Isolatie van muizen epidermale keratinocyten en hun in vitro Clonogene cultuur

Samenvatting

Het doel van dit protocol is het isoleren van epidermale keratinocyten uit de rughuid van volwassen muizen voor een verscheidenheid aan downstreamtoepassingen zoals moleculaire biologie, biochemie, fluorescentie geactiveerde celsortering en primair in vitro gebruik (bijv. clonogene keratinocyten).

Samenvatting

Het hier beschreven protocol is een betrouwbare methode voor het oogsten van primaire keratinocyten van volwassen vrouwelijke muizen (54 ± 2 dagen oud) die ongeveer 30 x 10⁶ levensvatbare cellen per muis opleveren. Primaire volwassen muis keratinocyten worden geoogst uit de rughuid van vrouwelijke muizen. Mannelijke muizen (~ 6 weken oud) kunnen worden gebruikt voor het oogsten van in afhankelijk van de vereisten van het experiment. Geëmitteerde muizen zijn geschoren en gesteriliseerd met seriële wassen in Povidon jodium-en ethanol oplossingen (70% alcohol). Na het desinfecteren van de muizen wordt de rughuid verwijderd en wordt het onderhuidse vet en spier verwijderd met een scalpel en weggegooid. De huiden worden in kleine stukjes gesneden en behandeld met een milde, lage temperatuur trypsinisatie om de onderste dermis van de epidermis los te maken. De geschraapt epidermises worden bij lage snelheid geroerd, gefilterd om de haren te verwijderen, geteld en opnieuw opgehangen in kweekmedium. Deze methode biedt een uitstekende eencellige opschorting van zeer culturable cellen voor veel downstream toepassingen.

Inleiding

De zoogdier huid bedekt het hele lichaam en bedient een veelheid aan functies (bijv. een primaire fysieke barrière, temperatuurregeling en vochtretentie). In de afgelopen vijf decennia heeft fundamenteel onderzoek naar de muis huid nieuwe informatie opgeleverd over de structuur en functie van de huid. De muis Skin model heeft sterk geholpen begrip van de basis biologie achter de complexe moleculaire mechanismen van chemische of ultraviolette straling geïnduceerde carcinogenese. Deze muizen huid modellen leveren een belangrijke bijdrage aan het begrip van menselijke huidziekten en hun mitigatie. Om verdere moleculaire dissectie van de primaire keratinocyten in haarfollikel ontwikkelingsbiologie, stamcelonderzoek, carcinogenese en genetische exploratie van de epidermis te verkennen, is het vaak wenselijk om primaire epitheel te isoleren en te cultuur keratinocyten van muizen huid te gebruiken in parallel met in vivo experimenten. De motiverende factor bij de ontwikkeling van deze methode was de noodzaak van een in vitro assay voor clonogene epidermale en haarfollikel stamcellen^1,2. Er was ook een dringende behoefte aan enkele cel suspensies van epidermale cellen geschikt voor clonogene assays³, fluorescentie geactiveerde celsortering, en flow flowcytometrieonderzoeken^3,4. De voordelen van deze methode zijn een robuuste oogst verhoging van een orde van grootte over andere methoden^5,6, opname van het epitheel gedeelte van de haarzakjes, en de hoge culturabiliteit van de geoogste cellen. In de jaren tachtig waren er geen bekende methodes die aan deze eisen konden voldoen. In de daaropvolgende jaren werd deze methode verfijnd om de celopbrengst te verhogen. De belangrijkste beperking van deze methode is het maskeren van sommige trypsine-gevoelige antilichamen die immunoreactivity⁶in gevaar zouden brengen.

De muizen kregen de veehouderij volgens de specifieke pathogeen vrije richtlijnen. Een tot vijf vrouwelijke muizen 54 ± 2 dagen oud werden verkregen. Bij oudere muizen zal de levensvatbaarheid van keratinocyten worden verlaagd als gevolg van de anagene fase (groei) van de haar cyclus. Ook is het proces van trypsinoisatie moeilijker in vergelijking met jonge muizen. De oogst procedure is met succes geoptimaliseerd voor de dunnere huid van vrouwelijke muizen in vergelijking met mannen. Mannelijke muizen worden over het algemeen niet gebruikt voor keratinocyten oogsten omdat ze de neiging hebben om met elkaar te vechten tijdens huisvesting en daarom krassen of wonden op de huid kunnen achterlaten.

Protocol

Alle protocollen voor het gebruik van gewervelde dieren zijn goedgekeurd door de Universiteit van Minnesota institutioneel Dierenzorg-en gebruiks Comité in overeenstemming met aanbevolen NIH en overheidsrichtlijnen.

1. initialisatie van de feederlaag en Subculturing

1. Ontdooi één celflacon met bevroren Zwitserse muis 3T3 uit de vloeibare stikstof tank door de injectieflacon in een waterbad van 37 °C te plaatsen voor 1-2 min. Het aantal cellen in de injectieflacon is ongeveer 1 x 10⁶.
2. Verwijder de 3T3 celflacon wanneer de laatste strook ijs gesmolten is. Veeg de tube schoon met een 70% alcoholdoekje. Breng vervolgens de injectieflacon over naar een bioveiligheidskast.
3. Breng de cellen langzaam over in een T-150 kolf en spoel de 3T3-injectieflacon af met 1 mL CGM-medium. Voeg langzaam 30 mL pre-warmed 3T3 complete Growth medium (CGM) toe aan de cellen. Draai de kolf zachtjes om de 3T3 fibroblast cellen gelijkmatig te verdelen. Label de kolf met de details van de cellijn, de datum en het passage nummer op de juiste manier.
4. Inincuberen de cellen bij 37 °C met 5% CO₂ en 95% vochtigheid.
   Opmerking: Volgens de ATCC is de verdubbelingstijd van de Zwitserse muis 3T3 18 uur; Wanneer Confluent Health (contact geremd), de dichtheid is ongeveer 40.000 cellen per cm². We gebruiken een bepaalde lijn van 3T3 binnen 10-15 passages na initialisatie. Een snellere groei of de aanwezigheid van spindel vormige cellen kan bij hogere passages voorkomen en is meestal een teken dat de 3T3 niet zo goed zal presteren als feedercellen voor volwassen muis keratinocyten. Als een snelle groei optreedt, is het beter om een nieuwe lijn te initiëren vanuit de onderste passage cellen.
5. Verander media na 24 h om dode cellen te verwijderen en de resterende DMSO (cryopreservation agent), en twee keer per week daarna. Laat cellen vermenigvuldigen rond 80% samenloop en gebruik T-150 kolven voor cultuur initiatie. Gebruik T-225 kolven voor subcultuur na initialisatie.
6. Voor de subcultuur van 3T3 fibroblast cellen, verwijder de kolf uit de celkweek incubator en was tweemaal met koude steriele PBS (1x) met gentamycine. Pipet 10 mL voorverwarmde (37 °C waterbad) trypsine oplossing (0,25%) in elke T-225 kolf.
   1. Plaats de kolf op een verwarmende plaat voor 3-8 min. Verwijder de kolf en gebruik voorzichtig palmen om de wanden van de kolf te tikken om cellen los te maken en cel loslating onder omgekeerde Microscoop te bevestigen. Trypsine-oplossing kan troebel lijken met vrijstaande 3T3-cellen.
7. Pipet de trypsine-oplossing 3 – 4x om het celgroei oppervlak van de kolf te wassen en breng de trypsinized Cell over naar 30 mL CGM in een conische buis van 50 mL. Rewash de kolf 3 – 5x met 10 mL van het CGM-trypsine-celmengsel uit de conische buis van 50 mL.
   Opmerking: De inhoud van twee kolf inhoud kan worden toegevoegd aan een buis van 50 mL; Als slechts één kolf wordt gebruikt, plaats dan 10 mL trypsine/cellen in 20 mL CGM in een tube van 50 mL.
8. Centrifugeer de conische buis van 50 mL bij 160 x g gedurende 7 minuten bij 4 °c.
9. Zuig nu de supernatant op en hervat de celpellet met 5 mL CGM, Pipetteer zachtjes ~ 10x om de celpellet volledig te verstoren. Voeg 10 mL CGM toe om het totale volume van de conische buis van 50 mL te brengen tot 15 mL.
   1. Meng opnieuw ~ 10x en plaats 5 mL van de celsuspensie in 3 afzonderlijke T-150 kolven. De subcultuurverhouding is 1:3 in T-225 kolven of 1:4 in T-150 kolven. Voeg 30 mL voorverwarmde 3T3 CGM toe aan elk van de kolven.
10. Label de kolf met de naam van de cellijn, de datum van de celseeding en het passage nummer.
11. Om 3T3 cellen na centrifugeren in de subcultuurstap te bevriezen, verwijdert u de 50 mL buis uit de centrifuge en plaats deze op een ijsemmer. Zuig het supernatant op en hervat de celpellet met 1 mL van 5% DMSO-DMEM-mengsel (Zie tabel 1) voor elke geoogste kolf.
12. Plaats 1 mL DMSO-DMEM mengsel met celsuspensie in elke cryoflacon (één cryovial per 3T3-kolf geoogst). Label de injectieflacon met het passage nummer, de naam van de cellijn (3T3) en de datum waarop de cellen zijn bevroren.
13. Plaats deze 3T3 cel flesjes in de cel vriezer jar (Zie tabel van de materialen) en transfer naar-70 °c vriezer voor > 5 h. voorzichtig Verwijder en breng de flesjes van de cel vriezer jar en plaats in een vloeibare stikstof opslagtank voor lange termijn opslag tot het volgende gebruik . Voer informatie in over de naam van de cellijn, de locatie in de tank en de datum in het inventaris blad van vloeibaar stikstof laboratorium.

2. bereiding van de 3T3 feeder Layer voor röntgenstraling en seeding

1. Bereid 3T3 cellen een week voor hun bestraling en laat ze groeien ~ 100% samenvloeiing. De 3T3 cellen zijn meestal binnen de passages van 120 aan 130.
2. Voor succesvolle clonogene assays van primaire keratinocyten, voor het zaaien van 3T3 cellen, oppervlaktecoating de 60 mm Petri schaaltjes met een collageen.
   1. Pipet teer ongeveer 2 – 3 mL van de collageen-coating oplossing in 60 mm Petri schalen om het bodemoppervlak te omhulen en verwijder de overtollige collageen coating vloeistof (Zie tabel 1). Breng de Petri schaaltjes over naar een incubator van 37 °C met 5% CO₂ voor minimaal 1 uur. Laat de gerechten niet drogen in de incubator.
3. Röntgenstraling stap: Volg de stappen 1.4 – 1.6. Gebruik 50 mL verse CGM om de celpellet opnieuw op te schorten, de conische buis en afdichting te sluiten met paraffineafdichtingfilm. Om besmetting te voorkomen, gebruikt u plastic zakken om de met paraffine verzegelde cel met buis en plaats op ijs te verdubbelen. Een mitomycine gebaseerde alternatieve feeder Layer kan worden gebruikt voor in Culture⁷.
4. Bestraalde fibroblast 3T3 cellen in de conische buis van 50 mL met een 5.000 rads (50 Cgy) dosis met een biologische Röntgen machine. Bestraleren deze cellen samen met de CGM-media.
   1. Na röntgenstraling, centrifugeer cellen bij 160 X g gedurende 7 minuten bij 4 °c. Aspireren de supernatant media en voorzichtig regende celpellet met 5 mL CGM triturating zachtjes ~ 10x. Breng nu het uiteindelijke volume naar 30 ml met extra 25 ml medium en wrijf 10x. Deze triturerende stappen zijn cruciaal voor uniforme 3T3 fibroblast laag voor clonogenicity assay.
5. Levensvatbare Celtelling: Tel de keratinocyten met behulp van een gewone glas hemocytometer. Neem ongeveer 0,5 mL van de cellen en plaats in een buis van 1,5 mL. Verwijder 200 μL celmengsel en voeg een gelijk volume van 0,4% Trypaan blauwe oplossing en mengsel 3 – 4x toe. Cellen overbrengen met een hemocytometer en tellen alle nucleated cellen (kleine goud en roze cellen) als levensvatbare cellen. Bereken de uiteindelijke concentratie van levensvatbare goud cellen.
6. Pipetteer 1 x 10⁶ 3T3 cellen (een minimum van 7 x 10⁵) cellen mogen worden gebruikt) in 60 mm met collageen beklede Petri schalen (stap 2,2) en voeg voorzichtig 4 ml gemodificeerde High-calcium Williams E-media toe (Zie tabel 1). Laat vers geplaatste 3T3-cellen voor 24 uur bevestigen. Op de volgende dag, oogst de verse primaire in en zaai ze bovenop de bijgevoegde 3T3 fibroblast laag voor clonogene assay zoals hieronder aangegeven.

3. primaire Keratinocyte oogsten en zaaien

1. Euthanitering van vier tot vijf volwassen vrouwelijke muizen via CO₂ inademing volgens erkende dieren faciliteit/IACUC normen. Dit protocol kan echter ook worden gebruikt voor alleenstaande vrouwelijke/mannelijke muizen.
   1. Klem ongeveer 9 cm² van de rugvacht met een elektrische dieren klipper en plaats alle geknipte muizen in een pot van 500 ml met voldoende Povidon jodium antiseptische oplossing (niet schrobben) om ze te bedekken voor 1 – 2 min. schud de pot goed om de antiseptische laag gelijkmatig te oplossing over de muizen.
   2. Giet de oplossing af en spoel met schoon water totdat de vloeistof helder loopt. Herhaal dezelfde antiseptische wassing gevolgd door een waterspoeling. Na de antiseptische wassen met jodiumoplossing, weken alle muizen in 70% ethanol voor 5 – 10 min.
      Opmerking: Muizen met een lichte vacht (bijv. BALB/c) behouden een lichte geelachtige kleur van de antiseptische jodium wassen, terwijl donkerdere muizen (bijv. C57BL/6) dat niet zullen doen. Met name, cel levensvatbaarheid of cultuur groei wordt niet beïnvloed als gevolg van de gele kleur.
2. Verwijder voorzichtig de geknipte rughuid met behulp van een duim Tang en een schaar in een laminaire stroom afzuigkap. Plaats de bekrachtigd rughuid in conische buis gevuld met PBS/2x gentamycine. Vermijd het gebruik van de ventrale kant huid om de besmetting van de borst cellen in de cultuur te voorkomen.
3. Met behulp van geautoclaveerd Tang en een scalpel, plaats een rughuid in een tijd harige kant naar beneden op een dun Petri schaaltje. Begin met het schrapen van alle subcutane weefsels, inclusief vet van de ventrale zijde van het huid weefsel, totdat het halfdoorzichtig is. Probeer maximale sporen van subcutaan weefsel te verwijderen zonder de huid te scheuren (haarfollikel deel). Ook, niet Schaaf voor een lange tijd en Vermijd het drogen van de huid.
   1. Houd de huid van de geschraapt in PBS-oplossing totdat alle overige skins zijn verwerkt. Gebruik een scalpel om skins in 0,5 cm x 1 – 1.5 cm strips te snijden en de harige kant op een steriel Petri schaaltje te plaatsen.
4. Pipetteer voorzichtig 20 mL PBS/2x Gentamicin-oplossing vermengd met trypsine (0,25%) in een plastic Petri schaaltje van 100 mm x 20 mm. Gebruik steriele Tang, breng de skins over en drijf ze met de harige kant naar boven op het oppervlak van trypsine-oplossing voor 2 uur in een incubator van 32 °C.
   Opmerking: trypsinisatie tijd en temperatuur zijn cruciaal voor een goede opbrengst van zeer culturable primaire keratinocyten. Hoewel andere methoden goede opbrengsten van levensvatbare cellen kunnen bieden, is de culturabiliteit van de keratinocyten minder bevredigend.
   1. Tijdens deze incubatietijd van 2 uur worden de gerechten met collageen coating en op 37 °C gedurende 1 uur (zie stap 3.1.2) aangebracht. Voor clonogene assays zijn de 60 mm Petri schalen al 24 uur gecoat voorafgaand aan het oogsten van in, zodat de bestraalde 3T3 feederlaag aan de onderkant wordt bevestigd en gelijkmatig wordt verdeeld.
      Opmerking: Coating van cultuur gerechten voor clonogene cultuur is zeer belangrijk voor de juiste hechting, kolonie vorming, en de uiteindelijke groei/proliferatie van muizen epidermale keratinocyten.
5. Epidermale schrapings stap: regel een steriele plastic vierkante Petri schaal en creëer een oppervlak op een helling van 30 ° voor een goede epidermale schrapen met 15 mL oogst medium (zie tabel 1). Verwijder voorzichtig een zwevende huid strook uit de trypsine-oplossing met gebogen Tang. Met een nieuw scalpel blad schrait u de epidermis en haren in het medium.
   1. Gebruik geen overmatige kracht, maar gebruik voldoende kracht om de epidermis te schraken, of het zal de levensvatbaarheid van de cel beïnvloeden.
   2. Houd tijdens het schrapen van de epidermis het blad loodrecht op het huid stuk. Als het mes naar de beweging van het blad wordt gekanteld, is er meer kans op scheuren in de huid. Als het blad is schuin verwijderd van de blade beweging, er zijn meer kans op onvoldoende epidermis verwijdering.
6. Giet voorzichtig het oogst medium met geschuurd epidermale cellen in een steriele 60 mL pot (autoclaveerbaar en herbruikbaar) met een 1,5 inch magnetische roerstaaf. Spoel de Petri schaal met extra oogst medium om overgebleven epidermale cellen te verzamelen en breng het uiteindelijke volume naar 30 mL. Gebruik een magnetische roerder en roer 100 rpm gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur. Dit proces zal de gevangen epidermale cellen van haren verwijderen.
7. Plaats een steriele 70 μm celzeef op de bovenkant van een conische buis van 50 mL. De celzeef past bovenop een conische buis van 50 mL.
   1. Neem de pot in een bioveiligheid Hood. Verwijder de roer stang en giet de inhoud in zeef filter bevestigd aan een conische buis van 50 mL. Ongewenst haar en vellen stratum corneum uitbelasten.
   2. Druk de haren samen met stratum corneum materialen in de zeef en manipuleer ze om de ingesloten haarcellen vrij te geven. Gebruik 5 mL oogst medium om overgebleven gevangen cellen vrij te maken en in de buis te laten stromen. Breng het totale volume tot 50 mL in conische buis.
8. Dop de conische buis van 50 mL met celfiltraat en centrifugeer bij 160 x g gedurende 7 minuten bij 4 °c. Volgende aspiraat de supernatant en voeg 5 ml van het oogst medium. Rebreng de celpellet door zachtjes te tritureren ~ 20x met een pipet van 5 mL.
   1. Houd de cellen in een koelbox bij deze stap om aggregatie te voorkomen. Voeg 25 ml oogst medium toe en wrijf opnieuw (20 – 25x).
   2. Om te zorgen voor een nauwkeurige in telling bij deze stap, neem 1 ml celsuspensie en voeg 19 ml oogst medium. Nu is de celverdunning 1:20 in 50 mL conische buis. Als keratinocyten uit één muis worden geoogst, past u het volume van de celsuspensie aan. Gebruik in plaats van 30 mL 15 mL en maak een 1:10 verdunning voor het tellen van de cellen.
9. Pipet 0,5 mL verdunde cellen uit de conische buis van 50 mL (1:20 verdunning) en breng deze over in een geautoclaveerd micro centrifugebuis van 1,5 mL. Verwijder 0,2 mL (200 μL) celmix tot een andere micro centrifugebuis van 1,5 mL en voeg een gelijk volume (200 μL) van 0,4% Trypeen blauwe oplossing toe. Meng deze oplossing 3x zachtjes en breng cellen over naar een hemocytometer voor het tellen van nucleated keratinocyten.
   1. Scoor alle donker blauwe cellen positief voor Trypan Blue als niet-levensvatbare dode cellen, en scoor kleine goud-en roze cellen als levensvatbare cellen. De uiteindelijke opbrengst in per muis moet ongeveer 30.000.000 levensvatbare cellen.
10. Centrifugeer de oorspronkelijke conische buis van 50 mL (vanaf stap 3,8) gedurende 7 minuten bij 160 x g bij 4 °c. Bij deze stap, respendeer de cellen in het gewenste medium en maak de vereiste verdunning voor zaaien cellen.
    1. Voor massacultuur, zaad 2 tot 4.000.000 levensvatbare gouden cellen in elke 35 mm Petri schaal in celkweekmedium (kgm-type medium + supplementen voor monolaag culturen) (Zie tabel 1). Voor een clonogene (kolonie vorming) Assay, zaad 1.000 cellen per 60 mm Petri schaal op X-Ray bestraalde Zwitserse muis 3T3 feeder lagen met collageen-coating en gemodificeerde William's E medium met supplementen en serum.
    2. Gebruik in totaal 2 tot 4 mL medium voor respectievelijk 35 mm en 60 mm Petri schalen. Ook formuleren DMEM en Williams E medium verkregen uit ATCC met verlaagde niveaus van natriumbicarbonaat voor gebruik bij 5% CO₂.
11. Kweek de kweekcellen (massa of clonogeen) bij 32 °C, 95% vochtigheid met 5% CO₂. Verander de media één dag na de eerste zaaien voor de massacultuur en daarna 3x per week. Echter, voor van klonen assays, de eerste gemiddelde verandering is 2 dagen na het zaaien van de cel en 3x per week daarna.
12. Voor de klonale cultuur cultiveer je de cellen met intervallen van twee en vier weken. Na voltooiing van de klonale culturen (2 of 4 weken), aspireren het medium. Bevestig de kolonies in 10% gebufferde formaline 's nachts bij kamertemperatuur en beits met 0,5% Rhodamine B in autoclaaf water gedurende 1 uur. Verwijder vervolgens de Rhodamine B vlek met een pipet van de rand van de gerechten.
    1. Spoel de gerechten af in koud geautoclaveerd water tot de gerechten duidelijk worden. Zet de gerechten schuin op het deksel van de gerechten en laat ze drogen voor de uiteindelijke kolonie telling. Met name, bij het uitvoeren van clonogene kweek test, pipetteren nooit < 1 mL cellen. Als de cellen geconcentreerd zijn, Verdun de celconcentratie sereen.

Resultaten

Typisch, rendementen van epidermale keratinocyten per muis, variërend van 20 x 10⁶ aan 30 x 10⁶ trypan blauw met uitzondering van cellen worden verkregen^8,9. De levensvatbaarheid varieert van 80%-90%. Typische zaaien efficiëntie is ongeveer 30% Attachment bij 24 h. kolonie vorming op bestraalde 3T3 feeder lagen is rond 60 kolonies per 1.000 levensvatbare cellen voor C57BL/6 muizen, en ongeveer 30 kolonies per 1.000 cellen voor muizen van het Zwitserse type^{10 ,11}. Typische resultaten van de kolonie vorming testen worden geïllustreerd in Figuur 1. Het aantal haarfollikel stamcellen is ongeveer 9% CD34⁺/Cd49f⁺ stamcellen voor C57BL/6 muizen¹². Typische resultaten van flow cytometrie worden gegeven in Figuur 2.

De groei kenmerken van vier verschillende media worden geïllustreerd in Figuur 3. De geteste media omvatten KGM-Gold, SFM, William's E medium en Morris-2 (een gereduceerd calcium medium ontwikkeld in het Morris Laboratory gebaseerd op Williams E).

Figuur 1: representatieve voorbeelden van een test voor clonogene keratinocyten van volwassen muizen. Deze foto demonstreert in kolonie vorming van cd-1 vrouwelijke muizen 54 dagen oud behandeld topisch met 1) geen behandeling, 2) aceton volgde een week later door aceton tweewekelijks twee weken, 3) dmba volgde een week later door aceton tweewekelijks gedurende twee weken, 4) aceton volgde een week later door TPA tweemaal per week twee weken, en 5) DMBA volgde een week later door TPA tweemaal per week voor twee weken. Na hun in vivo behandelingen werden keratinocyten geoogst en in 1.000 cellen per schotel geënt op feeder lagen van bestraalde 3T3, en gekweekt gedurende twee weken, waarna de gerechten werden vastgezet met gebufferde formaline en gekleurd met Rhodamine B. De gerechten in elke kolom zijn replicaties van elke muis behandelingsgroep. Merk op dat het aantal grotere kolonies steeg na behandeling met dmba, en het totale aantal kolonies verhoogde TPA behandeling van de muizen voorafgaand aan in oogst. Afkortingen: DMBA: 7, 12-dimethylbenz [a] anthraceen; TPA: 12-O-tetradecanoylphorbol-13-acetaat. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figuur 2: representatief voorbeeld van Flowcytometrie van stamcellen van haarfollikel van volwassen muizen. In het kort werden de geïsoleerde primaire keratinocyten geïsoleerd van de huid van de dorsale muizen en gefilterd op cellulair puin met behulp van een celfilter. De geïsoleerde in suspensie werd gelabeld met CD49f of Α6-integrin (PE) en CD34 (FITC) antilichamen samen met Live Dead Dye en andere besturingselementen. FITC-en PE-Isotype-controle antilichamen (rat IgG2akappa) werden gebruikt voor compensatie doeleinden (Zie tabel met materialen). Stamcellen werden geselecteerd door middel van CD49f (PE-kanaal), dat de externe component van de Hemi-desmosomes herkende die werd aangetroffen op basale epidermale en haarfollikel cellen, en CD34 (FITC-kanaal), die de stamcellen van haarfollikel herkende (d.w.z. CD34-FITC⁺ en A6-PE⁺ (bovenste rechterkolom, totaal 5%)). De rechterkolom toont de verschillende keratinocyten populaties, namelijk CD34-FITC only, CD34-FITC en A6-PE cellen (dubbele positieve stamcel populatie), alleen A6-PE en ongekleurde cellen. Merk op dat er twee CD34⁺ stamcel populaties zijn, zoals gerapporteerd op^6,14. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figuur 3: vergelijking van vier verschillende media op primaire culturen van epidermale cellen van volwassen vrouwelijke muizen. Primaire keratinocyten werden geïsoleerd van de huid van de dorsale muizen en geteld voor zaaien met behulp van vier verschillende media (KGM, SFM, Willem-E en Morris-2). Gelijke aantallen keratinocyten werden gesekt en gevolgd voor hun algemene morfologie en groeipatroon. Merk op dat de prolifererende keratinocyten iets verschillende morfologieën hebben. KGM, SFM en Morris-2 zijn allemaal gereduceerde calcium dragers die na veertien dagen de meest robuuste groei hebben. In tegenstelling, de cellen niet aanhouden wanneer gekweekt in Williams E medium dat 1,4 mM calcium en een hoge verhouding van kalium tot natrium heeft. Verrassend genoeg ondersteunt Williams e medium met supplementen en twintig procent foetaal runderserum in klonale culturen veel beter dan elke andere medium getest, waarschijnlijk omdat de verrijkte Williams e medium de 3T3 feeder-cellen helpt om beter te "voeden". Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Oplossingen en media	Opmerkingen
Oogst oplossingen
2,5% trypsine (5 mL)
Dulbecco's PBS (500 mL)
Gentamycine (2 mL)
PBS met 2x gentamycine (45 mL)
Fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) met 2x gentamycine
Trypsine-oplossing
Celkweek oplossingen
Purecol-fibronectin-schaalcoating oplossing:
1 M HEPES (1 mL)
116 mM CaCl2 (1 mL)
Boviene serumalbumine 1,0 mg/mL (10 mL)
Celkweekmedium (100 mL)
Fibronectine (1 mg)
Purecol collageen (1 mL)
Cel invriezen oplossing
DMSO (2 mL)
DMEM met 10% BCS en pen-Strep
Oogst medium	Moet zonder calcium
2x gentamycine (1 mL)
FBS (50 mL)
SMEM (500 mL)
High-calcium Williams ' E media met:
EFG (5 μg/mL) 1 mL
Glutamine 14,5 mL
Hydrocortison (1 mg/mL) 0,5 mL
Insuline 1 mL
Lino zuur-BSA (0,1 mg/mL) 0,5 mL
MEM-aminozuren 4 mL
MEM vitaminen 5 mL
Penicillaire-streptomycine 5 mL
Transferrin (5mg/mL) 1 mL
Vit A (1 mg/1000 μL) 57,5 μL
Vit E 1 mg/mL (4 °C) 3,5 μL
Vit D2 (10 mg/mL) 50 μL
3T3 fibroblast compleet groeimedium (CGM)
BCS (100 mL)
DMEM (900 mL)
Penicillaire-streptomycine (10 mL)
KGM	Medium gebruikt voor massacultuur is een verlaagd calcium medium
Morris 2 medium met dezelfde supplementen als Williams ' E	Een gereduceerde calcium variant van Williams E met supplementen

Tabel 1: oplossings-en media recepten.

Discussie

De in oogst methode beschreven hier werd ontwikkeld om hoge opbrengsten van zeer culturable primaire epidermale keratinocyten uit de rug van volwassen vrouwelijke muizen te produceren. Deze keratinocyten zijn geschikt voor Flowcytometrie, moleculaire biologie toepassing, en primaire celcultuur, met inbegrip van de clonogene assay gerapporteerd hier. Deze in oogst methode is ook nuttig voor het bestuderen van andere downstream aspecten van cutane chemische carcinogenese en tumor promotie^1,13.

Er zijn verschillende kritieke stappen in het protocol. Ten eerste werden voor de strengheid en reproduceerbaarheid vrouwelijke muizen met een leeftijd van 54 ± 2 dagen gebruikt. Dit heeft ons in staat stellen om gevoelige en kwantitatieve kolonie-testen uit te voeren uit meerdere stammen van muizen en deze te gebruiken als een fenotype in koppelings analyse die leidt tot identificatie van ten minste één nieuw regelgevings-gen voor stamcel^10,11. Ten tweede is het nuttig om de skins in kleinere stukjes te knippen, omdat de trypsinisatie effectiever is dan het proberen om de huid in zijn geheel te houden. Ten derde is de tijd en de temperatuur van de flotatie van trypsine erg belangrijk voor de daaropvolgende culturabiliteit. Bovendien moet men "aanzienlijk Poke" bij de haren die op het filter blijven om de bijgevoegde cellen te Verdoe- Deze stap is belangrijk voor het verkrijgen van hoge opbrengsten van cellen. Bovendien is de 32 °C temperatuur van de incubator belangrijk voor de langerlopende teelt van keratinocyten van volwassen muizen. Ten slotte zijn in dit protocol de parallelle uitlezingen van in vitro en in vivo experimenten¹ gebaseerd op primaire culturen in plaats van subculturen of cellijnen. Met name, als het oogsten van primaire keratinocyten voor de eerste keer met behulp van dit protocol, houd de resterende dermis na schrapen om te bevestigen dat de volledige verwijdering van haarzakjes samen met epidermis door histopathologische observatie.

De belangrijkste kracht van dit protocol voor het oogsten van volwassen muis keratinocyten is dat het produceert hoge opbrengsten van culturable cellen die geschikt zijn voor veel downstream toepassingen. De belangrijkste beperking is dat sommige celoppervlak epitopen gevoelig kan zijn voor trypsinoisatie, zodat immunokleuring kan worden aangetast. Daarom, bij het testen van een nieuw celoppervlak antilichaam, het kan verstandig zijn om een dispase⁶ of thermolysin⁵ gebaseerde methode voor het oogsten voor de vergelijking te gebruiken. Het belang van dit protocol is dat het grondig is getest, gekwantificeerd en toegepast op dergelijke uiteenlopende toepassingen als assays voor clonogene stamcellen^1,9,10,11, voor massa culturen in biochemie⁸, voor FACS sortering in stamcel analyse^3,4, voor moleculaire biologie^3,12, en voor voortdurende RNA en DNA-sequencing.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
0.4% Trypan blue 1x in 0.9% saline	Life Technologies Gibco	15250-061
1 M HEPES Buffer	Sigma	H0887	Steriele
1.5 inch magnetic stir bar with pivot ring	Bel-Art, Wayne	371101128	in 2 oz Nalgene pot
10 mL disposable pipettes	BD Falcon	357551
15 mL sterile conical tube	BD Falcon	352097
150 cm2 (T-150) culture flask	Corning	430825
2 mL Screw Cap Micro Tube Conical	Sarstedt	72.608
2 oz Nalgene pot	Thermo Fisher Scientific	2118-0002	60 mL
2.5% Trypsin solution 10x	Life Technologies Gibco	15090-046
225 cm2 (T-225) culture flask	Corning	431082
32 oz Nalgene Square Storage Bottles: PETG	Thermo Fisher Scientific	2019-1000	1000 mL
35 mm sterile culturing dish	Corning	430165
5 mL disposable pipets	BD Falcon	357543
50 mL sterile conicle tube	BD Falcon	352098
60 mm sterile culturing dish	Corning	430166
70% ethanol
90 mm diameter Spectra Mesh filter, 74 µm pore size	Spectrum Laboratories	145956
Antibiotics (penicillin-streptomycin)	Life Technologies Gibco	15140-122
Bovine calf serum (BCS)	Thermo Fisher Scientific Hyclone	SH30073.03
Bovine serum albumin	BD Biosciences	354331
CD34 Ram34 FITC conjugated antibody	BD Pharmingen	553733
CD49f (alpha6-integrin, GOH3) PE conjugated antibody	BD Pharmingen	555736
Cell Strainer, 70 µm sterile	BD Discovery Labware	352350
Collagen, Bovine, Type I, 30 mg	BD Biosciences	354231
CoolCell Economical cell freezing container for 1 or 2 mL cryovials	Biocison	BCS-136PK
Corning 2 mL Polypropylene Cryogenic Vial, Self-Standing with Round Bottom	Corning	430659
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Sigma	D2650
Distilled Milli-Q water			vers vers gemaakt; twee keer gedistilleerd omgekeerd osmose water
Dulbecco’s phosphate-buffered saline 1x, Ca2+ and Mg2+ free	Life Technologies Gibco	14190-144	Steriele
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)	ATCC	30-2002
Fetal bovine serum (FBS)	Thermo Fisher Scientific Hyclone	SH 300070.03
Fibronectin	Sigma	F1141-5MG
Fisherbrand 4 oz. Sterile Specimen Container	Fisher Scientific	16-320-730
Gentamicin 50 mg/mL 10	Life Technologies Gibco	15750-060
KGM	Lonza	CC-3103
Nalgene “Mr. Frosty" cell freezer	Thermo Fisher Scientific	5100-0001
Nalgene PC Straight-Side Wide-Mouth Jars, 16 oz	Thermo Fisher Scientific	2116-0500
No. 22 sterile stainless-steel blades	BD Bard-Parker	371222
No. 4 scalpel handles	Biomedical Research Instruments	26-1200	In een beker met 70% ethanol
One pair of full-curve eye dressing forceps	Militex	18-784	In een beker met 70% ethanol
One pair of scissors	Biomedical Research Instruments	25-1050	In een beker met 70% ethanol
One pair of thumb dressing forceps	Militex	6-4	In een beker met 70% ethanol
Oster Pro-Cord/Cordless Trimmer no.40 blade	Jarden Consumer Solutions/Oster	78997-010
Plastic Petri dish 100 mm x 20 mm sterile	Corning	430167
Pyrex Brand Plain Stemless Glass Funnel	Corning	6240-75
Rat IgG2akappa FITC isotype control antibody	BD Pharmingen	553929
Rat IgG2akappa PE isotype control antibody	BD Pharmingen	555844
SFM	Life Technologies Gibco	10725-018
SMEM	Life Technologies Gibco	11380-037
SMEM: Ca2+ and Mg2+ free minimal essential medium for suspension culture	Life Technologies Gibco	11380-037
Square sterile plastic Petri dishes	BD Falcon	351112
Swiss mouse 3T3 fibroblasts	ATCC	CCL-92	gebruikt binnen 10 passages
Triadine; 10% Povidone-Iodine Prep Topical Solution, 16 oz	Triad Group	10-8216
VWR Plastic Petri dishes, sterile Space Saver 100 x 10	VWR	25384-324
Williams E Medium	Life Technologies Gibco	12551-032
Ziploc bag