Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Kwantificeren van de leukocyten Egress via de lymfevaten van lymfkliertest huid en tumoren

8.4K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/58704

⸱

7 januari 2019

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Cell, Developmental, & Cancer Biology, Oregon Health and Science University, 2Department of Molecular Microbiology & Immunology, Oregon Health and Science University, 3Department of Dermatology, Oregon Health and Science University, 4Knight Cancer Institute, Oregon Health and Science University

In dit artikel

Samenvatting

Hier tonen we de methoden voor in vivo kwantificering van leukocyten egress van naïef, ontstoken, en kwaadaardige lymfkliertest huid. Wij voeren een head-to-head vergelijking van twee modellen: transdermaal FITC toepassing en in situ photoconversion. Bovendien tonen wij het nut van photoconversion voor het bijhouden van leukocyten egress van cutane tumoren.

Samenvatting

Leukocyten egress uit perifere weefsels naar zuig lymfeklieren is niet alleen cruciaal voor immuun toezicht en inleiding maar draagt ook bij aan de resolutie van de perifere weefsel reacties. Hoewel een verscheidenheid van methoden worden gebruikt om te kwantificeren leukocyte egress uit niet-lymfoïde, perifere weefsels, blijven de cellulaire en moleculaire mechanismen die context-afhankelijke egress regeren slecht begrepen. Hier beschrijven we het gebruik van in situ photoconversion voor kwantitatieve analyse van leukocyten egress van lymfkliertest huid en tumoren. Photoconversion zorgt voor de directe etikettering van leukocyten woonachtig binnen cutane weefsel. Hoewel de blootstelling van de huid aan violet licht lokale induceert inflammatoire reacties gekenmerkt door leukocyten infiltreert en vasculaire leakiness, in een head-to-head vergelijking met transdermale toepassing van fluorescente verklikstoffen, photoconversion specifiek Label trekkende dendritische cel populaties en gelijktijdig ingeschakeld de kwantificering van myeloïde en lymfoïde egress van cutane microenvironments en tumoren. De mechanismen van leukocyten egress blijven een ontbrekende onderdeel in ons begrip van intratumoral leukocyten complexiteit zal, en aldus de toepassing van de instrumenten die hierin worden beschreven uniek inzicht in de dynamiek van tumor immuun microenvironments beide bij steady state en in reactie op de therapie.

Inleiding

Perifere weefsel immuunresponsen zijn gevormd, niet alleen door leukocyten aanwerving aan de sites van ontsteking, maar ook door mechanismen die hun latere retentie regelen. Dus, beschermende immuniteit is ingegeven door cumulatieve cellulaire en moleculaire mechanismen die bepalen of een leukocyte invoert, blijft binnen, of liever gezegd migreert is uit perifere weefsel via de lymfevaten. Nog belangrijker is, is de neiging voor leukocyten om af te sluiten van weefsel via de lymfevaten (zogenaamde egress) gekoppeld aan hun gespecialiseerde functies. Dendritische cellen (DC) verwerven trekgedrag in reactie op signalen van de rijping leidt tot antigeen vervoer en presentatie in het aftappen lymfklieren (dLN), een proces dat nodig is voor adaptieve immuniteit1. Opruiming myeloïde cellen, zoals macrofagen en neutrofielen, dienen apoptotic puin door fagocytose te wissen. Tijdens de bacteriële infectie, neutrofielen egress weefsel en uiteindelijk ondergaan apoptosis in dLNs2 en een model van DSS-geïnduceerde colitis, gegevens ondersteunt de hypothese dat de macrofaag egress is noodzakelijk om te lossen lokale ontsteking3. Of neutrofiele en macrofaag egress plaatsvindt in alle inflammatoire contexten, is echter onbekend. Bewijs voor T lymfocyten uitgang uit de steady-state4,,5,,6,7, besmette8en ontstoken4,9,10, 11,12 perifere, niet-lymfoïde weefsels geeft aan dat T-cellen actief recirculate, hoewel de weefsel gebaseerde signalen die deze afslag rijden blijven slecht begrepen. Verschillende studies hebben geïdentificeerd signalen nodig voor de directionele overgang naar het aftappen van lymfatische haarvaten en latere egress inclusief chemokine (C-C motief) ligand 21 (CCL21) en de receptor CCR74,11, 13, chemokine (C-X-C motief) ligand 12 (CXCL12) en de receptor CXCR42,14, en sphingosine-1-fosfaat (S1P)10,15,16. Deze mechanismen zijn niet actief in alle contexten, echter, en of ze bepalen uitgang van alle celtypes blijft een open vraag. Nog belangrijker is, verder vereist inzicht in de mechanismen die egress en haar functionele relevantie in ziekte regeren kwantitatieve in-vivo analysemethoden.

Verschillende methoden zijn gebruikt om het kwantificeren van de uitgang in meerdere diermodellen in vivo met inbegrip van directe cannulation van lymfevaten, adoptief overdracht van ex vivo label leukocyten, transdermale toepassing van fluorescente verklikstoffen, injectie van gelabelde deeltjes, en in vivo photoconversion17,18. Directe cannulation van de lymfevaten afferent muis is moeilijk en kleine dieren beperkt door de hoeveelheid vloeistof die kunnen worden verzameld. Dus cannulation is grotendeels uitgevoerd in grote dieren (bv., schapen) waar dergelijke chirurgische manipulaties zijn praktische. Deze studies leveren direct bewijs voor de aanwezigheid van zowel lymfoïde en myeloïde cellen in lymfe10,19,20. Bovendien, schapen modellen onthullen dat acute en chronische ontsteking lymfocyt aanwezigheid in lymfe steeg met bijna 100-fold10,-21.

Adoptief overdracht van gelabelde en genetisch gemanipuleerde lymfocyten belangrijker is gebleken dat CCR7 vereist voor de uitgang van CD4 is+ T cellen van acuut ontstoken huid5,11, terwijl de voorbehandeling van lymfocyten met het kleine molecuul S1P receptor agonist remt FTY720, slechts gedeeltelijk hun egress-10. Interessant is dat de uitgang van overgedragen lymfocyten van chronisch ontstoken huid is CCR7-onafhankelijke10, maar kan gedeeltelijk CXCR49vereisen. Adoptief overdracht experimenten, leveren niet-fysiologische aantal ex vivo echter geactiveerd en gelabelde lymfocyten in weefsel via injectie, dat de biomechanische omgeving van weefsels en een verhoogde interstitiële vloeistof druk verandert dat opent eerste lymfatische haarvaten en veranderen hun vervoer eigenschappen22. Als een alternatieve, transdermale toepassing van fluoresceïne-isothiocyanaat (FITC) in de aanwezigheid of afwezigheid van dermale irriterende stoffen (bv., dibutylftalaat, DBP) of infectie23,24 voorziet in het bijhouden van fagocytische cellen die accumuleren tracer en migreren naar dLNs. Evenzo fluorescently geëtiketteerde tumoren een manier bieden waarmee bijhouden fagocytische cellen die tumor materiële25hebben opgeslokt. Deze methoden hebben verstrekt belangrijk inzicht verschaffen in de mechanismen die regeren DC uitgang13,14,17,26,27 , maar zijn niet in staat om bij te houden van niet-fagocytische lymfocyten en interpretatie kunnen worden bemoeilijkt door gratis lymfedrainage van oplosbare FITC dus labeling niet-trekvogels, LN resident DCs.

U kunt ook is intravital microscopie een krachtig hulpmiddel waarmee voor in vivo bijhouden van fysiologisch relevante leukocyte populaties in real-time28,29. Gebruikt in combinatie met de verslaggever muizen en antilichaam gebaseerde in vivo immunefluorescentie labeling, intravital microscopie is gebleken dat de complexe ruimtelijke en temporele dynamiek van immuun cel mensenhandel, waaronder interstitiële migratie30 , zielsverhuizing over de lymfatische endotheel, passage binnen de lymfatische lumen en migratie op LN vermelding28,31. Brede goedkeuring van intravital beeldvormingstechnieken wordt beperkt door de kosten, de nodige expertise voor instellen, en doorvoer voor het kwantificeren van meerdere celtypen beperkt. Nog steeds, koppeling van de kwantitatieve methodes die het analyseren van de populatiedynamiek weefsels met intravital imaging geven extra en belangrijk mechanistische inzicht met betrekking tot de mechanismen van de motiliteit en migratie naar en binnen lymfatische haarvaten 18 , 31 , 32.

Bijgevolg, in vivo photoconversion heeft ontpopt als een methode voor het in situ labelen, waarmee onafhankelijk van fagocytische activiteit, en voor de kwantificering van fysiologische leukocyte egress (wanneer in combinatie met stroom cytometry) in de afwezigheid of aanwezigheid van uitdaging. Constitutively express Kaede-Tg muizen een proteïne van stony koraal dat groene fluorescentie (Kaede groene) vertoont totdat blootgesteld aan violet licht, waarna het onomkeerbaar wordt omgezet in rode fluorescentie (Kaede rode)33geïsoleerd. Photoconverted cellen kunnen worden getraceerd als zij egress van perifere weefsel sites en zich ophopen in de dLNs. Dit en andere soortgelijke photoconvertible muis modellen34,35 is gebleken dat belangrijke biologie met inbegrip van constituerende egress van regulatoire T-cellen van huid36, CXCR4-afhankelijke B-cel egress van Peyer van patches37 , mobilisatie van resident T geheugencellen op peptide opnieuw uitdaging38, en brede leukocyte egress tumor microenvironments €39. Hierin, voeren wij een head-to-head vergelijking van photoconversion met transdermaal FITC toepassing in het kader van cutane ontsteking en infectie te voorzien in rechtstreekse vergelijking van bestaande gegevens met de photoconvertible-methode. Bovendien, we tonen photoconversion geïmplanteerde tumoren en beschrijven van de omzettingsefficiëntie en selectieve egress van tumor microenvironments. Zo, we stellen dat verdere toepassing van deze methoden is nodig om te verhelderen van de kritische biologie van leukocyten egress van tumoren, die aanzienlijke gevolgen voor de interpretatie van intratumoral leukocyten complexiteit, anti-tumor immuniteit, zal hebben en respons op therapie.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Alle dierlijke protocollen zijn goedgekeurd door de institutionele Animal Care en gebruik Comité bij de Oregon Health & Science University.

1. de inductie van ontsteking en FITC schilderij van muis Pinna

  1. In een laminaire flow-kap, anesthetize een C57Bl/6-muis met behulp van gevaporiseerde isofluorane (induceren bij 3-5% isofluorane en zorg ervoor dat u 1-3% isofluorane; zuurstof debiet op 0.5-1.0 L/min). Zorgen voor goede afstomping door controle op het verlies van pedaal reflex, onwillekeurige bewegingen en respiratoire tarief.
  2. Leg een oor plat met de ventrale zijde van het oor naar boven. Pipetteer 20 µL van 5% FITC-oplossing opgelost in 1:1 aceton: dibutylftalaat (DBP) aan de ventrale zijde van oor pinna. Het toestaan van het oor te drogen voor een paar seconden.
  3. 24 h na FITC toepassing, euthanaseren de muizen via kooldioxide blootstelling gevolgd door cervicale dislocatie. De veervormige oor in PBS verzamelen door het scheiden van de oren van het hoofd met behulp van schaar. De cervicale dLNs en inguïnale niet-drainage LNs in PBS met pincet te scheiden van de LNs van omringende weefsels verzamelen. Lies niet-drainage LNs zal dienen als negatieve controles op de aanwezigheid van FITC+/Kaede rode+ leukocyten. Verwijdering van karkassen per institutionele protocol.
    Opmerking: De optimale tijd post photoconversion voor analyse zal afhangen van het celtype en bekende trekkende gedrag. Dendritische cellen, kunnen bijvoorbeeld worden opgespoord in dLNs als vroeg als 6 h post DBP toepassing.

2. de inductie van ontsteking en Photoconversion van muis Pinna

  1. Anesthetize in de kap van een laminaire flow, een Kaede-Tg muis (achtergrond C57Bl/6) door intraperitoneale injectie van 80 mg/kg ketamine en 10 mg/kg xylazine, opgelost in een zoutoplossing. Zorg ervoor u juiste afstomping zoals beschreven in stap 1.1.
  2. Leg een oor plat met de ventrale zijde van het oor naar boven. Pipetteer 20 µL van een 1:1 aceton: DBP aan de ventrale zijde van de pinna oor. Het toestaan van het oor te drogen voor een paar seconden.
  3. Na toepassing van de DBP, Knip een spleet in een stuk aluminiumfolie en hecht van het oor door de gleuf aan het blootstellen van het oor naar de violet licht bron. Leg het oor plat met de dorsale zijde naar omhoog met behulp van dubbelzijdige tape teneinde het oor aan de folie.
  4. Plaats het oor direct onder de lichtbron, alsmede de photoconvert gedurende 3 minuten met behulp van een 405 nm lichtbron op 100 mW kracht.
  5. 24u na photoconversion, euthanaseren de Kaede-Tg muizen en de oogst van het oor veervormige, cervicale LNs en inguïnale LNs zoals beschreven in stap 1.3.
    Opmerking: Naast overwegingen aangehaald in stap 1.3, de tarieven van proliferatie bepalend zijn voor de timing van de analyse als het verlies van Kaede rood optreden zal in de cellen snel te verdelen.

3. "vacciniavirus" infectie van muis Pinna en FITC-toepassing

  1. Anesthetize een C57Bl/6 muis met gevaporiseerde isofluorane zoals beschreven in stap 1.1.
  2. Leg de ventrale zijde van het oor plat. Pipetteer 5 x 106 plaque-vormende eenheden (PFU) van het "vacciniavirus" virus (VacV) verdund in 10 µL van PBS op de pinna oor. Met behulp van een 29-gauge-naald, steken de pinna 25 keer40.
  3. 24 uur na infectie, anesthetize VacV-geïnfecteerde muizen met isofluorane zoals beschreven in stap 1.1 en Pipetteer 20 µL 5% FITC in aceton op de ventrale zijde van de pinna oor opgelost. Het toestaan van het oor te drogen voor een paar seconden.
  4. 24 h na FITC toepassing, euthanaseren van de muizen en de oor veervormige, cervicale LNs en inguïnale LNs verzamelen zoals beschreven in stap 1.3.
    Opmerking: FITC kan worden toegepast op eventuele infecties tijd punt bericht om te bepalen van DC mensenhandel op verschillende tijdstippen van de 24 h. Eerder meldden wij dat DC migratie naar dLNs op een vergelijkbaar niveau van dag 1 tot en met 3 post infectie41wordt gehandhaafd.

4. "vacciniavirus" infectie van muis Pinna en Photoconversion.

  1. Anesthetize een Kaede-Tg muis met gevaporiseerde isofluorane zoals beschreven in stap 1.1.
  2. Infecteren de pinna oor met VacV zoals beschreven in stap 3.2.
  3. 24u na infectie, anesthetize VacV-geïnfecteerde Kaede muizen zoals beschreven in stap 2.1 en photoconversion uit te voeren zoals beschreven in stap 2.3-2.4.
  4. 24 h na photoconversion, euthanaseren van de muizen en de oogst van het oor veervormige, cervicale LNs en inguïnale LNs zoals beschreven in stap 1.3.
    Opmerking: Zoals hierboven vermeld in stap 3.4, photoconversion kan worden beheerd op een tijd-punt post-infectie.

5. oor en lymfeklier verwerking voor stroom Cytometry

  1. Maken van eencellige schorsingen van oor veervormige: schil uit elkaar de ventrale en dorsale zijkanten van het oor pinna twee paar pincet en plaats met de binnenkant van het oor naar beneden in de putjes van de plaat van een 24-well met 1 mg/mL collagenase D en 80 U/mL DNase verdund Henks gebufferde zout oplossing (HBSS) (met Ca2 + en Mg2 +). Incubeer bij 37 ° C gedurende 30 minuten druk op het weefsel verteerd door een 70 µm nylon cel zeef.
  2. Maken van eencellige schorsingen van LNs: LNs in putjes van de plaat van een 24-well met 1 mg/mL collagenase D en 80 U/mL DNase verdund in HBSS plaatsen. Open de lymfeklier capsule met behulp van twee 29-gauge naalden, en vervolgens uit te broeden de lymfeknopen bij 37 ° C gedurende 30 minuten druk op het weefsel verteerd door een 70 µm nylon cel zeef plagen.

6. intradermale Melanoma Tumor implantatie en Photoconversion.

  1. Scheren van de vacht van het midden van de achterkant van een Kaede-Tg-muis met behulp van een elektrisch scheerapparaat.
  2. Plaats een 29-gauge naald in het midden van de rug tussen de linker- en rechter boven scapulae, en 5 x 105 tumorcellen (verdund in 50 µL zoutoplossing) intradermaal injecteren in de huid van Kaede-Tg muizen. Tumoren moeten zorgvuldig worden geplaatst zodat de lymfedrainage naar opgegeven lymfeklieren (d.w.z., links en rechts brachialis LNs voor tumoren in het midden van de bovenrug geplaatst). Vermijd het plaatsen van de tumor boven dLN als dit leiden directe photoconversion van de LNs via de huid/tumor tot kan.
  3. Toestaan dat de tumoren groeien tot de gewenste grootte (100-650 mm3).
  4. Een dag voorafgaand aan weefsel collectie, een muis Kaede-Tg anesthetize zoals beschreven in punt 2.1 en scheren van elk nieuw regrown vacht rond de tumor.
  5. Een circulaire gat in aluminiumfolie en haal de tumor door de tumor aan de lichtbron bloot te stellen. Het gat iets kleiner dan de tumor om te voorkomen dat de tumor terug te vallen door het gat en de conversie van aangrenzende, niet-tumor huid te minimaliseren.
  6. Plaats van de tumor direct onder de lichtbron en photoconvert voor 5 min met behulp van een lichtbron voor 405 nm bij 200 mW vermogen.
  7. 24 h na photoconversion, euthanaseren de muizen zoals beschreven in stap 1.3. De tumoren, brachialis dLNs en inguïnale niet-drainage LNs in PBS verzamelen. Snij van de tumoren uit de buurt van de omliggende huid met behulp van schaar en verwijder LNs zoals beschreven in stap 1.3.

7. de tumor en lymfeklieren verwerking voor stroom Cytometry

  1. Maken van eencellige schorsingen van de tumoren: gehakt van de tumoren met een schaar in putjes van de plaat van een 24-well met 1 mg/mL collagenase D en 80 U/mL DNase verdund in HBSS. Incubeer bij 37 ° C gedurende 1 h. pers het verteerd weefsel door een 70 µm nylon zeef.
  2. Maak één celsuspensie van lymfklieren zoals beschreven in stap 5.2.

8. antilichaam kleuring voor stroom Cytometry

  1. Voer na het verteren van de weefsels in eencellige schorsingen, standaard stroom cytometry kleuring technieken om de cellen van een label met markeringen van belang. Kort, Pipetteer 2 x 106 cellen in een 96-wells-plaat. Incubeer de monsters met Fc blok (1 µg/mL) voor 20 min op het ijs; wassen tweemaal met FACs buffer (1% bovien serumalbumine in PBS). Live/dode vlek (verdund in PBS) toevoegen aan de monsters en incubeer gedurende 15 minuten op het ijs; wassen tweemaal met FACs buffer. Incubeer met primaire antilichamen (Tabel of Materials) verdund in FACs buffer gedurende 30 minuten op het ijs; wassen tweemaal met FACs buffer.
    Opmerking: Kaede groen en Kaede rode fluorescentie met FITC en PE fluorophores overlapt; Dus, FITC en PE-geconjugeerde antilichamen kunnen niet worden gebruikt in combinatie met Kaede eiwitten.
  2. Na kleuring, de monsters worden uitgevoerd op een cytometer van de stroom. Als alternatief, het herstellen van de cellen met de 2% PFA.

9. Stroom Cytometry analyse

  1. Stel de FITC (Kaede groen) en PE (Kaede rood) kanaal bet spanningen tot 70-80% van het totale bereik (centreren bevolking op ongeveer 104) met ex vivo Kaede groene of rode Kaede eenkleurige splenocytes of bloed.
    Opmerking: Niet compenseren de Kaede groen (FITC) en Kaede rood (PE) kanalen zoals dit in meer signaal verspreid resulteren zal.
    1. Eenkleurige Kaede als besturingselementen wilt maken, een milt of bloed van een Kaede-Tg muis te verzamelen. Lyse van de rode bloedcellen met ACK buffer, dan de cellen in twee groepen verdelen: onbekeerde Kaede groen en geconverteerde Kaede rood.
    2. Voor één kleur Kaede rode besturingselementen, schorten de cellen in 1 mL PBS en photoconvert in een 24-well plaat voor 5 min met behulp van een 405 nm lichtbronnen op een vermogen van 100 mW. Gebruik van deze cellen om te stellen de Kaede groen (FITC) en Kaede rode bet spanningen op het stroom cytometer (stap 9.1).
  2. Zodra de spanning voor de Kaede eiwitten is vastgesteld, compenseren voor alle andere primair antilichaam vlekken met behulp van de één-fluorophore label compensatie kralen per de instructies van de fabrikant.
  3. De monsters worden uitgevoerd op een stroom cytometer om gegevens te verzamelen.
    Opmerking: Het eiwit Kaede voortdurend wordt geproduceerd door de cellen. Dit betekent dat 24 h na photoconversion, zullen de geconverteerde cellen dubbele positief voor Kaede groen en Kaede rood als nieuw samengestelde Kaede (groen) eiwit heeft opgelopen in de cel.
  4. Het analyseren van de gegevens met behulp van FlowJo of een soortgelijke software.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Wij willen eerst repliceren photoconversion resultaten gepubliceerd in de literatuur tot evaluatie van de doeltreffendheid en de bijbehorende ontsteking in de huid van de muis te bepalen. De pinna oor was blootgesteld aan 100 mW violet licht (405 nm) voor 3 min33zoals hiervoor is beschreven. Eén cel schorsingen gegenereerd op basis van het oor huid of cervicale dLNs onmiddellijk na de blootstelling bleek een omzettingsefficiëntie van 78% van alle CD45+ l...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Hoewel de leukocyten egress uit perifere, niet-lymfoïde weefsels essentieel voor de inleiding en de resolutie van de immuunrespons is, worden de moleculaire mechanismen die egress regeren slecht begrepen. Deze lacunes in de kennis is grotendeels te wijten aan de beschikbaarheid van instrumenten voor de kwantificering in vivo. Hier beschrijven we het gebruik van photoconvertible muizen (Kaede-Tg) te kwantificeren van endogene leukocyte uitgang van de huid en de tumoren en bieden een directe vergelijking van de he...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs er geen conflicten optreden bekend te maken.

Dankbetuigingen

De auteurs bedank Dr. Marcus Bosenberg voor het verstrekken van YUMM 1.1 en YUMM 1.7 lymfkliertest melanoom lijnen en Dr. Deborah J. Fowell voor het verstrekken van B6. CG-Tg(CAG-tdKaede) 15Utr muizen in overleg met RIKEN BRC via de nationale Bio-bron van de MEXT, Japan.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Collagenase DRoche11088866001
DNaseRoche4536282001
Silver-LED-405B lichtbron met optische vezel en collimatorPrizmatix LtdV8144
Fluoresceïne isothiocyanate isomer ISigma-AldrichF4274
dibutylftalaatSigma-Aldrich524980
acetonMacron Fine Chemicals2440-02
29-gauge spuitenExel International26029
Evans BlauwSigma-AldrichE2129
70 µm celzeefjesVWR732-2758
paraformaldehydeSigma-AldrichP6148
HBSSCaissonHBL06
LIVE/DEAD Fixable Aqua Dead Cell Stain KitInvitrogenL34966
Gezuiverd Anti-muis CD16/CD32Tonbo Biosciences70-0161-M001
BV605 CD11c (clone N418)Biolegend117334
PerCP-Cy5.5 MHCII (clone M5/114.15.2)BD Pharmingen562363
BV421 CD3e (clone 145-2C11)Biolegend100341
APC CD8a (clone 53-6.7)TonBo Biosciences20-0081-u100
APC-Cy7 CD45 (clone 30-F11)Biolegend103116
BV650 CD19 (clone 6D5)Biolegend115541
PerCP-Cy5.5 Ly6C (clone HK1.4)Biolegend128011
Alexa Fluor 647 F4/80 (clone BM8)Biolegend123121
APC-Cy7 Ly6G (clone 1A8)Biolegend127623
BV711 CD11b (clone M1/70)Biolegend101241
BV605 CD45 (clone 30-F11)Biolegend103155
BV711 CD4 (clone RM4-5)BD Biosciences563726
Rundserumalbumine (Fractie V)Fisher ScientificBP1600-100
Anit-Rat en Anti-Hamster Igk / Negatieve Controle CompensatiedeeltjesetBD Biosciences552845
Fortessa Flow CytometerBD Biosciences
FlowJo v10 SoftwareFlowJo

Referenties

  1. Banchereau, J., Steinman, R. M. Dendritic cells and the control of immunity. Nature. 392 (6673), 245-252 (1998).
  2. Hampton, H. R., Bailey, J., Tomura, M., Brink, R., Chtanova, T. Microbe-dependent lymphatic migration of neutrophils modulates lymphocyte proliferation in lymph nodes. Nature Communications. 6, 7139(2015).
  3. D'Alessio, S., et al. VEGF-C-dependent stimulation of lymphatic function ameliorates experimental inflammatory bowel disease. Journal of Clinical Investigation. 124 (9), 3863-3878 (2014).
  4. Debes, G. F., et al. Chemokine receptor CCR7 required for T lymphocyte exit from peripheral tissues. Nature Immunology. 6 (9), 889-894 (2005).
  5. Bromley, S. K., Yan, S., Tomura, M., Kanagawa, O., Luster, A. D. Recirculating memory T cells are a unique subset of CD4+ T cells with a distinct phenotype and migratory pattern. Journal of Immunology. 190 (3), 970-976 (2013).
  6. Tomura, M., et al. Activated regulatory T cells are the major T cell type emigrating from the skin during a cutaneous immune response in mice. Journal of Clinical Investigation. 120 (3), 883-893 (2010).
  7. Tomura, M., Itoh, K., Kanagawa, O. Naive CD4+ T lymphocytes circulate through lymphoid organs to interact with endogenous antigens and upregulate their function. Journal of Immunology. 184 (9), 4646-4653 (2010).
  8. Jennrich, S., Lee, M. H., Lynn, R. C., Dewberry, K., Debes, G. F. Tissue exit: a novel control point in the accumulation of antigen-specific CD8 T cells in the influenza a virus-infected lung. Journal of Virology. 86 (7), 3436-3445 (2012).
  9. Geherin, S. A., Wilson, R. P., Jennrich, S., Debes, G. F. CXCR4 is dispensable for T cell egress from chronically inflamed skin via the afferent lymph. PLoS One. 9 (4), e95626(2014).
  10. Brown, M. N., et al. Chemoattractant receptors and lymphocyte egress from extralymphoid tissue: changing requirements during the course of inflammation. Journal of Immunology. 185 (8), 4873-4882 (2010).
  11. Bromley, S. K., Thomas, S. Y., Luster, A. D. Chemokine receptor CCR7 guides T cell exit from peripheral tissues and entry into afferent lymphatics. Nature Immunology. 6 (9), 895-901 (2005).
  12. Gomez, D., Diehl, M. C., Crosby, E. J., Weinkopff, T., Debes, G. F. Effector T Cell Egress via Afferent Lymph Modulates Local Tissue Inflammation. Journal of Immunology. 195 (8), 3531-3536 (2015).
  13. Ohl, L., et al. CCR7 governs skin dendritic cell migration under inflammatory and steady-state conditions. Immunity. 21 (2), 279-288 (2004).
  14. Kabashima, K., et al. CXCL12-CXCR4 engagement is required for migration of cutaneous dendritic cells. American Journal of Pathology. 171 (4), 1249-1257 (2007).
  15. Cyster, J. G., Schwab, S. R. Sphingosine-1-phosphate and lymphocyte egress from lymphoid organs. Annual Review of Immunology. 30, 69-94 (2012).
  16. Matloubian, M., et al. Lymphocyte egress from thymus and peripheral lymphoid organs is dependent on S1P receptor 1. Nature. 427 (6972), 355-360 (2004).
  17. Teijeira, A., Rouzaut, A., Melero, I. Initial afferent lymphatic vessels controlling outbound leukocyte traffic from skin to lymph nodes. Frontiers in Immunology. 4, 433(2013).
  18. Hunter, M. C., Teijeira, A., Halin, C. T Cell Trafficking through Lymphatic Vessels. Frontiers in Immunology. 7, 613(2016).
  19. Bujdoso, R., Hopkins, J., Dutia, B. M., Young, P., McConnell, I. Characterization of sheep afferent lymph dendritic cells and their role in antigen carriage. Journal of Experimental Medicine. 170 (4), 1285-1301 (1989).
  20. Young, A. J. The physiology of lymphocyte migration through the single lymph node in vivo. Seminars in Immunology. 11 (2), 73-83 (1999).
  21. Seabrook, T., et al. The traffic of resting lymphocytes through delayed hypersensitivity and chronic inflammatory lesions: a dynamic equilibrium. Seminars in Immunology. 11 (2), 115-123 (1999).
  22. Swartz, M. A., et al. Mechanics of interstitial-lymphatic fluid transport: theoretical foundation and experimental validation. Journal of Biomechanics. 32 (12), 1297-1307 (1999).
  23. Macatonia, S. E., Knight, S. C., Edwards, A. J., Griffiths, S., Fryer, P. Localization of antigen on lymph node dendritic cells after exposure to the contact sensitizer fluorescein isothiocyanate. Functional and morphological studies. Journal of Experimental Medicine. 166 (6), 1654-1667 (1987).
  24. Robbiani, D. F., et al. The leukotriene C(4) transporter MRP1 regulates CCL19 (MIP-3beta, ELC)-dependent mobilization of dendritic cells to lymph nodes. Cell. 103 (4), 757-768 (2000).
  25. Roberts, E. W., et al. Critical Role for CD103(+)/CD141(+) Dendritic Cells Bearing CCR7 for Tumor Antigen Trafficking and Priming of T Cell Immunity in Melanoma. Cancer Cell. 30 (2), 324-336 (2016).
  26. Forster, R., et al. CCR7 coordinates the primary immune response by establishing functional microenvironments in secondary lymphoid organs. Cell. 99 (1), 23-33 (1999).
  27. Johnson, L. A., Jackson, D. G. The chemokine CX3CL1 promotes trafficking of dendritic cells through inflamed lymphatics. Journal of Cell Science. 126, 5259-5270 (2013).
  28. Teijeira, A., et al. T Cell Migration from Inflamed Skin to Draining Lymph Nodes Requires Intralymphatic Crawling Supported by ICAM-1/LFA-1 Interactions. Cell Reports. 18 (4), 857-865 (2017).
  29. Kilarski, W. W., et al. Intravital immunofluorescence for visualizing the microcirculatory and immune microenvironments in the mouse ear dermis. PLoS One. 8 (2), e57135(2013).
  30. Overstreet, M. G., et al. Inflammation-induced interstitial migration of effector CD4(+) T cells is dependent on integrin alphaV. Nature Immunology. 14 (9), 949-958 (2013).
  31. Russo, E., et al. Intralymphatic CCL21 Promotes Tissue Egress of Dendritic Cells through Afferent Lymphatic Vessels. Cell Reports. 14 (7), 1723-1734 (2016).
  32. Steven, P., Bock, F., Huttmann, G., Cursiefen, C. Intravital two-photon microscopy of immune cell dynamics in corneal lymphatic vessels. PLoS One. 6 (10), e26253(2011).
  33. Tomura, M., et al. Monitoring cellular movement in vivo with photoconvertible fluorescence protein "Kaede" transgenic mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA. 105 (31), 10871-10876 (2008).
  34. Shand, F. H., et al. Tracking of intertissue migration reveals the origins of tumor-infiltrating monocytes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA. 111 (21), 7771-7776 (2014).
  35. Tomura, M., et al. Tracking and quantification of dendritic cell migration and antigen trafficking between the skin and lymph nodes. Scientific Reports. 4, 6030(2014).
  36. Moran, A. E., et al. T cell receptor signal strength in Treg and iNKT cell development demonstrated by a novel fluorescent reporter mouse. Journal of Experimental Medicine. 208 (6), 1279-1289 (2011).
  37. Schmidt, T. H., Bannard, O., Gray, E. E., Cyster, J. G. CXCR4 promotes B cell egress from Peyer's patches. Journal of Experimental Medicine. 210 (6), 1099-1107 (2013).
  38. Beura, L. K., et al. T Cells in Nonlymphoid Tissues Give Rise to Lymph-Node-Resident Memory T Cells. Immunity. 48 (2), 327-338 (2018).
  39. Torcellan, T., et al. In vivo photolabeling of tumor-infiltrating cells reveals highly regulated egress of T-cell subsets from tumors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA. 114 (22), 5677-5682 (2017).
  40. Khan, T. N., Mooster, J. L., Kilgore, A. M., Osborn, J. F., Nolz, J. C. Local antigen in nonlymphoid tissue promotes resident memory CD8+ T cell formation during viral infection. Journal of Experimental Medicine. 213 (6), 951-966 (2016).
  41. Loo, C. P., et al. Lymphatic Vessels Balance Viral Dissemination and Immune Activation following Cutaneous Viral Infection. Cell Reports. 20 (13), 3176-3187 (2017).
  42. Radu, M., Chernoff, J. An in vivo assay to test blood vessel permeability. Journal of Visualized Experiments. (73), e50062(2013).
  43. Morton, A. M., et al. Endoscopic photoconversion reveals unexpectedly broad leukocyte trafficking to and from the gut. Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA. 111 (18), 6696-6701 (2014).
  44. Meeth, K., Wang, J. X., Micevic, G., Damsky, W., Bosenberg, M. W. The YUMM lines: a series of congenic mouse melanoma cell lines with defined genetic alterations. Pigment Cell Melanoma Research. 29 (5), 590-597 (2016).
  45. Demkowicz, W. E., Littaua, R. A., Wang, J., Ennis, F. A. Human cytotoxic T-cell memory: long-lived responses to vaccinia virus. Journal of Virology. 70 (4), 2627-2631 (1996).
  46. Stewart, A. J., Devlin, P. M. The history of the smallpox vaccine. Journal of Infection. 52 (5), 329-334 (2006).
  47. Hammarlund, E., et al. Duration of antiviral immunity after smallpox vaccination. Nature Medicine. 9 (9), 1131-1137 (2003).
  48. Lund, A. W., et al. Lymphatic vessels regulate immune microenvironments in human and murine melanoma. Journal of Clinical Investigation. 126 (9), 3389-3402 (2016).
  49. Tomura, M., Kabashima, K. Analysis of cell movement between skin and other anatomical sites in vivo using photoconvertible fluorescent protein "Kaede"-transgenic mice. Methods in Molecular Biology. , 279-286 (2013).
  50. Bellingan, G. J., Caldwell, H., Howie, S. E., Dransfield, I., Haslett, C. In vivo fate of the inflammatory macrophage during the resolution of inflammation: inflammatory macrophages do not die locally, but emigrate to the draining lymph nodes. Journal of Immunology. 157 (6), 2577-2585 (1996).
  51. Gautier, E. L., Ivanov, S., Lesnik, P., Randolph, G. J. Local apoptosis mediates clearance of macrophages from resolving inflammation in mice. Blood. 122 (15), 2714-2722 (2013).
  52. Abadie, V., et al. Neutrophils rapidly migrate via lymphatics after Mycobacterium bovis BCG intradermal vaccination and shuttle live bacilli to the draining lymph nodes. Blood. 106 (5), 1843-1850 (2005).
  53. Beauvillain, C., et al. CCR7 is involved in the migration of neutrophils to lymph nodes. Blood. 117 (4), 1196-1204 (2011).
  54. Rigby, D. A., Ferguson, D. J., Johnson, L. A., Jackson, D. G. Neutrophils rapidly transit inflamed lymphatic vessel endothelium via integrin-dependent proteolysis and lipoxin-induced junctional retraction. Journal of Leukocyte Biology. 98 (6), 897-912 (2015).
  55. Hanahan, D., Coussens, L. M. Accessories to the crime: functions of cells recruited to the tumor microenvironment. Cancer Cell. 21 (3), 309-322 (2012).
  56. Binnewies, M., et al. Understanding the tumor immune microenvironment (TIME) for effective therapy. Nature Medicine. 24 (5), 541-550 (2018).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Tags

Fotoconversietechniekflowcytometrie-analysetransgene Kaede-muismurine huidtumorencollagenase D-digestie405 nanometer lichtenkelcel-suspensiesdrainerende lymfeklieren
Kwantificeren van de leukocyten Egress via de lymfevaten van lymfkliertest huid en tumoren
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.