Hier tonen we de methoden voor in vivo kwantificering van leukocyten egress van naïef, ontstoken, en kwaadaardige lymfkliertest huid. Wij voeren een head-to-head vergelijking van twee modellen: transdermaal FITC toepassing en in situ photoconversion. Bovendien tonen wij het nut van photoconversion voor het bijhouden van leukocyten egress van cutane tumoren.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Kwantificeren van de leukocyten Egress via de lymfevaten van lymfkliertest huid en tumoren
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Leukocyten egress uit perifere weefsels naar zuig lymfeklieren is niet alleen cruciaal voor immuun toezicht en inleiding maar draagt ook bij aan de resolutie van de perifere weefsel reacties. Hoewel een verscheidenheid van methoden worden gebruikt om te kwantificeren leukocyte egress uit niet-lymfoïde, perifere weefsels, blijven de cellulaire en moleculaire mechanismen die context-afhankelijke egress regeren slecht begrepen. Hier beschrijven we het gebruik van in situ photoconversion voor kwantitatieve analyse van leukocyten egress van lymfkliertest huid en tumoren. Photoconversion zorgt voor de directe etikettering van leukocyten woonachtig binnen cutane weefsel. Hoewel de blootstelling van de huid aan violet licht lokale induceert inflammatoire reacties gekenmerkt door leukocyten infiltreert en vasculaire leakiness, in een head-to-head vergelijking met transdermale toepassing van fluorescente verklikstoffen, photoconversion specifiek Label trekkende dendritische cel populaties en gelijktijdig ingeschakeld de kwantificering van myeloïde en lymfoïde egress van cutane microenvironments en tumoren. De mechanismen van leukocyten egress blijven een ontbrekende onderdeel in ons begrip van intratumoral leukocyten complexiteit zal, en aldus de toepassing van de instrumenten die hierin worden beschreven uniek inzicht in de dynamiek van tumor immuun microenvironments beide bij steady state en in reactie op de therapie.
Inleiding
Perifere weefsel immuunresponsen zijn gevormd, niet alleen door leukocyten aanwerving aan de sites van ontsteking, maar ook door mechanismen die hun latere retentie regelen. Dus, beschermende immuniteit is ingegeven door cumulatieve cellulaire en moleculaire mechanismen die bepalen of een leukocyte invoert, blijft binnen, of liever gezegd migreert is uit perifere weefsel via de lymfevaten. Nog belangrijker is, is de neiging voor leukocyten om af te sluiten van weefsel via de lymfevaten (zogenaamde egress) gekoppeld aan hun gespecialiseerde functies. Dendritische cellen (DC) verwerven trekgedrag in reactie op signalen van de rijping leidt tot antigeen vervoer en presen....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Alle dierlijke protocollen zijn goedgekeurd door de institutionele Animal Care en gebruik Comité bij de Oregon Health & Science University.
1. de inductie van ontsteking en FITC schilderij van muis Pinna
- In een laminaire flow-kap, anesthetize een C57Bl/6-muis met behulp van gevaporiseerde isofluorane (induceren bij 3-5% isofluorane en zorg ervoor dat u 1-3% isofluorane; zuurstof debiet op 0.5-1.0 L/min). Zorgen voor goede afstomping door controle op het verlies van pedaal reflex, onwillekeurige bewegingen en respiratoire tarief.
- Leg een oor plat met de ventrale zijde van het oor naar boven. Pipetteer 20 µL van 5% FITC-op....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Wij willen eerst repliceren photoconversion resultaten gepubliceerd in de literatuur tot evaluatie van de doeltreffendheid en de bijbehorende ontsteking in de huid van de muis te bepalen. De pinna oor was blootgesteld aan 100 mW violet licht (405 nm) voor 3 min33zoals hiervoor is beschreven. Eén cel schorsingen gegenereerd op basis van het oor huid of cervicale dLNs onmiddellijk na de blootstelling bleek een omzettingsefficiëntie van 78% van alle CD45+ l.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Hoewel de leukocyten egress uit perifere, niet-lymfoïde weefsels essentieel voor de inleiding en de resolutie van de immuunrespons is, worden de moleculaire mechanismen die egress regeren slecht begrepen. Deze lacunes in de kennis is grotendeels te wijten aan de beschikbaarheid van instrumenten voor de kwantificering in vivo. Hier beschrijven we het gebruik van photoconvertible muizen (Kaede-Tg) te kwantificeren van endogene leukocyte uitgang van de huid en de tumoren en bieden een directe vergelijking van de he.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs er geen conflicten optreden bekend te maken.
Dankbetuigingen
De auteurs bedank Dr. Marcus Bosenberg voor het verstrekken van YUMM 1.1 en YUMM 1.7 lymfkliertest melanoom lijnen en Dr. Deborah J. Fowell voor het verstrekken van B6. CG-Tg(CAG-tdKaede) 15Utr muizen in overleg met RIKEN BRC via de nationale Bio-bron van de MEXT, Japan.
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Collagenase D | Roche | 11088866001 | |
| DNase | Roche | 4536282001 | |
| Silver-LED-405B lichtbron met optische vezel en collimator | Prizmatix Ltd | V8144 | |
| Fluoresceïne isothiocyanate isomer I | Sigma-Aldrich | F4274 | |
| dibutylftalaat | Sigma-Aldrich | 524980 | |
| aceton | Macron Fine Chemicals | 2440-02 | |
| 29-gauge spuiten | Exel International | 26029 | |
| Evans Blauw | Sigma-Aldrich | E2129 | |
| 70 µm celzeefjes | VWR | 732-2758 | |
| paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| HBSS | Caisson | HBL06 | |
| LIVE/DEAD Fixable Aqua Dead Cell Stain Kit | Invitrogen | L34966 | |
| Gezuiverd Anti-muis CD16/CD32 | Tonbo Biosciences | 70-0161-M001 | |
| BV605 CD11c (clone N418) | Biolegend | 117334 | |
| PerCP-Cy5.5 MHCII (clone M5/114.15.2) | BD Pharmingen | 562363 | |
| BV421 CD3e (clone 145-2C11) | Biolegend | 100341 | |
| APC CD8a (clone 53-6.7) | TonBo Biosciences | 20-0081-u100 | |
| APC-Cy7 CD45 (clone 30-F11) | Biolegend | 103116 | |
| BV650 CD19 (clone 6D5) | Biolegend | 115541 | |
| PerCP-Cy5.5 Ly6C (clone HK1.4) | Biolegend | 128011 | |
| Alexa Fluor 647 F4/80 (clone BM8) | Biolegend | 123121 | |
| APC-Cy7 Ly6G (clone 1A8) | Biolegend | 127623 | |
| BV711 CD11b (clone M1/70) | Biolegend | 101241 | |
| BV605 CD45 (clone 30-F11) | Biolegend | 103155 | |
| BV711 CD4 (clone RM4-5) | BD Biosciences | 563726 | |
| Rundserumalbumine (Fractie V) | Fisher Scientific | BP1600-100 | |
| Anit-Rat en Anti-Hamster Igk / Negatieve Controle Compensatiedeeltjeset | BD Biosciences | 552845 | |
| Fortessa Flow Cytometer | BD Biosciences | ||
| FlowJo v10 Software | FlowJo |
Referenties
- Banchereau, J., Steinman, R. M. Dendritic cells and the control of immunity. Nature. 392 (6673), 245-252 (1998).
- Hampton, H. R., Bailey, J., Tomura, M., Brink, R., Chtanova, T. Microbe-dependent lymphatic migration of neutrophils modulates lymphocyte proliferation in l....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
