiddelenontwikkeling, doel validatie en chemische sonde validatie. Methodes die het meten van dit verschijnsel zonder wijziging van het eiwit doel of klein molecuul zijn bijzonder waardevol, hoewel technisch uitdagende. De cellulaire thermische shift test (CETSA) is een techniek om te controleren de betrokkenheid van de doelgroep in levende cellen. Hier beschrijven we een aanpassing van de originele CETSA-protocol, waarmee een hoge doorvoersnelheid metingen met behoud van subcellular localisatie op het niveau van één cel. Wij geloven dat dit protocol biedt belangrijke vorderingen op de toepassing van CETSA voor diepgaande karakterisering van samengestelde doelsoort interactie, met name in heterogene populaties van cellen.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bij het ontwikkelen van nieuwe geneesmiddelen of chemische sondes er absoluut voor het koppelen van de waargenomen farmacologisch effect of functionele uitlezing aan metingen van doel bezetting of engagement in levende cellen1,2,3. Deze gegevens zijn nodig om ervoor te zorgen dat de kleine molecule in feite haar gewenste doel bereikt, zowel voor het valideren van de biologische hypothese achter eiwit target selectie4,5. Bovendien, tijdens Geneesmiddelenontwikkeling, modelsystemen van toenemende complexiteit worden gebruikt om te selecteren en bevestigen van een voorsprong samengestelde voorafgaand aan klinische proeven. Om te bevestigen vertaling van biologie over deze preklinische systemen, zijn methoden voor het traceren van drug-target engagement en bijbehorende biologie in dit ontwikkelingsproces kritisch.

Drug-target engagement is van oudsher uitdagend om te controleren in levende cellen met unfunctionalized kleine moleculen en proteïnen, vooral op het niveau van de eencellige met ruimtelijke resolutie6,7. Een recente methode voor het waarnemen van de interactie tussen ongewijzigd drugs en eiwitten in levende cellen is de cellulaire thermische shift test (CETSA) waarin ligand-geïnduceerde stabilisatie van een natuurlijk eiwit in antwoord op de uitdaging van een warmte is gekwantificeerde8, 9,10. Dit wordt bereikt door het kwantificeren van de resterende oplosbaar eiwit na blootstelling aan een uitdaging van de warmte. In de eerste vermelding van CETSA, werd westelijke vlek gebruikt voor de detectie. Om te schakelen van screening campagnes en sloeg triaging van grotere samengestelde collecties, hebben inspanningen om de doorvoer van CETSA experimenten geleid tot de ontwikkeling van verschillende homogene, microplaat assays10,11. Echter, een beperking met deze methoden is dat zij momenteel het best voor samengestelde behandeling in cel suspensies geschikt zijn en de detectie lysis van de cel vereist, wat leidt tot verlies van ruimtelijke informatie. CETSA kan worden toegepast in experimenteel als een ligand-geïnduceerde verschuiving in thermische aggregatie temperatuur (Tagg) op een enkele concentratie van het kleine molecuul of het ligand nodig om te stabiliseren van het eiwit bij een interne temperatuur. De laatste heet isothermische dosis reactie vingerafdrukken (ITDRF) om aan te duiden van de afhankelijkheid van deze metingen op de specifieke experimentele omstandigheden.

Het doel van dit protocol is voor het meten van betrokkenheid van de doelgroep met behulp van CETSA in Adherente cellen door immunefluorescentie (IF) antistofdetectie met hoge-inhoud microscopie12. Deze procedure strekt zich uit van de oorspronkelijke CETSA platform te maken voor eencellige kwantificering van target engagement met behoud van subcellular localisatie. Met name, in tegenstelling tot vele eerdere verslagen in deze procedure samengestelde behandeling wordt uitgevoerd in levende Adherente cellen zonder oppervlakte detachement of wassen vóór de uitdaging van de warmte, dus het behoud van het evenwicht van de vastgestelde bindende willen we meten van13. Op dit moment de methode is gevalideerd voor één doel eiwit p38α (MAPK14) in verschillende cellijnen, en we hopen dat door het delen van deze procedure de techniek kan worden toegepast in grote lijnen op de smeltende Proteoom. Wij verwachten dat dit protocol kan worden aangepast in de drug ontwikkeling pijpleiding van screening, hit triaging via toezicht op target engagement in vivo.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. het zaaien van de cellen

Opmerking: Zie afbeelding 1voor een algemeen overzicht van de werkstroom. Een gedetailleerde lijst van materialen en reagentia zijn beschikbaar in de Tabel van materialen.

  1. Vóór het zaaien van de cellen, boorgaten met een standaard boor in het kader van zwarte 384-well imaging assay platen om luchtbellen wordt gevangen onder de plaat later tijdens de stap van de verwarming. Om te voorkomen dat plastic deeltjes invoeren van de putten tijdens deze stap en te handhaven van de steriele condities, verzegelen van de platen met een zelfklevende aluminiumfolie of de afdekplaat vóór het boren in de kap van een weefselkweek. Meestal volstaan met 3 gaten met een diameter van 3,5 mm op elk van de kant van de plaat (korte zijde).
  2. Bereid een laminaire flow-bench door reiniging met 70% ethanol. Na standaard aseptische weefselkweek technieken, media uit cel kolf of afwasmiddel te verwijderen. Wassen van cellen met 5-10 mL-fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) en voeg vervolgens 2 mL trypsine in de kolf. Incubeer de kolf bij 37 ° C, totdat de A-431 cellen los. Cellen tellen hetzij met behulp van een haemocytometer of cel teller. Bereid een celsuspensie van 50.000 cellen/mL in een cultuurmedium.
  3. Afzien 40 µL celsuspensie (het geven van een definitieve celdichtheid van 2.000 cellen per putje) in elk putje van de plaat van een bepaling met behulp van een bulk reagens dispenser of een meerkanaals Pipetteer, afhankelijk van de omvang van het experiment. Kort gaan de plaat van links-naar-rechts verspreiden van cellen gelijkmatig over de bodem van de plaat.
  4. U wilt minimaliseren plaat-randeffecten, de cellen te vestigen op de onderkant van de plaat assay gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur in de achterkant van de kap laminaire flow toestaan. De plaat dan in een plastic container met vochtig keukenpapier om ervoor te zorgen een vochtige atmosfeer te plaatsen. Vóór gebruik, veeg de plastic container met 70% ethanol.
  5. Incubeer de doos met de plaat assay voor 2-3 dagen bij 37 ° C en 5% CO2 in een conventionele bevochtigde incubator. Monitor confluentie van de cellen tot 50-75%, zoals beoordeeld door visuele inspectie met een lichte Microscoop.

2. samengestelde behandeling

  1. Op de dag van het experiment, gecombineerd het medium van elk goed met een plaat wasmachine. Plaats de plaat op de plaat wasmachine en selecteer het programma dat streven. Als een plaat wasmachine niet beschikbaar is, kan dan de vloeistof worden verwijderd door het omkeren van de plaat met een snelle hand twist over een afval lade of een wastafel. Volledige verwijdering van de vloeistof is essentieel voor goede prestaties. Eventuele overtollige vocht wordt vervolgens verwijderd door te deppen met keukenpapier.
  2. Voeg 30 µL van verbindingen verdund tot de geëigende concentratie in cel kweekmedium met behulp van geautomatiseerde verstrekking of een meerkanaalspipet afhankelijk van de omvang van het experiment. Zorgen om toe te voegen een negatieve (DMSO) en de positieve (bekende ligand) controle aan diverse putjes op elke plaat assay. Aangezien dit een thermische shift test is, is het noodzakelijk dat de samengestelde concentratie overschrijdt de dissociatieconstante om te zien hoe de stabilisatie van het eiwit. Dus een ruwe leidraad voor samengestelde concentratie is 50 - 100 keer de IC50, maar meer detail beschrijvingen voor samengestelde concentraties zijn te vinden in de sectie discussie.
    Opmerking: DMSO verdraagbaarheid van de cellijnen moet voor het experiment worden getest.
  3. Zegel de compound-behandelde assay-plaat met een ademende plaat zegel en Incubeer bij 37 ° C en 5% CO2 in een bevochtigde incubator gedurende 30 minuten.

3. warmte uitdaging

  1. Stel eerst het waterbad tot de gewenste temperatuur. Merk op dat de definitieve temperatuur die wordt bereikt binnen de putjes van de plaat assay van de eindtemperatuur in het waterbad afwijken kan. De offset vooraf onderzoeken met een dummy plaat en thermokoppel thermometer. Meestal duurt het 30 minuten voor het bad te stabiliseren op de gewenste temperatuur.
  2. Voorbereiden om te controleren dat de gewenste temperatuur is bereikt in de putjes van de plaat assay tijdens de stap van Verwarming, een onverharde dummy plaat met hetzelfde volume van medium als de assay-plaat.
  3. Verwijder de assay platen uit de incubator. Het ademende zegel opstijgen en opnieuw verzegelen de assay plaat met de compound-behandelde cellen met een strakke zelfklevende aluminiumfolie om ervoor te zorgen dat geen water in de putjes zal lek tijdens de daaropvolgende Verwarming in het waterbad. Ervoor zorgen dat de geboorde gaten in de plaat frame toegankelijk zijn.
  4. Plaats de assay-plaat en de dummy plaat in het waterbad met de onderkant van de plaat schuin naar het wateroppervlak te dwingen alle resterende lucht uit onder de platen.
  5. Controleer de temperatuur in de putten van een nieuwe dummy plaat met behulp van een thermokoppel thermometer.
  6. De plaat van de bepaling in het waterbad gedurende 3 minuten verwarmen. De assay en dummy plaat onmiddellijk overbrengen naar een ander waterbad met kamer-tempered water gedurende 5 minuten afkoelen. De assay plaat is nu klaar voor verdere verwerking.

4. fixatie

  1. 10 µL 16% (m/v) paraformaldehyde (PFA) rechtstreeks naar de plaat van de bepaling met behulp van een bulk reagens dispenser of een meerkanaals Pipetteer afzien. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 20 minuten.
    Opmerking: Sommige fixatives zijn ingedeeld als kankerverwekkend en institutionele veiligheidsvoorschriften moeten worden gevolgd.
  2. De PFA-oplossing gecombineerd en spoel de cellen met 300 µL PBS met behulp van een plaat-wasmachine. Plaats de plaat op de plaat wasmachine en selecteer het programma dat streven.
    Opmerking: Deze procedure is geoptimaliseerd met behulp van een overloop-protocol op de plaat wasmachine waarin vloeistof wordt tegelijkertijd afgezien en verwijderd. Als een plaat wasmachine of soortgelijke procedure niet beschikbaar is, kan de wassen stap ook handmatig worden gedaan.
  3. Handmatig wassen procedure: Verwijder de vloeistof uit de putten door het omkeren van de plaat met een snelle hand twist over een afval lade of een wastafel. Volledige verwijdering van de vloeistof is essentieel voor goede prestaties. Voeg 80 µL van PBS met een meerkanaalspipet en omkeren van de plaat weer zoals hierboven beschreven, herhaalt u de procedure wassen twee keer. Na de laatste wash, DEP de plaat tegen schone papieren handdoeken te verwijderen van de overtollige vloeistof.

5. permeabilization

  1. Voeg 20 µL van 0,1% (v/v) NP-40 de putjes met een multichannel Pipetteer en Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten. Wassen van de cellen met dezelfde procedure als hierboven (stap 4.2) beschreven.
  2. Als alternatief, indien nodig, een antigeen ophalen protocol, bijvoorbeeldtoepassen:
    1. Voeg 20 µL van 1% SDS de putjes met een multichannel Pipetteer. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 5 minuten en wassen volgens dezelfde procedure (stap 4.2) bovenstaande.
    2. Voeg 80 μL van 10 mM glycine bij pH 7,2 en incubeer gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur. Gecombineerd de glycine-oplossing met behulp van een plaat wasmachine door te plaatsen op de plaat wasmachine en de aspiratie-protocol te selecteren. Zie notities in 2.1 en 4.2 als een plaat wasmachine niet beschikbaar is.

6. blokkeren

  1. Voeg 15 µL van 1% (m/v) bovien serumalbumine (BSA) in PBS de putjes met behulp van een bulk reagens dispenser of een meerkanaals Pipetteer. Incubeer de plaat bij kamertemperatuur gedurende 1 uur, of 's nachts bij 4 ° C met een aluminiumfolie plaat zegel.

7. primair antilichaam

  1. Gecombineerd de blokkerende oplossing om met een plaat wasmachine door te plaatsen op de plaat wasmachine en de aspiratie-protocol te selecteren. Zie notities in 2.1 en 4.2 als een plaat wasmachine niet beschikbaar is.
  2. Voeg 10 µL van primair antilichaam verdund dienovereenkomstig in 1% (m/v) BSA in PBS de putjes met behulp van een meerkanaals Pipetteer. Incubeer de plaat bij kamertemperatuur gedurende 1 uur, of 's nachts bij 4 ° C met een aluminiumfolie plaat zegel.

8. secundair antilichaam

  1. Het primaire antilichaam-oplossing gecombineerd en was de putjes goed volgens dezelfde procedure als hierboven (stap 4.2) beschreven.
  2. Voeg 10 µL van secundair antilichaam Alexa 488 verdund dienovereenkomstig in 1% (m/v) BSA in PBS. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 1 uur. Het zegel van de plaat met een zelfklevende aluminiumfolie afdichting te beschermen tegen licht.
    Opmerking: Bescherming van de plaat boven licht tijdens deze en de volgende stappen.

9. nucleaire kleuring en cel masker

  1. Voeg 10 µL van nucleaire kleurstof verdund tot 0,05 mg/mL in PBS de putjes met behulp van een meerkanaals Pipetteer. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten extra.
  2. Het secundaire antilichaam en Hoechst oplossing gecombineerd en was de putjes goed gebruik van dezelfde procedure als hierboven (stap 4.2) beschreven.
  3. Voeg 10 µL van cel masker verdund tot 200 ng/mL in PBS de putjes met behulp van een meerkanaals Pipetteer. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten.
  4. De cel masker oplossing gecombineerd en was de putjes goed gebruik van dezelfde procedure als hierboven (stap 4.2) beschreven.
  5. Afzien van 60 µL van PBS aan alle putjes met behulp van de plaat wasmachine, een bulk reagens dispenser of een meerkanaals Pipetteer, en verzegel de platen met een zelfklevende aluminiumfolie.

10. het beeld van verwerving en analyse

  1. Vastleggen van beelden op een hoge inhoud imager met behulp van 3 TL kanalen: DAPI (387/447), GFP (472/520) en TexasRed (562/624). 4 beelden per putje 10 X streven naar betere coördinatie te verwerven. Gebruik van geautomatiseerde laser autofocus en breng 2 weggooien tijdens overname. Afbeeldingen opslaan als TIFF-bestanden van de 16-bits, grijze schaal samen met metadata.
  2. Analyseren van beelden met behulp van beschikbare software. Identificeren celbegrenzing met behulp van een algoritme cel scoren met DAPI (nucleus) en TexasRed (cytoplasma).
  3. Uittreksel gemiddelde intensiteit voor alle verworven golflengten voor verdere gegevensanalyse.
  4. Berekenen van de Z-factor om ervoor te zorgen de robuustheid van de bepaling.
  5. % Stabilisatie met de volgende formule berekenen: 100 * (1-(goed intensiteit – gemiddelde goed intensiteit negatieve controle) / (gemiddelde intensiteit positieve controle-gemiddelde intensiteit negatieve controle)). Hier negatieve controle wordt DMSO en positieve controle is de referentiestof. Aangezien de maximale stabilisatie tussen verbindingen kan variëren en in feite groter zijn dan de positieve controle voor ITDRF curven, worden de maximale en minimale stabilisatie intensiteiten voor elke verbinding soms gebruikt in plaats van de intensiteitswaarden van de controle-putten .

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het protocol dat is uiteengezet in Figuur 1 beschrijft de fundamentele workflow voor het uitvoeren van CETSA assays op Adherente cellen met opsporing van resterende oplosbaar eiwit door hoge inhoud imaging. Deze werkstroom kan gemakkelijk aan te passen op alle stadia van de ontwikkeling van de bepaling worden door aanpassing van de indeling van de plaat van de verbindingen of reagentia14. We detail verwachte resultaten voor verschillen...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zoals besproken in het gedeelte ' resultaten ', zijn er verschillende belangrijke stappen voor de procedure. Ten eerste is het belangrijk om te identificeren op een kwalitatief hoogwaardige affiniteit reagens. Het is raadzaam om de screening een kleine bibliotheek met antilichamen voor elke gewenste doelgroep. Nadat een primair antilichaam is geselecteerd, is het ook belangrijk voor het valideren van het systeem voor een aantal verschillende bandplaatsen van de eiwit-doelstelling, indien van toepassing. Contra screening ...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben geen onthullingen aan verslag.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs erkennen infrastructuurondersteuning van wetenschap voor leven laboratorium en Karolinska Institutet. De auteurs erkennen ook input en discussies met Michaela Vallin, Magdalena Otrocka en Thomas Lundbäck.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS)Medicago09-9400-100
TrypLE ExpressThermoFisher Scientific12604013voor het losmaken van cellen en subculture
16% paraformaldehyde (PFA)ThermoFisher Scientific28908fixeermiddel
Geit anti-konijn IgG (H+L), Alexa Fluor 488 geconjugeerd antilichaamThermoFisher ScientificA11008secundair antilichaam
HCS CellMask Red-kleuringThermoFisher ScientificH32712Cytoplasma-kleuring
NP-40Sigma-Aldrich56741voor permeabilisatie
Hoechst-kleuring 33342Sigma-AldrichB2261nucleaire kleuring
Dulbecco’s gemodificeerd Eagle’s medium (DMEM) - hoge glucoseSigma-Aldrich6429celkweekmediumcomponent
Hitte-geïnactiveerd foetaal bovien serum (FBS)Sigma-AldrichF9665celkweekmediumcomponent
Penicilline-StreptomycineSigma-AldrichP4333celkweekmediumcomponent
Corning, adembare plaatsealSigma-AldrichCLS3345voor de compound-incubatiestap
Konijn anti-p38 antilichaam [E229]Abcamab170099primair antilichaam, LOT:GR305364-16
Falcon, zwarte 384-well heldere bodem beeldplatenVWR736-2044beeldplaten
Greiner, 384-well laagvolume polypropyleen platenVWR784201
Plakbare aluminium sealVWR30127790
Afneembare aluminium sealAgilent24210-001voor PlateLoc
LY2228820SelleckchemS1494p38α-remmer
PH797804SelleckchemPH797804p38α-remmer
BIRB796SelleckchemS1574p38α-remmer
SB203580Tocris1202p38α-remmer
AMG 548Tocris3920p38α-remmer
RWJ 67657Tocris2999p38α-remmer
L-SkepinoneCBCS compound collectiep38α-remmer
Rund serum albumine (BSA)Sigma-AldrichA7030blokkeermiddel
SDS (natriumdodecylsulfaat)BDH44244gebruikt in antigeenretrieval
GlycineSigma-AldrichG8898gebruikt in antigeenretrieval
A-431 cellenATCCATC-CRL-1555
Echo 550LabcyteVoor de voorbereiding van compound platen
PlaatsealerAgilentPlateLoc
Bulk reagent dispenserThermo Scientific5840300Multidrop Combi
Automatische vloeistofbehandelingAgilentBravo vloeistofbehandeling platform; gebruikt voor de voorbereiding van compound platen
PlaatwasserTecanHydrospeed
WaterbadJulaboTW12
ThermokoppelVWRThermokoppel traceerbare lab thermometer
Hoge inhoud imagerMolecular DevicesImageXpress Micro XLS Widefield High-Content Analysis System

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Morgan, P., et al. Impact of a five-dimensional framework on R&D productivity at AstraZeneca. Nature Reviews Drug Discovery. 17 (3), 167-181 (2018).
  2. Freedman, L. P., Cockburn, I. M., Simcoe, T. S. The Economics of Reproducibility in Preclinical Research. PLOS Biology. 13 (6), e1002165(2015).
  3. Waring, M. J., et al. An analysis of the attrition of drug candidates from four major pharmaceutical companies. Nature Reviews Drug Discovery. 14 (7), 475-486 (2015).
  4. Morgan, P., et al. Can the flow of medicines be improved? Fundamental pharmacokinetic and pharmacological principles toward improving Phase II survival. Drug Discovery Today. 17 (9), 419-424 (2012).
  5. Bunnage, M. E., Chekler, E. L. P., Jones, L. H. Target validation using chemical probes. Nature Chemical Biology. 9 (4), 195-199 (2013).
  6. Schürmann, M., Janning, P., Ziegler, S., Waldmann, H. Small-Molecule Target Engagement in Cells. Cell Chemical Biology. 23 (4), 435-441 (2016).
  7. Robers, M. B., et al. Target engagement and drug residence time can be observed in living cells with BRET. Nature Communications. 6, 10091(2015).
  8. Martinez Molina, D., et al. Monitoring drug target engagement in cells and tissues using the cellular thermal shift assay. Science. 341 (6141), 84-87 (2013).
  9. Martinez Molina, D., Nordlund, P. The Cellular Thermal Shift Assay: A Novel Biophysical Assay for In situ Drug Target Engagement and Mechanistic Biomarker Studies. Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 56, 141-161 (2016).
  10. Jafari, R., et al. The cellular thermal shift assay for evaluating drug target interactions in cells. Nature Protocols. 9 (9), 2100-2122 (2014).
  11. Almqvist, H., et al. CETSA screening identifies known and novel thymidylate synthase inhibitors and slow intracellular activation of 5-fluorouracil. Nature Communications. 7, 11040(2016).
  12. Axelsson, H., et al. In situ Target Engagement Studies in Adherent Cells. ACS Chemical Biology. 13 (4), 942-950 (2018).
  13. Seashore-Ludlow, B., Perspective Lundbäck, T. E. arly Microplate Application of the Cellular Thermal Shift Assay (CETSA). Journal of Biomolecular Screening. 21 (10), 1019-1033 (2016).
  14. Axelsson, H., Almqvist, H., Seashore-Ludlow, B., Lundback, T. Assay Guidance Manual [Internet]. Sittampalam, G. S., et al. , Eli Lilly & Company and the National Center for Advancing Translational Sciences. Bethesda (MD). (2016).
  15. Mateus, A., et al. Prediction of intracellular exposure bridges the gap between target- and cell-based drug discovery. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (30), E6231-E6239 (2017).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Cellular Thermal Shift AssayCompound Target InteractionSubcellular LocalizationIsothermal Dose ResponseThermal Aggregation CurveAntibody RecognitionPlate Washer

Gerelateerde artikelen