Druppel Barcoding gebaseerde eencellige Transcriptomics van volwassen zoogdieren weefsels

Samenvatting

Dit protocol worden de algemene procedures beschreven en kwaliteitscontrole controles nodig voor gezonde volwassen één zoogdiercellen voorbereiden druppel gebaseerde, hoge doorvoer eencellige RNA-Seq preparaten. Sequencing parameters, worden Lees uitlijning en downstream eencellige bioinformatic analyse ook geleverd.

Samenvatting

De analyse van genexpressie eencellige over duizenden afzonderlijke cellen binnen een weefsel of communicatie is een waardevol instrument voor identificerende cel samenstelling, discriminatie van functionele Staten, en moleculaire pathways onderliggende waargenomen weefsel functies en dierlijke gedrag. Het isolement van intact, gezonde afzonderlijke cellen van volwassen zoogdieren weefsels voor latere downstream eencellige moleculaire analyse kan echter uitdagend. Dit protocol worden de algemene procedures beschreven en kwaliteitscontrole controles nodig te verkrijgen van hoge-kwaliteit volwassen eencellige preparaten van het zenuwstelsel of huid die ingeschakeld latere onbevooroordeelde eencellige RNA sequencing en analyse. Richtsnoeren voor downstream bioinformatic analyse zijn ook beschikbaar.

Inleiding

Met de ontwikkeling van hoge-doorvoer eencellige technologie^1,2 en vooruitgang in de gebruiksvriendelijke bioinformatica tools over de laatste tien jaar³, is er een nieuw veld van high-resolution gen expressie analyse naar voren gekomen- eencellige RNA sequencing (scRNA-Seq). De studie van eencellige genexpressie ontstond eerst identificeren van heterogeniteit binnen de gedefinieerde cel populaties, zoals in stamcellen of kankercellen, of identificeren van zeldzame populaties van cellen^4,5, die met behulp van de onbereikbare waren traditionele bulk RNA sequencing technieken. Bioinformatic hulpmiddelen hebt ingeschakeld op de identificatie van nieuwe subpopulatie (Seurat)², visualisatie van de orde van cellen langs een psuedotime ruimte (Monocle)⁶, definitie van actieve signalering netwerken binnen of tussen populaties) SCHILDERACHTIGE)⁷, voorspelling van de vergadering van single-cellen in een kunstmatige 3D-ruimte (Seurat, en meer)⁸. Met deze nieuwe en opwindende analyses waarover de wetenschappelijke gemeenschap wordt scRNA-Seq fast-de nieuwe standaardbenadering voor gen expressie analyse.

Ondanks het enorme potentieel van scRNA-Seq kunnen de technische vaardigheden nodig is voor het produceren van een schone dataset en nauwkeurig om resultaten te interpreteren uitdagende aan nieuwkomers. Hier, een eenvoudige, maar uitgebreide protocol, vanaf van de isolatie van afzonderlijke cellen van de gehele primaire weefsels naar visualisatie en presentatie van gegevens voor publicatie wordt gepresenteerd (Figuur 1). Ten eerste, het isolement van gezonde enkele cellen kunt geacht uitdagende, verschillende weefsels variëren in de mate van gevoeligheid voor enzymatische spijsvertering en latere mechanische dissociatie. Dit protocol verschaft een leidraad in deze stappen van isolatie en identificeert belangrijke kwaliteitscontrole controlepunten gedurende het gehele proces. Ten tweede, inzicht in de compatibiliteit en eisen tussen eencellige technologie en de volgende generatie sequencing verwarrend kan zijn. Dit protocol biedt richtsnoeren voor de tenuitvoerlegging van een gebruiksvriendelijk, druppel gebaseerde eencellige barcoding platform en volgorde uitvoeren. Ten slotte, computerprogrammering is een belangrijke voorwaarde voor het analyseren van eencellige transcriptomic datasets. Dit protocol voorziet in middelen aan de slag met de programmeertaal R en geeft advies over de uitvoering van twee populaire scRNA-Seq-specifieke R pakketten. Samen kan dit protocol nieuwkomers bij het uitvoeren van scRNA-Seq analyse voor het verkrijgen van heldere, interpreteerbaar resultaten begeleiden. Dit protocol kan worden aangepast aan de meeste weefsels in de muis, en belangrijker kan worden aangepast voor gebruik met andere organismen, met inbegrip van menselijke weefsel. Aanpassingen afhankelijk van het weefsel en de gebruiker zal worden gevraagd.

Er zijn enkele punten waarmee u rekening moet houden terwijl het volgens dit protocol; inclusief 1) naar aanleiding van alle richtsnoeren van de kwaliteitscontrole in stappen 1 en 2 van dit protocol wordt aanbevolen om een levensvatbare interne celsuspensie van alle cellen binnen het monster van belang tegelijkertijd nauwkeurige cel Totaal aantal graven (samengevat in figuur 2 ). Zodra dit gebeurt, en als alle geoptimaliseerde voorwaarden worden gevolgd, de kwaliteitscontrole-stappen kunnen worden afgenomen (aan Bespaar tijd - behoud van RNA kwaliteit en vermindering van de cel verlies). Bevestiging van succesvolle isolatie van hoge levensvatbaarheid afzonderlijke cellen van het weefsel van belang is zeer aan te bevelen voor een stroomafwaarts verwerking. 2) Aangezien sommige celtypen gevoeliger dan anderen zijn te benadrukken, kunnen de bevolking, daarom verstorende downstream analyse per ongeluk vertekening door buitensporige dissociatie technieken. Zachte dissociatie zonder geen onnodige cellulaire schuintrekken en spijsvertering is van cruciaal belang voor het bereiken van hoge cellulaire opbrengsten en een accurate weergave van weefsel samenstelling. Schuintrekken krachten optreden tijdens de verpulvering, FACS en resuspensie stappen. 3) als met een RNA-werk, is het beste te introduceren als weinig extra RNase in het monster mogelijk tijdens de voorbereiding. Dit zal helpen handhaven van kwalitatief hoogwaardige RNA. Gebruiken ribonuclease remmer oplossingen met spoelen gereedschap reinigen en alle apparatuur die niet is RNase-gratis maar DEPC-behandelde producten vermijden. 4) voorbereidingen zo snel mogelijk uitvoeren. Dit zal helpen handhaven van kwalitatief hoogwaardige RNA en celdood te verminderen. Afhankelijk van de lengte van weefsel dissectie en dierlijke nummer, kunt u overwegen meerdere dissecties/voorbereidingen starten op hetzelfde moment. 5) bereiden cellen op ijs wanneer mogelijk te handhaven van hoge kwaliteit RNA, verminderen van celdood, en langzaam cel signalering en transcriptionele activiteit. Alhoewel, ijskoude verwerking is ideaal voor de meeste celtypes, wordt sommige celtypen (b.v., neutrofielen) beter presteren wanneer verwerkt bij kamertemperatuur. 6) Vermijd calcium, magnesium, EDTA en DEPC-behandelde producten tijdens de voorbereiding van de cel.

Protocol

Alle protocollen die hier beschreven zijn in overeenstemming met en goedgekeurd door de Universiteit van Calgary Animal Care Comité.

1. distantieert weefsel (dag 1)

1. Euthanaseren muizen met een overdosis van natrium pentobarbital (i.p., 50 mg/kg) of in voorkomend geval volgens dierenethiek protocol. Vervolgens verwijderen van ongewenste haren uit de rug en de benen van de muis en de regio van de dissectie ethanol-steriliseren.
2. Het ontleden van de weefsels of communicatie van belang. Voor dit protocol gebruiken we de huid en zenuwpijn weefsels om aan te tonen de dan van druppel barcoding gebaseerde eencellige transcriptomics volwassen weefsel dissociatie na.
   1. Voor de nervus ischiadicus, gebruik maken van de gedetailleerde protocol gevonden op Stratton et al. ⁹. de huid kort te knippen uit de buurt van de achterste regio van de rug/benen van muis. Het maken van een sneetje langs de lengte van de dij met een steriel scalpel mes. Gebruik fijne Tang en schaar bloot en verwijderen van de nervus ischiadicus.
   2. Voor de rug huid, gebruik maken van de gedetailleerde protocol gevonden bij Biernaskie et al. ¹⁰. kort, ontleden dorsale terug huid door het maken van insnijdingen van schouder aan schouder, over de rump en langs de achterkant met fijne Tang en schaar. Snijd de huid in dunne plakjes (0.5 cm dikte) met behulp van een steriel scalpel blad.
3. Wassen van weefsel 2 keer met ijskoude HBSS en verwijder ongewenste bindweefsel, vet deposito's en vuil onder een Microscoop ontleden.
   1. Voor de huid dermis alleen, zweven de plakjes in dispase (5 mg/mL, 5 U/mL) in HBSS gedurende 30-40 minuten bij 37 ° C. De opperhuid van de dermis operatief te scheiden. Negeren van de epidermis of verder van elkaar gescheiden met behulp van trypsine als van belang.
4. Mince monster in stukken van 1-2 mm met een steriel scalpel messen en zet in vers ontdooid 2 mg/mL koude collagenase-IV enzym (2 mg/mL, 125 CDU/mg, in F12 media).
   1. Gebruik voor de zenuw, ~ 500 µL per 2 x ischiadicus zenuwen. Gebruik voor de huid, ~ 8 mL per 1 x muis terug huid.
      Opmerking: De weefsels moeten volledig worden ondergedompeld in de collagenase-IV-oplossing. Het is essentieel dat elke spijsvertering enzymen zijn verwerkt, opgeslagen en op de juiste wijze bereid. Als enzymen staan bij kamertemperatuur voor langere tijd blijven, zal eencellige isolatie vereisen van overmatige mechanische verpulvering en verminderen van de levensvatbaarheid van de cellen. Collagenase-IV kan ook worden samengesteld in cel voedingsbodems waar de levensvatbaarheid van de cellen meest optimale is. Echter dit enzymactiviteit kan wijzigen of transcriptionele ondertekening moet zo worden geoptimaliseerd door de gebruiker.
5. Incubeer het monster in het enzym in een bad van 37 ° C gedurende 30 minuten met zacht schudden elke 10 min. Een shaker geplaatst bij 37 ° C is ook een passend alternatief.
6. Triturate met een pipet P1000 20 - 30 keer in 30 min na enzym toevoeging.
7. Herhaal de verpulvering elke 30 min lijkt de oplossing troebel en stukjes weefsel zijn grotendeels losgekoppeld.
   Opmerking: Zorg ervoor dat volledige release van cellen (Figuur 2b, 2 c). Om te bevestigen de volledige release, plaat cellen met NOC Blue (2 druppels per 1 mL) en na 20 min, kijk onder de Microscoop om ervoor te zorgen dat alle kernen zijn gekoppeld aan afzonderlijke cellen in plaats van puin. Het is essentieel om te controleren de mate van cel release binnen een gegeven experiment voor elke weefseltype of voorwaarde. In fibrotische weefsel (d.w.z., chronische blessure) of ongedeerd volwassen weefsel, zal de release van cellen sterk variëren van acuut letsel of embryonaal weefsel. Dit is vooral belangrijk omdat bepaalde celtypen minder kans om zich te bevrijden van het weefsel dan anderen, dus bij voorkeur met uitzondering van die cellen van downstream-analyse.
   1. Voor de zenuw, distantiëren weefsel voor 0,5-1,5 uur totale. Voor de huid, distantiëren weefsel voor 2 uur totale (in het laatste uur van incubatie, voeg DNase (1 mg/mL) aan het monster van de huid).
8. Filter tweemaal met een filter van 40 µm. Spoelen van het filter met ijskoude 1% BSA/HBSS.
9. Centrifugeer bij 260 x g gedurende 8 minuten. Verwijder de bovendrijvende vloeistof.
   1. Resuspendeer de pellet cel in HBSS met 1% BSA met behulp van een wide-boring tip en plaats op het ijs. Het volume van resuspensie is gebaseerd op volume van weefsel (800 mg versgewicht voor huid = 800 µL volume; 10 mg nat gewicht voor zenuwen = 100 µL volume).
   2. Eventueel beginnen met een lage resuspensie volume en pas vervolgens desgewenst gebaseerd op debiet (gebeurtenissen per seconde) op FACS diasorteerderweergave. De meest efficiënte sorteren dichtheid (maximaliseren van aantal cellen die zijn verzameld terwijl minimalizing tijd) voor verzamelingen is 3.000-7.000 evenementen/seconde.
10. Als met behulp van levensvatbaarheid kleurstof, nemen een subaliquot voor een onbevlekt besturingselement. Voeg vervolgens 1:15,000 levensvatbaarheid kleurstof (voorraad: 20.000 nM/µL) aan monster (eindconcentratie is 1.3 nM/µL) met behulp van een wide-boring tip om schuintrekken.
    Opmerking: Het is essentieel om te controleren of de mate van de dood van de cel binnen een gegeven experiment voor elke weefseltype of voorwaarde. Sommige celtypen binnen een steekproef zijn meer kans om te overlijden dan anderen, dus bij voorkeur worden uitgesloten van de downstream-analyse.
    1. Incubeer monster met levensvatbaarheid kleurstof voor 5-10 min op ijs in het donker. Voeg vervolgens 4 mL ijskoud 1% BSA/HBSS naar monster. Centrifugeer bij 260 x g gedurende 8 minuten te verwijderen overtollige levensvatbaarheid kleurstof. Traktatie het subaliquot met geen levensvatbaarheid kleurstof onbevlekt controle op dezelfde manier.

2. het isoleren van levensvatbare en gezonde cellen (dag 1)

1. Zorg ervoor dat de faciliteit FACS volgt passende fluorescentie geactiveerd cell sorting (FACS) parameters.
   1. Bereiden de FACS machine van tevoren om ervoor te zorgen dat het klaar is, zodra de definitieve centrifuge in stap 1 voltooid is, en zorgen dat het compartiment van de collectie koud blijft met ijsblokken.
   2. Gebruik de volgende parameters: debiet: 1.0 (overeenkomt met ongeveer 10 µL/min); Filter: 1.5 ND; Mondstuk grootte: 100 µm; Voorwaartse scatter: 80-180 V (wijzigen als dit nodig is om te onderscheiden van de grootte van gebeurtenissen); Zijde-scatter: 150-220 V (wijzigen als dit nodig is om te onderscheiden granulariteit/vorm van gebeurtenissen); Laser: 100-400 V (wijzigen als dit nodig is om te onderscheiden van levensvatbaarheid kleurstof positieve versus negatieve gebeurtenissen & sortie zulks tegen geen levensvatbaarheid kleurstof controle); Gates: Wijzigen als dit nodig is om ervoor te zorgen dat alle cellen worden verzameld. Zie figuur 2d-2 g.
      Opmerking: FACS parameters zijn sterk afhankelijk van de celtypes en de sorter werkzaam en moet derhalve worden geoptimaliseerd door de gebruiker.
2. Bereiden van 15 mL smalle onderkant buizen met 8 mL ijskoud 1% BSA/HBSS voor monstercollecties. Statische binnen buis en oppervlaktespanning kan beïnvloeden efficiëntie van de collectie. Omkeren van de buizen voor collecties om de interface tussen het oppervlak van de vloeistof en de binnenkant van de buis is vochtig.
   Opmerking: Als u werkt met zeer lage cel nummers, aanpassen aan kleine collectie vaartuig als passende.
3. Zodra alle cellen worden verzameld, centrifugeren monster bij 260 x g gedurende 8 min.
   Opmerking: Voeg vóór centrifugeren, 1% BSA/HBSS om te wassen/duwen cellen naar beneden van het oppervlak van de kant en omkeren/mix de buis direct na FACS.
4. Resuspendeer cel pellet in 1% BSA/HBSS en houd op ijs. Het maximumvolume per monster dat compatibel is met de verwerking van stap 3 is 33.8 µL, dus zorg ervoor dat cel van de laatste verdunning/resuspensie volume passend is te verkrijgen van ideale celaantal in 33.8 µL. Andere verdunning media-opties voor deze stap (en alle eerdere verdunningen in 1% BSA/HBSS) omvatten DMEM, en tot 40% serum, maar voorkomen dat calcium, magnesium of EDTA met reagentia.
   1. Laat cellen op ijs voor een minimale hoeveelheid tijd. Een ideale tref mede-werker alle apparatuur en reagentia voor de volgende stap (stap 3) tijdens de laatste stappen van stap 2.
5. Cel voorbereiding kritische controles
   1. Raming van de nummers van de cel FACS verkregen te bevestigen. Afhankelijk van weefseltype en dissociatie lengtes, puin en cellen kunnen zeer vergelijkbaar in grootte en vorm zijn. Dus, tenzij een fluorescerende verslaggever wordt gebruikt, niet FACS uitsluiten van alle puin. Het is aanbevolen dat een telling van de laatste cel nadat FACS collectie wordt uitgevoerd om te begrijpen welk percentage van gebeurtenissen (afhankelijk van FACS) in feite cellen voor een bepaald preparaat (Figuur 2 g). Uitvoeren van het aantal cellen met behulp van een hemocytometer of geautomatiseerde cel teller (tweemaal herhalen) en bereken het percentage van levensvatbare cellen dat wordt vertegenwoordigd door de totale gebeurtenissen verzameld volgens FACS machine.
   2. Valideren van voorbereiding van de cel. Valideren dat geen grote deeltjes (> 100 µm) aanwezig zijn zoals ze apparatuur in downstream stappen kunnen verstoppen. Onvoldoende verwijdering van vuil kan risico verstopping van de eencellige microfluidic-chip. Plaat resterende cellen met NOC blauw (zoals hierboven) om ervoor te zorgen dat geen grote puin fragmenten aanwezig zijn. Dit zal ook toestaan voor de bevestiging dat cellen enkelvoud zijn (dat wil zeggen, niet steken samen) geven vertrouwen dat genetische analyse van downstream eencellige vertegenwoordigt afzonderlijke cellen in plaats van meerdere cellen.
   3. Beslissen over de cel nummers in reeks: er is een groot scala aan volwassen weefsel afkomstige cel nummers per monster die kan worden geladen in het systeem met maximaal 8 samples die tegelijk kunnen worden uitgevoerd. Auteurs hebben geladen ergens uit 500-50.000 cellen per monster en goede kwaliteit scRNA-Seq datasets verkregen. Meer discussie over de meest geschikte mobiele nummers te laden kan worden gevonden in de sectie discussie. De uiteindelijke uitvoer van gesequenceerd cel nummers is sterk afhankelijk van de kwaliteit van single-cellen geïsoleerd. Laden van 10.000 volwassen weefsel-afgeleide cellen kunt terugkeren overal van 1.000 naar 4.000 gesequenceerd cellen (10-40% rendement). Indien geïnteresseerd in sequencing hoge cel nummers (~ 10.000 cellen, het maximum aantal aanbevolen voor dit systeem), zal dan laden 25.000-100.000 cellen worden verlangd.

3. GEM (Gel kraal in emulsie) generatie en Barcoding (dag 1)

Opmerking: Stap 3-6 van dit protocol zijn ontworpen om te worden gebruikt in combinatie met de meest voorkomende microdroplet gebaseerde eencellige platform, vervaardigd door 10 X Genomics. Gedetailleerde richtsnoeren voor stap 3 en 4 worden beschreven in de fabrikant protocol (verwijs naar het Chroom eencellige 3' protocol)^11,12 , en moeten worden gevolgd in combinatie met dit protocol. Voor de beste resultaten moet stap 3 op dag 1 van dit protocol onmiddellijk na dissociatie (stap 1) en cel isolatie (stap 2) stappen worden ingevuld.

1. Chip volgens de fabrikant protocol ^11,12voor te bereiden. Dit eencellige microdroplet gebaseerde platform maakt gebruik van technologie die monsters ~ 750.000 barcodes transcriptome van elke cel apart te indexeren. Dit wordt bereikt door het verdelen van cellen in Gel kraal in emulsies (edelstenen) waar gegenereerde cDNA delen een gemeenschappelijke barcode. Tijdens het genereren van de GEM, cellen worden geleverd, zodat de meerderheid (90-99%) van de gegenereerde edelstenen bevatten geen cellen, terwijl de rest, voor het grootste deel, een eencellige bevatten.
   1. Plaats de chip in de houder van de chip.
   2. De master mix cel op ijs bereiden.
   3. Voeg toe 50% glycerol aan ongebruikte putjes en voeg 90 µL van de cel master mix goed 1, 90 µL van gel parels te goed 2, en 270 µL van het partitioneren van de olie goed 3.
   4. Betrekking hebben op de chip met de pakking.
2. Laden van de chip en uitvoeren in een eencellige controller.
   1. Het Dienblad uitwerpen, plaats van de chip in lade intrekken van de lade en druk op Play. Een enkele cel 3' gel kraal in een Juweeltje bevat inleidingen met een partiële sequentie van Illumina R1 (Lees 1 sequencing primer), een 16 nucleotiden (nt) 10 x Barcode, een 10 nt unieke moleculaire Identifier (UMI), en een reeks van poly-dT primer. Tijdens de run, zijn gel kralen in de controller vrijgegeven en gemengd met cel lysate en master mix.
   2. Het verzamelen van 100 µL van het monster en de plaats in een PCR-buis.
   3. Plaats PCR buizen in vooraf ingestelde PCR machine en uitvoeren van de PCR volgens de kit. Na incubatie, GEMs zal omvatten full-length, barcoded cDNA van poly-adenylated mRNA.
3. Na de run, plaats bij-20 ° C's nachts voor maximaal 1 week vóór het voordat aan de volgende stap.

4. clean-Up, versterking, de bouw van de bibliotheek en bibliotheek kwantificering (dag 2)

Opmerking: Gedetailleerde richtsnoeren voor stap 4 in de fabrikant protocol ^11,12, worden beschreven en moeten worden gevolgd in combinatie met dit protocol.

1. Gebruik silane magnetische kralen om overgebleven biochemische reagentia/inleidingen van GEM reactiemengsel.
2. Amplify full-length, barcoded cDNA voor het genereren van voldoende massa voor de bouw van de bibliotheek.
3. DNA opbrengst te beoordelen. Voorafgaand aan de bouw van de bibliotheek, DNA opbrengst van het monster te beoordelen. Dit zal bepalen hoeveel cycli gebruiken in downstream PCR stap (monster Index PCR tijdens de bouw van de bibliotheek). Afhankelijk van de inhoud van de RNA van een monster, die afhankelijk van activering Staten (bv, controle vs gewond, enz.), variëren kan celtype, en de opbrengst van de cel, kan het aanbevolen cyclus aantal veranderen.
   1. Voor sequencing ~ 3.000 weefsel-afgeleide cellen (niet relevant voor activering Staten), hebben de auteurs gevonden die 14 cycli (monsters: ~ 10-100 ng DNA) is standaard.
   2. Gebruik een Bioanalyzer voor DNA-analyse. Verwijzen naar de gebruiker begeleiden¹³.
4. Fragment van de steekproef en selecteer de grootte van DNA. Voorafgaand aan de bouw van de bibliotheek, enzymatische fragmentatie en grootte selectie protocollen te verkrijgen van de juiste cDNA amplicon grootte te gebruiken.
5. Monster voorbereiden bibliotheek bouw. Terwijl R1 (Lees 1 primer reeks) wordt toegevoegd aan de moleculen tijdens GEM incubatie; P5, een P7 (een monster index), en R2 (Lees 2 primer volgorde) worden toegevoegd tijdens de bouw van de bibliotheek.
6. DNA opbrengst te beoordelen. Meeste sequencing faciliteiten vereisen indiening van uiteindelijke bibliotheken die DNA opbrengst en kwaliteit informatie bevatten. Zo moet de bioanalyzer na de voltooiing van de gehele protocol en vóór het vervoer naar de sequencing-faciliteit uitgevoerd.
7. Opslaan monsters bij-80 ° C voor maximaal 2 maanden.
8. Voordat sequencing, monsters met behulp van een DNA kwantificering kit te kwantificeren. Dit kan worden gedaan bij de sequencing-faciliteit.

5. bibliotheek Sequencing (dag 3)

Opmerking: De eencellige transcriptome barcoding platform gebruikt in dit protocol genereert Illumina-compatibele gekoppeld-einde bibliotheken begint en eindigt met P5 en P7 sequenties. Hoewel minimum diepte nodig om op te lossen celtype identiteit kunnen zo weinig als 10.000-50.000 leest/cel^15,16, wordt ~ 100.000 leest/cel aanbevolen als een optimale kosten-dekking inruil voor volwassen in vivo cellen (rekening houdend met een cel typen of minimaal geactiveerde cel Staten zal bereiken verzadiging bij 30.000-50.000 leest/cel).

1. Vervoer van cDNA bibliotheken op droog ijs aan een sequencing inrichting voorzien van een passende Illumina sequencer.
2. De volgende informatie verstrekken aan de sequencing-faciliteit:
   1. Bijzonderheden van de steekproef: proeven van de index-id overeenkomt met elke bibliotheek; soorten; genomic database voor primaire vergadering (d.w.z., GRCm38 voor muis); electropherogram tonen van de maten van het fragment van de bioanalyzer (tussen 200 en 9.000 bp); cDNA concentratie (ng/µL) en de bibliotheek van de totale concentratie (totale opbrengsten variëren van 200 – 1400 ng); hoeveelheid (µL) monster.
   2. Bieden van sequencing aanvragen: kwantificeren van de monsters met behulp van een DNA kwantificering kit; adapter/Indextype (TruSeq DNA); plaat type (Eppendorf twin.tec, Full Skirt - aanbevolen voor DNA); sequencing technologie/bibliotheek (10 x, volledige sequencing instructies en aanbevelingen van de cyclus)¹⁷.
3. Uitvoeren van ondiepe sequencing (optioneel): Studies analyseren meerdere biologische monsters zullen profiteren van de bundeling van monsters (aggregatie) voor het genereren van een enkel gen-barcode matrix met gegevens uit alle monsters. Om te minimaliseren van batch-effecten tussen monsters als pooling, moet de Lees diepte tussen verschillende bibliotheken worden gestandaardiseerd. Om dit te doen, is een nauwkeurige benadering van eencellige getallen nodig. De sequencer MiSeq zal toestaan ondiepe sequencing en is een rendabele, praktische manier om nauwkeurige cel schattingen.
   Opmerking: Een run met behulp van een MiSeq SR50 sequencer biedt voldoende dekking voor het nauwkeurig inschatten van ongeveer 20.000 cellen. Dit punt zal bij benadering het aantal UMI hersteld voor elke unieke barcode. In Figuur 3a, de kop van een voorbeeld (monster 1.6) output (.csv) wordt weergegeven, aanbieding barcodes en de overeenkomstige UMI telt zoals bepaald door vertrouwen toegewezen leest.
   1. Overleg met een bioinformaticus vertrouwd te maken met de programmeertaal R. Verwijzen naar de DataCamp leerprogramma's voor meer informatie¹⁸.
   2. Ruwe gegevens verkregen uit de sequencer met behulp van het meegeleverde R script als een sjabloon¹⁹te beoordelen. Ruwe gegevens verwijst naar aantal UMIs toegewezen aan elke cel van de unieke barcode. Het script leest een CSV-bestand waar de eerste kolom is een lijst van barcodes en de tweede kolom de corresponderende UMI telt. Dit script zorgt voor een perceel (Figuur 3b) alsook het geschatte aantal barcoded cellen in elk monster. Script om ervoor te zorgen dat de ingevoerde aantal UMI telt voor een monster op het punt een derde van de eerste steile daling aanpassen. In Figuur 3bvalt deze elleboog ongeveer 225 UMIs overeenkomt met 3,480 barcoded cellen.
   3. Vergelijkbaar met full-diepte sequencing met behulp van HiSeq (waar 3,516 cellen werden met succes sequenced, Figuur 3 c), ondiepe sequencing schattingen voorspelde 3,480 cellen.
4. Gebruik cel herstel benaderingen (uit stap 5.3) of gebruik de grafiek van herstel gevonden in van de fabrikant protocol²⁰ plannen lane distributie voor het diepere rangschikken. Elk monster moet ontvangen vergelijkbare dekking, dus als ondiepe sequencing blijkt dat er verschillende aantallen cellen in elk monster (dat is vaak het geval) dan lane verdeling dienovereenkomstig moet worden berekend. Één HiSeq stroom cel (die bestaat uit 8 rijstroken) kan het volgnummer van maximaal 2,4 miljard aangepaste gepaarde einde leest. Voorbeeld stroom cel set-up wordt gepresenteerd in figuur 3d.

6. verwerking van de bestanden lezen

Opmerking: Een eencellige 3' bibliotheek met behulp van dit protocol Sequencing produceert ruwe gegevens in binaire basis oproep (BCL) formaat. De Cell Ranger pakket wordt gebruikt voor het genereren van tekst gebaseerde FASTQ bestanden van BCL-bestanden, voert u genomic en transcriptomic uitlijning, gene graven, demultiplexing en aggregatie van monsters. In dit gedeelte de belangrijkste stappen waarmee gebruikers kunnen rauwe BCL data downloaden van een faciliteit sequencing en genereren van gefilterde gen-barcode matrices klaar voor downstream bioinformatics wordt gepresenteerd.

1. Een gecentraliseerde server gebruiken voor het uitvoeren van het programma. BCL bestanden, FASTQ bestanden en allermeest naar de downstream bioinformatics verwerking vereist aanzienlijke rekenkracht.
2. Download alle raw Lees-bestanden op de server (of FASTQ bestanden als deze beschikbaar zijn).
   1. Overleg met de beheerder van de server aan opstelling een rekening op een gecentraliseerde server of dat cluster en maak kennis met Unix²¹.
   2. De opdracht een fetch geschikt is voor het besturingssysteem van de server alle bestanden van server te downloaden van de faciliteit van het rangschikken.
      1. Meeste sequencing faciliteiten bieden een opdracht voor het downloaden van bestanden vanaf een veilige pad dat kan worden uitgevoerd vanaf de opdrachtregel (zie voorbeeld hieronder).
      2. Vervangen van de "< gebruikersnaam >" en "< wachtwoord >" tijdelijke aanduidingen in de command line met referenties verstrekt.
         wget - O - "https://your_sequencing_facilitys_server.com/path_to_raw_read_files/--neen-cookies--neen-selectievakje-certificaat--na gegevens ' j_username = gebruikersnaam & j_password = wachtwoord ' | wget--neen-cookies--neen-selectievakje-certificaat--na gegevens ' j_username = gebruikersnaam & j_password = wachtwoord ' - ci -
   3. Dit pad invoegen een opdracht fetch als alleen een absoluut pad naar bestanden wordt verstrekt (d.w.z. https://your_sequencing_facilitys_server.com/path_to_raw_read_files/).
3. Unzip bestanden: als bestanden met de extensie ".gz" einde hebt gedownload, is het gecomprimeerd met behulp van de opdracht "gzip". Om unzip, unzip run commando in de command line (Zie het voorbeeld hieronder).
   gunzip raw_read_files.gz
4. Download de nieuwste versie van Cell Ranger op de server als een op zichzelf staand .tar²².
   1. Kritisch: Controleer het linuxsysteem voldoet aan minimale vereisten²³vóór download. Zorgen voor een minimum van 8-core Intel-processor met 64 GB RAM en 1 TB aan schijfruimte.
      Opmerking: Cell Ranger biedt pre-built menselijke en knaagdier referentie transcriptomes. Deze kunnen worden gewijzigd met behulp van cellranger mkref opdracht genen zoals GFP²⁴.
5. Genereren FASTQ bestanden uit de sequencer basis oproep (BCLs) opdracht gebruiken om bestanden cellranger mkfastq.
   Opmerking: Het programma zal uitlijnen rauwe leest (uit FASTQ bestanden) aan het genoom van een referentie en gen-cel matrices voor downstream analyse te genereren. STAR-aligner waarmee splicing-aware uitlijning van leest aan het genoom van een verwijzing wordt gebruikt. Enige vertrouwen toegewezen leest (dat wil zeggen, leest compatibel met een enkel gen annotatie) worden gebruikt voor het UMI tellen.
   1. Bijvoorbeeld, de opdracht cellranger mkfastq:
      cellranger mkfastq --id = sample_name \
      --uitvoeren van = / pad/naar/monster \
      --csv=csv_file_containing_lane_sample_index.csv
6. Cellranger graaf op FASTQ bestanden gegenereerd met behulp van mkfastq voor het genereren van eencellige gene tellingen uitvoeren.
   1. Bijvoorbeeld, de opdracht cellranger tellen:
      cellranger graaf --id = sample_name \
      --transcriptome = refdata-cellranger-mm10-1.2.0 \
      --fastqs = / absolute/pad/naar/fastq/bestanden \
      --monster = same_sample_name_supplied_to_cellranger_mkfastq \
      --localcores = 30
7. Multi bibliotheek aggregatie (optioneel): combineren van monsters te bundelen cellranger graaf uitgangen met behulp van cellranger aggr. Dit resulteert in een enkel gen-barcode matrix met gegevens uit meerdere bibliotheken gebundeld. Cellranger aggr voorbeeldopdracht:
   CellRanger aggr--id = sample_name \
   --csv = csv_with_libraryID_ & _path_to_molecule_h5.csv \
   --normaliseren = toegewezen
   Opmerking: Bibliotheken kunnen worden samengevoegd met behulp van de drie normalisatie-modi (toegewezen, rauw, niets). Toegewezen wordt aanbevolen omdat het deelmonsters hoger-diepte bibliotheken totdat alle bibliotheken gelijke sequencing diepte^{25 hebben}.
8. Voor directe visualisatie/analyse van gegevens, door de .cloupe output bestand (gegenereerd met behulp van cellranger count of cellranger aggr) te importeren in 10 x Loupe cel Browser²⁶.

7. geavanceerde analyse van scRNA-Seq Datasets

Opmerking: Een volledige scRNA-Seq tools database kan worden gevonden op scRNA-tools^3,27. Hieronder is een kader voor ongecontroleerde cel clustering met behulp van Seurat² en pseudotemporal bestellen Monocle⁶gebruikt. Hoewel veel van dit werk kan worden gedaan op een lokale computer, wordt er in de volgende stappen wordt uitgegaan dat berekening met behulp van een institutionele server zal worden afgerond.

1. Download de meest recente versie van de Miniconda op server-account met behulp van de Linux platform²⁸.
2. Installeer de nieuwste versie van R met behulp van conda²⁹.
3. Gegevens met behulp van het meegeleverde Seurat R script als een sjabloon³⁰uitzetten.
   Opmerking: Seurat is een R gebaseerde toolkit waarmee kwaliteitscontroles, clustering, differentiële gen expressie analyse, marker gene identificatie, vermindering van dimensionaliteit en visualisatie van scRNA-Seq gegevens. Een uitgebreide beschrijving van Seurat codering en tutorials kan worden gevonden op de website Satija Lab³¹.
4. Gegevens met behulp van het meegeleverde Monocle R script als een sjabloon³²uitzetten.
   Opmerking: Monocle is een andere R gebaseerde toolkit waarmee visualisatie van expressie veranderingen over pseudotime en identificeert genen aan cel lot beslissingen ten grondslag. Een uitgebreide beschrijving van de Monocle codering en tutorials kan worden gevonden op de Monocle website³³.
5. R-pakketten zoals kBET kunnen worden gebruikt om te testen en corrigeren van batch effecten als gevolg van het poolen van datasets³⁴.

8. Het NCBI GEO en SRA inzendingen

Opmerking: Aangezien de gemakkelijke toegang tot rauwe sequencing bestanden zorgen reproduceerbaarheid en reanalysis, accessioned inzendingen tot online openbaar repositories zijn aanbevolen of vereist voorafgaand aan de indiening van de manuscript. National Center for Biotechnology Information (NCBI) Gene Expression Omnibus (GEO) en volgorde lezen archief (SRA) zijn publiek toegankelijke gegevens repositories voor high-throughput sequencing gegevens^35,36.

1. Inschrijven voor de NCBI GEO Submitter rekening³⁷.
2. Complete GEO indienen waarin drie componenten gecompileerd in een directory/map (getiteld als van de indiener van de GEO gebruikersnaam): 1) Metadata record (één werkblad per project indienen); 2) raw Data-bestanden; 3) verwerkte gegevensbestanden.
   1. Downloaden en uitvoeren van de metagegevens werkblad³⁸. De volgende openbare GEO indiening kan worden gebruikt als een gids (GSE100320)³⁹. Het werkblad in de map plaatsen.
   2. Plaats Raw Data-bestanden gegenereerd op basis van cellranger tellen script voor alle bibliotheken in de directory.
   3. Plaats verwerkt gegevensbestanden (gefilterde barcodes.tsv, genes.tsv en matrix.mtx) gegenereerd vanuit cellranger tellen script voor alle bibliotheken in de directory.
3. GEO indiener van FTP server referenties overbrengen van map met alle drie de componenten gebruiken Voor Linux/Unix gebruikers: ncftp lftp, ftp, sftp en ncftpput kunnen worden gebruikt.
4. Melden GEO voor alle overdrachten³⁸.

Resultaten

Het repertoire van open source pakketten ontworpen om te analyseren scRNA-Seq datasets dramatisch gestegen⁴⁰ met de meerderheid van deze pakketten gebruik R gebaseerde talen³. Hier, representatieve resultaten met behulp van twee van deze pakketten worden gepresenteerd: beoordeling van ongecontroleerde groepering van enkele cellen op basis van genexpressie en bestellen van afzonderlijke cellen langs een traject om te lossen cel heterogeniteit en deconstrueren biologische processen.

Figuur 4 illustreert het gebruik van Seurat voor voorbehandeling kwaliteitscontroles en downstream bioinformatics analyse. Ten eerste, filtratie en verwijdering van afwijkende cellen uit de analyse is noodzakelijk om de controle van de kwaliteit. Dit werd gedaan met behulp van viool (figuur 4a) en scatter percelen (figuur 4b) te visualiseren van het percentage van de mitochondriale genen, aantal genen (nGene) en aantal UMI (nUMI) om cel paren en uitschieters te identificeren. Een cel met een duidelijke uitbijter aantal genen, UMI of percentage van mitochondriale genen is verwijderd met behulp van Seurat de FilterCells functie. Aangezien Seurat gebruikt belangrijkste component (PC) analyse scores aan clusters cellen, bepalen van statistisch significante PC's op te nemen is een cruciale stap. Elleboog percelen (Figuur 4 c) werden gebruikt voor de selectie van de PC, in welke PC's buiten het plateau van de "standaarddeviatie van PC' as werden uitgesloten. De resolutie van clustering werd ook gemanipuleerd waaruit blijkt dat het aantal clusters kan worden gewijzigd, variërend van 0.4 (lage resolutie leidt tot minder cel clusters, Figuur 4 d) tot en met 4 (hoge resolutie leidt tot hogere cel clusters, figuur 4e ). Met een lage resolutie is het waarschijnlijk dat elk cluster een bepaald celtype vertegenwoordigt, overwegende dat bij hoge resolutie dit ook subtypen of tijdelijke Staten van een celpopulatie betekenen kan. In dit geval werden met een lage resolutie cluster instellingen gebruikt voor het verder analyseren expressie heatmaps (met behulp van Seurat DoHeatmap functie) om de hoogst uitgedrukte genen in een bepaald cluster (figuur 4f) te identificeren. In dit geval werden de hoogst uitgedrukte genen geïdentificeerd door het beoordelen van differentiële expressie in een bepaald cluster ten opzichte van alle andere clusters gecombineerd, waaruit blijkt dat elk cluster een unieke werd vertegenwoordigd door gedefinieerde genen. Bovendien kunnen individuele kandidaat-genen worden gevisualiseerd op percelen van de tSNE met behulp van Seurat de FeaturePlot functie (Figuur 4 g). Dit toegestaan voor ontcijferen of er clusters die macrofagen vertegenwoordigd waren. Met behulp van FeaturePlot, vonden we dat beide cluster 2 en 4 waren Cd68 - een marker van de pan-macrofaag uitdrukken.

De Monocle-pakket werd gebruikt voor ondersteunend cel clusters geïdentificeerd in Seurat, en voor het bouwen van cel trajecten, of door pseudotemporal te bestellen, te recapituleren biologische processen (Figuur 5). Bestellen van de pseudotemporal kan worden gebruikt voor monsters waar eencellige expressieprofielen verwachting te volgen van een biologische tijdsverloop. Cellen kunnen besteld worden langs een continuüm van pseudotemporal om op te lossen tussentijdse staten, bifurcatie punten van twee alternatieve cel lot, en gene handtekeningen ten grondslag liggen aan de verwerving van elk lot te identificeren. Ten eerste, vergelijkbaar met de Seurat filtratie, kwalitatief slechte cellen werden verwijderd, zodat de verdeling van mRNA over alle cellen log normaal en viel tussen de bovenste en onderste grenzen was zoals aangegeven in figuur 5a. Vervolgens met de Monocle newCellTypeHierarchy functie, afzonderlijke cellen werden ingedeeld en geteld met behulp van bekende afstamming markers (Figuur 5b, 5 c). Bijvoorbeeld, werden cellen, uiting geven aan de PDGF receptor Alfa- of Fibroblast specifieke eiwitten 1 toegewezen aan de cel Type #1 maken een criterium voor het definiëren van fibroblasten. Vervolgens werd deze populatie (cel Type #1) beoordeeld om te ontcijferen fibroblast trajecten. Om dit te doen, werd de Monocle differentiële GeneTest functie gebruikt, die ten opzichte van de cellen die de extreme lidstaten binnen de bevolking vertegenwoordigt en differentiële genen gevonden voor het bestellen van de resterende cellen onder de bevolking (Figuur 5 d). Spruitstuk leermethoden (een type van vermindering van de niet-lineaire dimensionaliteit) toe te passen op alle cellen, was een coördinaat langs een pseudotemporal pad toegewezen. Dit traject werd vervolgens gevisualiseerd door cel staat (figuur 5e) en pseudotime (figuur 5f).

Figuur 1: stroomschema. Stappen van hele dieren voorbereiding naar het analyseren van één cel RNA-Seq datasets tot het indienen van de definitieve datasets in een openbaar archief. Gel kralen in emulsie (edelstenen) verwijzen naar kralen met barcoded oligonucleotides, die weer duizenden afzonderlijke cellen inkapselen. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figuur 2: creëren van levensvatbare interne celsuspensie van zenuwweefsel. (a) cartoon overzicht van kwaliteitscontroles. (b) cellen en puin met cellen nog steeds opgenomen in puin (rode pijlen). (c) cellen vrijgelaten uit puin (rode pijlen). (d) cel isolatie door FACS. P0: puin breuk; P1: cel-achtige breuk; P3: uitsluiting van duplets; P4: levensvatbaarheid kleurstof (Sytox Orange) negatieve breuk. (e) geen levensvatbaarheid kleurstof controle. (f) afbeelding P0 fractie vertegenwoordigen geïsoleerd puin. (g) afbeelding P4 fractie vertegenwoordigen geïsoleerd levensvatbare cellen (rode pijlen). (b) (c) (f) en (g) had nucleaire kleurstof toegevoegd 20 minuten voor de beeldvorming. Schaal Bars: 80 µm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figuur 3: ondiepe sequencing voorspelt het aantal herstelde cellen in 10 X verwerkte monsters. (a) een voorbeeld (monster 1.6) voor MiSeq-gegenereerd csv aanbieding cel barcodes en de bijbehorende UMI wordt geteld zoals bepaald door vertrouwen toegewezen leest. (b) Barcode rangschikking perceel voor monster 1.6 toont een aanzienlijke daling in UMI tellen als een functie van de cel barcodes. De onderbroken en ononderbroken lijnen geven de cutoff tussen cellen en achtergrond zoals bepaald door de visuele inspectie. (c) cel barcodes waargenomen met behulp van de Cell Ranger pijpleiding post-HiSeq onthult ondiepe sequencing benaderd nauwkeurig het aantal cellen voor monster 1.6. (d) een voorbeeld van een set-up van de stroom-cel op basis van ondiepe sequencing afgeleide ramingen van de cel. Monster 1.6, aangezien ondiepe sequencing voorspeld 3480 cellen, 1,17 rijstroken waren toegewezen om > 100.000 leest per cel sequencing dekking in HiSeq. Opmerking: Alle rijstroken moeten toevoegen aan 100%. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figuur 4: kwaliteitscontrole en bio-informatica van eencellige RNA-Seq dataset met behulp van Seurat R package. (a) percelen van kwaliteitscontrole metrics, waaronder een aantal genen, aantal unieke moleculaire identificatoren (UMIs) en het percentage van afschriften toewijzen aan het mitochondriaal genoom. (b) monster gene percelen detecting cellen met afwijkende niveaus van mitochondriale afschriften en UMIs. (c) monster elleboog plot gebruikt voor ad hoc bepaling van statistisch significante PC's. De onderbroken en stip onderbroken lijnen geven de cutoff wanneer een duidelijke "elleboog" zich manifesteert in de grafiek. PC afmetingen vóór deze elleboog zijn opgenomen in de downstream-analyse. (d, e) Grafiek gebaseerde cel clusters gevisualiseerd met twee verschillende resoluties in een laag-dimensionale ruimte met behulp van een perceel van tSNE. (f) de bovenste markering genen (geel) voor elk cluster gevisualiseerd op een expressie heatmap met behulp van Seurat de DoHeatmap functie. (g) visualiseren marker expressie van, bijvoorbeeld, Cd68 gen vertegenwoordigen macrofagen (paars) met behulp van Seurat de FeaturePlot functie. Dit suggereert dat cluster 2 en 4 (in deelvenster d) van deze dataset vertegenwoordigt macrofagen. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figuur 5: cel categorisatie en bestellen langs peudotemporal traject met Monocle toolkit. (a) de verdeling van mRNA (afgeleid van de graven van de UMI) over alle cellen in een monster van de inspectie. Alleen cellen met mRNA tussen 0 - ~ 20.000 werden gebruikt voor downstream-analyse. (b, c) Toewijzen en tellen celtypes gebaseerd op bekende afstamming cel markeringen. Bijvoorbeeld, cellen, uiting geven aan de PDGF receptor Alfa- of Fibroblast specifieke eiwitten 1 werden toegewezen aan de cel Type #1 pan-fibroblasten vertegenwoordigen Monocle de newCellTypeHierarchy functie. Aantal verschillende soorten cellen kan worden gevisualiseerd, een cirkeldiagram (b) en als een tabel (c). (d) het gebruikmaken van cel Type #1 (fibroblasten) als voorbeeld, de genen voor het bestellen van cellen kunnen worden gevisualiseerd met behulp van een scatterplot waaruit gene dispersie vs. gemiddelde expressie gebruikt. De rode curve toont de cutoff voor genen gebruikt voor het bestellen van berekend door het gemiddelde-variantie-model met behulp van de Monocle estimateDispersions functie. Genen die voldoen aan deze cutoff werden gebruikt voor downstream pseudotime bestellen. (e, f) Visualisatie van cel trajecten in een verminderde twee-dimensionale ruimte gekleurd door de cel "staat" (e), en de Monocle-toegewezen "Pseudotime" (f). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Discussie

Dit protocol wordt gedemonstreerd hoe de juiste voorbereiding van afzonderlijke cellen kunt ontdekken de transcriptionele heterogeniteit van duizenden afzonderlijke cellen en discrimineren van functionele Staten of unieke cellulaire identiteiten binnen een weefsel. Het protocol vereist geen fluorescerende verslaggever eiwitten of transgene tools en kan worden toegepast op de isolatie van afzonderlijke cellen van diverse weefsels van belang, met inbegrip van die van de mens; rekening houdend met elk weefsel is uniek en dit protocol vergt een zekere mate van aanpassing/wijziging.

De gevarieerde en hoogdynamische transcriptionele programma's binnen cellen hebben gewezen op de waarde van één cel genomica. Afgezien van het isoleren van kwalitatief hoogwaardige RNA, een kritische monster voorbereiding stap nodig voor hoge kwaliteit datasets is ervoor te zorgen dat cellen volledig uit weefsel vrijgelaten worden en dat cellen gezond en intact zijn. Dit is relatief ongecompliceerd voor het verzamelen van cellen die gemakkelijk zijn uitgebracht, zoals de circulerende cellen of weefsels waar cellen losjes behouden zijn, zoals lymfoïde weefsels. Maar dit kan uitdagend zijn voor andere volwassen weefsels, vanwege de hoogontwikkelde cellulaire architectuur, verspreid over grote afstanden, omringende extracellulaire matrix en de vaak-stijve cytoskeletal eiwitten die betrokken zijn bij het handhaven van de celstructuur. Zelfs met de juiste dissociatie technieken voor de volledige release van cellen is er potentieel dat de verwerking van het strenge en vaak langdurig vereist mRNA kwaliteit en cel integriteit zou veranderen. Bovendien, de hoge temperaturen gebruikt voor dissociatie van het enzym-bijgewoonde ook invloed op transcriptionele handtekeningen^29,30. De bedoeling van het protocol is te presenteren van kwaliteitscontrole controles, met behulp van weefsels zoals de myelinated volwassen zenuw en de extracellulaire matrix-rijke volwassen huid, om aan te tonen hoe optimalisatie kan helpen om deze obstakels te overwinnen.

Een belangrijke overweging bij het ontwerpen van een scRNA-Seq-experiment is de keuze van sequencing diepte. Sequentie kan worden zeer multiplexed en lees diepte kan variëren van zeer lage Drop-Seq² tot maximaal 5 miljoen leest/cel¹⁴ via een full-length RNA-Seq-methode zoals Smart-Seq. gebruikt wordt De meeste scRNA-Seq experimenten kunnen detecteren matige tot hoge expressie chat-kopieën met sequencing zo laag als 10.000 leest/cel, die is meestal voldoende voor cel type indeling^41,42. Ondiepe sequencing diepte is van belang om te besparen op sequencing kosten wanneer het proberen om het detecteren van zeldzame cel populaties in complexe weefsels waar duizenden cellen nodig zijn kunnen om vol vertrouwen het toeschrijven van zeldzame populaties. Maar ondiepe diepte rangschikken is niet voldoende wanneer gedetailleerde informatie over de expressie van genen en processen gekoppeld aan subtiele transcriptionele handtekeningen nodig is. Op dit moment geschat wordt dat de grote meerderheid van de genen in een cel worden gedetecteerd met 500.000 leest/cel, maar dit afhankelijk van het protocol variëren kan en weefsel Typ^43,44. Terwijl full-length transcript sequencing de noodzaak voor montage omzeilt en daarom roman of zeldzame splice varianten detecteren kan, beperken sequencing kosten vaak schalen van dergelijke benaderingen te onderzoeken van duizenden cellen bestaande uit een complex weefsel systeem. In tegenstelling, 3' gelabeld eencellige bibliotheken zoals beschreven in dit protocol meestal degenen lagere complexiteit hebben en ondieper sequencing. Het is belangrijk op te merken dat bibliotheken gegenereerd met behulp van het protocol beschreven sequenced kunnen worden op een van de vijf ondersteunde sequencers: 1) NovaSeq 2) HiSeq 3000/4000, 3) HiSeq 2500 snelle Run en hoge Output, 4) NextSeq 500/550 en 5) MiSeq.

Een alternatieve aanpak van eencellige RNA-Seq, dat vermindert de noodzaak voor delicate weefsels en cellen die behandeling nog enkele van de voordelen van eencellige RNA-Seq handhaaft, is de analyse van RNA enkele kernen €⁴⁵. Deze benadering kunt een snellere verwerking vermindering van de aantasting van het RNA en meer extreme maatregelen om adequate versie van kernen te verzekeren en dus waarschijnlijk voor een zekerder vangst van de transcriptionele profielen vertegenwoordigen alle cellen binnen een bepaald weefsel. Dit zou natuurlijk bieden alleen een gedeelte van de transcriptionele activiteit aanwezig binnen een bepaalde cel, dus afhankelijk van wat de experimentele doelstellingen van belang deze aanpak kan al dan niet geschikt zijn.

Naast de volledige karakterisering van cellulaire identiteiten binnen een bepaald weefsel is een van de meest waardevolle analyses voor scRNA-Seq gegevenssets de beoordeling van tussenliggende transcriptionele Staten over 'omschreven' cel populaties. Deze intermediaire Staten kunnen geven inzicht in de bloedlijn relaties tussen cellen binnen geïdentificeerde bevolkingsgroepen, die niet kon met traditionele bulk die RNA-Seq benadert. Diverse scRNA-Seq bioinformatic hulpmiddelen zijn nu ontwikkeld om te verduidelijken dit. Dergelijke instrumenten kunnen beoordelen de processen betrokken bij bijvoorbeeld kankercellen overgang naar een oncogene/metastatische staat, stamcellen rijpen in uiteenlopende terminal lot of immuuncellen pendelen tussen actieve en rustige staten. Subtiele transcriptome verschillen in cellen kunnen ook worden indicatieve van lineage vooroordelen dat onlangs ontwikkelde bioinformatic hulpmiddelen zoals FateID,⁴⁷kunnen afleiden. Aangezien het onderscheid tussen de overgang van de cellen moeilijk kunnen zijn kunnen om na te gaan gezien de transcriptionele verschillen subtiel, diepere sequencing kan nodig⁴⁶. Gelukkig kan de dekking van een ondiep gesequenceerd bibliotheek worden verhoogd indien geïnteresseerd in het sonderen van de dataset verder door de bibliotheek opnieuw uit te voeren op een andere cel van de stroom.

Samen genomen, biedt dit protocol een gemakkelijk-aan-adapt workflow waarmee gebruikers transcriptionally profileren honderden tot duizenden single-cellen binnen één experiment. De uiteindelijke kwaliteit van een scRNA-Seq-dataset is afhankelijk van geoptimaliseerde cel isolatie, stroom cytometry, cDNA Bibliotheek generatie en interpretatie van de ruwe gen-barcode matrices. Te dien einde biedt dit protocol een uitgebreid overzicht van alle belangrijke stappen die moeiteloos kunnen worden gewijzigd zodat de studies van verschillende weefseltypes (HLA).

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Producten
RNAse out	Biosciences	786-70
Pentobarbital natrium	Euthanyl		50mg/kg
HBSS	Gibco	14175-095
Dispase 5U/ml	StemCell Technologies	7913	5 mg/ml
Collagenase-4 125 CDU/mg	Sigma-Aldrich	C5138	2 mg/ml
DNAse	Sigma-Aldrich	DN25	10mg/ml
BSA	Sigma-Aldrich	A7906
15 ml Smalle bodembuis VWR® High-Performance Centrifuge Tubes	VWR	89039-666
Sytox Orange Levensvatbaarheidskleurstof	Molecular Probes	11320972	1,3 nM/µl
Nuc Blue Live ReadyProbes	Invitrogen	R37605
Agilent 2100 Bioanalyzer Hooge gevoeligheid DNA Reagentia	Agilent	5067-4626
Kapa DNA Kwantificeringskit	Kapa Biosystems	KK4844
Chromium Single Cell 3' reagentia	10x Genomics
Apparatuur
BD FACSAria III	BD Biosciences
Agilent 2100 Bioanalyzer Platform	Agilent
Illumina® HiSeq 4000	Illumina
Illumina® MiSeq SR50	Illumina
10X Controller + accessoires	10x Genomics
Software
The Cell Ranger	10x GENOMICS	support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/software/overview/welcome
Loupe Cell Browser	10x GENOMICS	support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/software/downloads/latest
R		https://anaconda.org/r/r