Multiplexed fluorescerende immunohistochemische kleuring, Imaging en analyse in histologische monsters van lymfoom

Samenvatting

Hier beschrijven we een protocol voor multiplex fluorescerende immunohistochemische kleuring en imaging voor de gelijktijdige localisatie van meerdere kanker-geassocieerde antigenen in lymfoom. Dit protocol kan worden uitgebreid tot de colocalization analyse van biomarkers binnen alle weefselsecties.

Samenvatting

Immunohistochemische (IHC) methoden voor de analyse van de in-situ van eiwit expressie door de lichte microscopie is een krachtig hulpmiddel voor zowel onderzoek en diagnostische doeleinden. Echter is de visualisatie en de kwantificering van meerdere antigenen in een enkele weefselsectie met behulp van conventionele chromogenic IHC uitdagend. Multiplexed imaging is vooral relevant in lymfoom onderzoek en diagnostiek, waar markeringen moeten worden geïnterpreteerd in de context van een complexe tumor communicatie. Hier beschrijven we een protocol voor multiplexed fluorescerende IHC kleuring zodat de kwantitatieve beoordeling van meerdere doelen in specifieke celtypen belangstelling lymfoom. De methode omvat aspecten van validatie van antilichaam, antilichaam optimalisatie, de multiplex optimalisatie met markeringen van lymfoom subtypen, de kleuring van weefsel microarray (TMA) dia's en het scannen van dia's, gevolgd door data-analyse, met specifieke verwijzing naar lymfoom. Met behulp van deze methode, worden scores voor zowel het gemiddelde intensiteit van een marker van belang en het percentage positiviteit gegenereerd om verdere kwantitatieve analyse. Multiplexing minimaliseert monster benutting en ruimtelijke informatie voor iedere markeerdraad van belang.

Inleiding

Lymfoïde gezwellen worden veroorzaakt door de ongecontroleerde kwaadaardige proliferatie van lymfocyten. Deze cellen zijn essentiële componenten van het immuunsysteem en lokaliseren naar de primaire en secundaire immuun organen, zoals het beenmerg, lymfeklieren, milt en andere mucosa-geassocieerde lymfoïde systeem. Lymfoïde gezwellen zijn een heterogene groep van stoornissen die worden geclassificeerd gebaseerd op een constellatie van functies, waaronder morfologie, immunophenotype, genetische kenmerken, en klinische presentatie. Terwijl elke parameter een rol speelt, afkomst blijft een kenmerkend en vormt de basis voor de WHO classificatiesysteem die gezwellen afgeleid van natural killer (NK) cellen¹, B-cellen en T-cellen herkent.

Sleutel tot de classificatie van lymfoom is de karakterisatie van de antilichamen tegen leukocyten oppervlakte merkers van de verschillende subtypen van lymfocyten². Immunohistochemistry (IHC) heeft van oudsher wordt gebruikt voor de analyse van deze markers en is gebaseerd op het beginsel van de erkenning van de specifieke antigeen-antilichaam aan de cel - en weefsel-gebaseerde moleculen die kunnen worden gevisualiseerd door de lichte Microscoop ^{detecteren 3}. de identificatie van meerdere doelen voor een enkele dia door conventionele helder-veld chromogenic multiplex IHC heeft echter beperkingen omdat het vaak moeilijk te onderscheiden van meerdere signalen van de kleur op een enkele weefselsectie betrouwbaar — met name voor antigenen met een zeer lage expressie⁴. Visuele beoordeling en kwantificering van kleuring kunnen ook subjectief, variabiliteit veroorzaakt in de analyse en data interpretatie⁵.

Conventionele IHC op monsters van formaline-vaste, paraffine-ingebedde (FFPE) dus niet haalbaar voor de simultane detectie van meerdere doelen in via het immuunsysteem veroorzaakte uiteenlopende ziekten zoals lymfoom. Bovendien is het vaak onnauwkeurig neoplastische lymfocyten van de omliggende immuuncellen onderscheid te maken. Dit belemmert de studies te kijken naar de relevantie van nieuwe biomarkers in lymfoom. In dit verband, multiplex fluorescerende IHC (mf-IHC) biedt een veelbelovend alternatief als hierdoor de kwantitatieve beoordeling van antigeen coexpression en een ruimtelijke relatie met hogere precisie terwijl het behoud van de beperkte monsters^6,7. Wanneer deze imaging technologie is een partnerschap aangegaan met de software van de analyse van de digitale beelden, de data interpretatie bestaat efficiënter en vergemakkelijkt de studie van de tumor en communicatie heterogeniteit^8,9. In dit protocol, een tyramide gebaseerde immunofluorescentie (IF) Multiplex methode wordt toegepast op het signaal versterken en is compatibel met elke IHC-gevalideerde antilichaam van elke soort die host, zelfs die zijn ontwikkeld in de dezelfde soort^{5,7 , 10}. de tyramide-gebaseerd protocol voorziet in de directe Woordherkomst en-opbouw van de fluorophore aan het weefsel van belang zodat de primaire en secundaire antilichaam kan worden gestript na elke stap, waardoor de sequentiële toepassing van meerdere vlekken zonder antilichaam Kruisallergie.

Een multiplexed strategie zal zitten nuttig voor het voorspellen van de resultaten van de prognose en behandeling door het identificeren van doelstellingen en hun variant immunologische patronen in lymfomen. Multiplex TL IHC is toegepast in ons lab voor de studie van een panel van T en B-lymfocyt markers en T-folliculaire helper markeringen in angioimmunoblastic T-cel lymfoom (AITL), een subtype van een perifere T-cel lymfoom gekenmerkt door agressieve klinische gedrag en tumor heterogeniteit¹¹. Het nut van deze methode wordt ook geïllustreerd in diffuus grote B-cel lymfoom (DLBCL) waar de toegenomen signalering van een B-cel receptor met gelijktijdige C-MYC en BCL-2 uitdrukking het potentiële therapeutische gebruik van Bruton van tyrosine kinase remming suggereert ¹² .

Hier beschrijven we het gehele protocol van antilichaam validatie bij de selectie van passende controlemaatregelen weefsels en multiplex met behulp van lymfoom FFPE weefsels, met een eventuele analyse van gebeitst dia's met behulp van een standaardscanoptie geautomatiseerde kwantitatieve pathologie imaging systeem.

Protocol

Alle weefsels in dit protocol gebruikt werden verkregen onder de Singapore NHG domein specifieke Review Board B 2014/00693 studie.

1. selectie en validatie van antilichamen

Opmerking: Voordat u verdergaat met de instelling van een multiplexed panel, zorgen dat alle antilichamen vlek krachtig, identificeren van alleen de doel-antigeen van belang. Het doel is het selecteren van antilichamen die specifiek het antigeen van belang in weefselsecties wordt herkend.

1. Voor een antilichaam met een gevestigde onderzoek gebruik of klinische routinegebruik in IHC, aandoeningen zoals epitoop ophalen en antilichaam verdunning te bevestigen door het uitvoeren van conventionele IHC^5,13 op positieve en negatieve controle weefsel secties. Voor weefselsecties van menselijke oorsprong, zorgen ervoor dat de juiste ethiek speling op plaats alvorens aan te vangen experimenten.
   Opmerking: Positieve controles zijn weefsels die verwachting uitspreken het antigeen van belang, en negatieve controles zijn die dat niet doen. Goedaardige tonsillen weefsel is gekozen als een goede weefsel besturingselement voor lymfoom antigenen omdat het bevat een mengsel van immune cellen, met inbegrip van B-cellen, T-cellen, cellen antigeen-presenteren, alsmede stromale en epitheliale cellen. Deze laatste dienen als nuttig negatieve interne controles.
2. Voor onbekende doelen of voor commerciële antilichamen met onvoldoende gepubliceerde gegevens, uitvoeren van antilichaam validatie door het creëren van gecompenseerde positieve en negatieve controle FFPE cel blokkeert¹⁴, met behulp van CRISPR knock-out of siRNA knock-down van het antigeen van belang in een geschikte cellijn door standaard moleculaire biologietechnieken. Gebruik deze FFPE cel blokken in plaats van positieve en negatieve controle weefsels voor conventionele IHC per stap 1.1.
   Opmerking: HeLa of 293T cellen worden vaak gebruikt voor antigenen die niet celtype specifieke, zoals lymphoma cellijnen moeilijk zijn te transfect. Voor antigenen die specifieke lymfocyt, lymphoma cellijnen bruikbaar met virale transductie of electroporation als de wijze van levering van het gen (zij het met lage effectiviteit).

2. planning van de volgorde van antilichamen en Fluorophores voor het Multiplex paneel

1. Plan de volgorde van de reagentia voor de definitieve multiplex kleuring. Bijvoorbeeld, was hier de volgorde voor het multiplex protocol aanvankelijk gepland als eerste, Bcl-6; tweede, Bcl-2; Ten derde: C-Myc; vierde, CD20; Ten vijfde, Ki67.
   Opmerking: Om te beslissen over de volgorde, antilichamen met een zwakke affiniteit vereisen hogere concentraties moeten worden gekleurd eerst in de definitieve multiplex kleuring. Hoge-affiniteit antilichamen die dreigen te worden resistent tegen meerdere rondes van magnetron strippen worden laatst in het multiplex protocol om te voorkomen dat niet-specifieke kleuring toegepast.
2. Plan de fluorophore partner voor elke antilichaam in het deelvenster. Zie tabel 1 en Tabel van materialen voor de keuzes in het volgende voorbeeld.
   Opmerking: Om te beslissen over de fluorophore partner voor elke antilichaam, kies spectraal verschillende fluorophores voor antilichamen met vergelijkbare patronen van lokalisatie binnen de cel en weefsel. Dit zal minimaliseren spectrale overlap en moeite met randverwijdering.

3. Monoplex Tyramide gebaseerde als in een gesimuleerde 5-plex Multiplex Panel

Opmerking: In dit voorbeeld, het protocol voor CD20 is besproken, die is gepland als het vierde antilichaam in een multiplex volgorde zoals hierboven beschreven. Het aantal extra strippen stappen zullen verschillend zijn voor de positie van het antilichaam in de reeks.

1. Knipt van 3 µm-dunne lagen van weefsel van de positieve en negatieve controle gebruikend microtome en plaatst u de secties op poly-L-lysine-coated Microscoop glas dia's.
2. Dewax van de secties met behulp van een passende clearing oplossing 3 x voor elke 4 min. Hydrateren de dia's in 100% alcohol, alcohol van 90% en 70% alcohol, elke 4 min. Zet de dia's in gedestilleerd water gedurende 2-3 minuten.
3. Plaats de dia's in een magnetron-safe glazen pot in een standaard antigeen ophalen buffer (Los verkrijgbaar) om het onderdompelen van de dia's. Uitvoeren van warmte-geïnduceerde epitoop ophalen (HIER) met behulp van een geschikte magnetron, in de oplossing van de gegevensherwinning van pH9 antigeen bij 98 ° C gedurende 25 minuten.
   Opmerking: Een magnetron met een druk variërend van 800-1100 watt kan worden gebruikt, en HIER kan dienovereenkomstig worden geoptimaliseerd. In dit geval werd een multifunctionele magnetron weefsel processor (open lucht) gebruikt voor HIER en strippen. De begininstellingen voor het ophalen van een specifieke epitope zijn gebaseerd op de voorkennis van conventionele IHC.
4. Het uitvoeren van extra rondes van magnetron strippen (drie in dit geval, voor het vierde antilichaam in een deelvenster), elke ronde met 100% tot 98 ° C en 20% macht voor 10 min om op dezelfde temperatuur te houden. De dia's in gedestilleerd water gedurende minstens 10 minuten afkoelen.
   Opmerking: Voer meerdere rondes van magnetron strippen tijdens de monoplex als stap om de doel-antigeen tot hetzelfde aantal stappen zoals in de voorgestelde multiplex verwarming bloot te stellen. Aangezien CD20 is gepland als het vierde antilichaam, magnetron strippen 3 x vóór en één keer na het doen van de incubatie met primair antilichaam.
5. Controleren en aanvullen van de buffer na elke 5 min tijdens het strippen van de extra magnetron. Nog belangrijker is, laat geen dia's tijdens de meerdere strippen procedures uitdrogen. Bij het nemen van de dia's uit de magnetron, gebruik pincet en hittebestendige handschoenen om ze te plaatsen in een aparte pot gedestilleerd water. Wacht tot de oplossing van de gegevensherwinning antigeen afkoelen natuurlijk.
6. Blokkeer de weefsel peroxidase activiteit met behulp van een commerciële peroxidase blok voor 10 min (3% waterstofperoxide kan worden gebruikt als een alternatieve reagens). Wassen met Tris-gebufferde zoutoplossing (TBS) en een nonionic wasmiddel voor 5 min.
   Nota: TBS is samengesteld uit 50 mM Tris-Cl, pH 7.5 en 150 mM NaCl.TBS te maken van de TBS-D.
7. Blok met antilichaam verdunningsmiddel of bovien serumalbumine gedurende 15 minuten gevolgd door incubatie met het primaire antilichaam van belang (b.v.CD20, 1:2,000 verdunning in antilichaam verdunningsmiddel, Zie Tabel van materialen) bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten wassen 3 x met TBS-D buffer voor 5 minuten elke keer. Er moet voldoende TBS-D buffer om onder te dompelen de dia volledig in alle stappen van het wassen.
   Opmerking: Bovien serumalbumine kan worden gebruikt als een alternatieve antilichaam verdunningsmiddel. Het volume van antilichaam verdunningsmiddel hangt af van de grootte van het weefsel, variërend van 50 µL (voor biopsie monsters) tot 400 µL (voor excisie weefsel microarray monsters of).
8. Incubeer met een passende horseradish peroxidase (HRP)-gelabelde secundair antilichaam, gekozen op basis van de soort van oorsprong van het primaire antilichaam gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur. Wassen 3 x met TBS-D buffer voor 5 minuten elke keer.
9. Toepassing van een geschikt tyramide gebaseerde fluorescerende reagens (1:100 in versterking verdunningsmiddel) en Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 5 minuten, zodat de geconjugeerde van de fluorophore aan het weefsel monster op de sites van primair antilichaam binding. Wassen 3 x met TBS-D buffer voor 5 minuten elke keer.
10. Een extra magnetron gebaseerde strippen om het verwijderen van de primaire en secundaire antilichaam uitvoeren Herhaal zo vaak als nodig op basis van de positie van het antilichaam in de reeks.
11. Plaats de dia in gedistilleerd water om af te koelen. Incubeer met DAPI (1:100 verdunning in antilichaam verdunningsmiddel) gedurende 10 min, gevolgd door wassen 3 x met TBS-D buffer voor 5 minuten elke keer. Droog het gebied op de dia zonder het weefsel met doekjes en monteer de dia met de juiste montage media.
12. Afbeelding van de dia (Zie de punten 6 en 7 van dit protocol) en het bepalen van de geschiktheid van de kleuring (zoals gedefinieerd door duidelijke discriminatie van het weefsel van de positieve en negatieve controle).
    Opmerking: Als de kleuring patroon onjuist is, opnieuw de monoplex kleuring na het aanpassen van een of meer van de volgende parameters: het aantal warmte ophalen stappen, de hoeveelheid warmte ophalen, de incubatie periode/concentratie van antilichamen (primaire en secundaire), de positie van antilichaam in de reeks en de keuze van de fluorophore. De monoplex kleuring stap meestal vereist meerdere rondes van optimalisering te verkrijgen van een geschikt aantal parameters voor de juiste kleuring. Het is raadzaam om het testen van een aantal fluorophores met elke primair antilichaam, zoals dit voor flexibiliteit zorgen zal bij het bepalen van de uiteindelijke set van multiplex.

4. herhaling van de Monoplex voor elke antilichaam in het Multiplex Protocol

1. Herhaal de monoplex kleuring voor de andere antistoffen op een vergelijkbare manier door het aantal magnetron strippen stappen, op basis van de positie van het antilichaam in de volgorde aan te passen. Bijvoorbeeld, bij het uitvoeren van monoplex voor het derde antilichaam in een zes-plex multiplex panel kleuring, voeren twee magnetron strippen stappen vóór en drie magnetron strippen stappen na de incubatie met primair antilichaam.
   Opmerking: Het is belangrijk te begrijpen dat de magnetron gebaseerde strippen van antilichamen ook bloot van het monster, tot HIER. Als een specifiek antilichaam een verschillende epitoop ophalen strategie vereist, moet dit rekening worden gehouden bij de planning van de multiplex volgorde. In dit voorbeeld vereist Ki67 epitoop ophalen pH 9, voor 30 min. Sinds 25 min van HIER zal gebeuren vóór KI67 vlekken in het protocol van de sequentiële, alleen een extra 5 min van HIER zijn nodig.

5. multiplex kleuring Protocol

Opmerking: Ga verder met de multiplex kleuring protocol pas nadat alle onderdelen zijn geoptimaliseerd met behulp van monoplex als kleuring. Bekijk de resultaten van de kleuring van de monoplex en het ontwerp van een tabel met de uiteindelijke lay-out van de orde van multiplex en de keuze van fluorophore voor elke antilichaam. De details van antilichaam concentratie, de duur van de kleuring, en de volgorde en de aard van warmte ophalen voor elke antilichaam die hier gebruikt wordt gegeven in tabel 1.

1. Knippen 3 µm-dunne secties van positieve en negatieve controle weefsel, alsmede als het doelweefsel van belang (hier, FFPE monsters van lymfoom), gebruikend microtome, en plaats van de secties op poly-L-lysine-coated Microscoop glas dia's (Zie Tabel van materialen).
   Opmerking: De opneming van de positieve en negatieve controles voor elke antilichaam in het deelvenster is aan te raden, samen met de werkelijke monsters voor multiplex. Dit zorgt voor een bevestiging dat de kleuring protocol correct is uitgevoerd.
2. Dewax, uitvoeren van warmte-geïnduceerde epitoop ophalen (HIER) en blokkeren van weefsel peroxidase activiteit zoals in het monoplex protocol stappen 3.3-3.5.
3. Incubeer met de eerste primair antilichaam van de geoptimaliseerde multiplex reeks, zoals eerder bepaald met behulp van de monoplex als stap. In dit voorbeeld, BCL-6, op een 1:30 verdunning in antilichaam verdunningsmiddel bij kamertemperatuur gedurende 60 minuten (Zie Tabel of Materials), was de eerste stap van het multiplex protocol. Wassen met TBS-D buffer voor 5 min.
4. Incubeer met een passende HRP-gelabeld secundair antilichaam gebaseerd op de soorten het primaire antilichaam gebruikt in de voorafgaande stap (Zie Tabel van materialen) bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten wassen met TBS-D buffer voor 5 min.
5. Toepassing van de geoptimaliseerde tyramide gebaseerde fluorescerende reagens (Cy5 in dit voorbeeld, 1:100 in versterking verdunningsmiddel, Zie Tabel van materialen) met incubatie bij kamertemperatuur gedurende 5 minuten. Na de incubatie, wassen met TBS-D buffer voor 5 min.
   Opmerking: De keuze van de tyramide gebaseerde fluorescerende reagens is gebaseerd op de geoptimaliseerde monoplex als.
6. Controleren van de doeltreffendheid van de kleuring van het eerste antilichaam met behulp van een passende Microscoop (Zie Tabel van materialen).
   Opmerking: Interim imaging controles kan worden gedaan met gemak als het monster een TMA of één dia. Als de vlek wordt echter uitgevoerd op meerdere dia's, wellicht is dit onpraktisch, en deze stap kan worden weggelaten.
7. Magnetron strippen voor het tweede antilichaam in het protocol, met behulp van voorwaarden geoptimaliseerd in de monoplex stap uitvoeren Ga vervolgens verder met de kleuring van de tweede primaire antilichaam (hier BCL2) met de HRP-gelabeld secundair antilichaam en tyramide gebaseerde fluorescerende reagens (hier, 520, Zie Tabel van materialen). Controleer de efficiëntie van de kleuring onder een fluorescente microscoop na de voltooiing van de tweede ronde van de kleuring.
8. Evenzo, herhaalt u de procedure met behulp van de derde, vierde en vijfde antilichamen in de reeks (hier, c-Myc CD20 en ki67, respectievelijk met fluorophores 570, 540 en 620, respectievelijk). Controles beeldvorming tussen elke stap indien mogelijk.
9. Toevoegen van een nucleaire counterstain (DAPI, 1:100 verdunning in antilichaam verdunningsmiddel) gedurende 10 minuten en daarna 2 x wassen in TBS-D voor elke 5 minuten.
10. Monteer de dia's met behulp van een juiste montage reagens.

6. bereiding van spectrale bibliotheek dia 's

Opmerking: Secties 6-8 van dit protocol zijn uniek voor multiplexed experimenten die zijn beeld met behulp van een spectrale camera.

1. Maak bibliotheek dia's (single-vlek referentie afbeeldingen) voor elke fluorophore, DAPI en autofluorescence op de dezelfde controle-weefsel, moet worden gebruikt voor beeldanalyse van het multispectrale.
   1. 2 x 3 µm-dunne secties van het weefseltype van belang (hier, een lymfoom monster of een tonsillen als besturingselement) gesneden gebruikend microtome en plaats van de secties op poly-L-lysine-coated Microscoop glas dia's.
   2. Proces beide dia's met behulp van het monoplex-protocol (met alle strippen en wassen stappen), maar zonder antilichaam of fluorophore toevoeging.
   3. Vlekken van één dia met DAPI per stap 5,9 en laat één dia onbevlekt (voor de generatie van het weefsel autofluorescence spectrum).
      Opmerking: De geoptimaliseerde monoplex dia's (met een enkele fluorescentie kleurstof, zonder DAPI) kunnen worden gebruikt als spectrale bibliotheek dia's voor het genereren van spectra van elke kleurstof fluorescentie.
2. Scan deze set dia's met behulp van geschikte filters en hen te uploaden naar de beeldbank van de analyse.

7. spectrale Imaging

1. Scannen van monoplex dia 's
   1. Kies de filters uit beschikbare standaard epi-fluorescentie filters (DAPI, FITC CY3, Texas Red en CY5) geschikt is voor de werknemer fluorophore.
      Opmerking: De aanbevolen filter kubussen voor specifieke fluorophores gebruikt in dit voorbeeld worden weergegeven in tabel 2¹⁵.
   2. Onderzoeken van iedere markeerdraad in haar overeenkomstige fluorescentie kanaal te identificeren van een geschikte belichtingstijd te verkrijgen van een schoon signaal. Focus op het weefsel-onderdeel dat wordt verondersteld om het sterkste signaal voor de markering.
   3. Een vaste belichtingstijd voor elke analyt (antilichaam-fluorophore combinatie), bepalen dat kruis-monster vergelijking van pixel intensiteit (hoewel sommige commerciële platformen heb normalisatie strategieën ter verantwoording voor verschillen in blootstelling).
      1. Gebruik een live camera-instelling aan te passen de belichtingstijd zolang er geen overbelichte gebieden niet te in de live camera beeld zijn om te beslissen over een vaste belichtingstijd voor een bepaald kanaal, en herhaal dit voor alle zenders.
   4. Na het scannen van monoplex dia's, gesimuleerde helderveld afbeeldingen genereren (als deze functie beschikbaar in de software gebruikt is) naar visueel vergelijken met het normale patroon van de IHC en om te bepalen als de kleuring patroon correcte (Figuur 1 en figuur 2 is ).
2. Scannen van multiplex monsters (TMA dia's / meerdere monsters)
   1. De optische parameters instellen zoals beschreven voor het scannen van monoplex beelden (stap 6.1). Ten eerste, het aanpassen van de focus handmatig of automatisch (volg de instructies van de specifieke afbeelding scannen van de machine). Ten tweede, pas de belichtingstijd voor elk fluorescerende kanaal om ervoor te zorgen dat alle de cores op een TMA of alle gebieden op een dia, op de juiste manier worden blootgesteld.
      Opmerking: Het gebied geselecteerd om de blootstellingstijd is belangrijk. Gebruikers moeten kiezen van het sterkste signaal regio voor elk filter (dat wil zeggen, het Ki67 signaal is sterker in de tonsillen germinal center regio dan in de nongerminal center regio; vandaar gebruikers de germinal center regio vastgesteldop een passende belichting moeten gebruiken tijd). Gebruikers kunnen ook het aannemen van een functie van de correctie van het overbelichtingseffecten van de imaging systeem indien beschikbaar.
   2. Scan TMA dia's onder een TMA scanmodus indien beschikbaar in de imaging systeem, met een passende autofocus-algoritme.
   3. Voor geheel-weefselsectie dia's, krijgt u de dia's beoordeeld door een gekwalificeerde patholoog optimale om afbeeldingen te selecteren uit de meest representatieve gebieden van de tumor.
      Opmerking: Het protocol hier beschreven is gebaseerd op een gedefinieerde Microscoop/image analysesysteem (Zie Tabel van materialen). Er zijn andere machines en software van de analyse van het beeld die kan scannen en analyseren van multiplex IHC dia's⁷.

8. de gegevensanalyse

1. Preanalysis evaluatie en planning
   1. Gebruik de referentie dia voor autofluorescence aftrekken van de autofluorescence van de afbeeldingen die zijn gescand voor analyse.
   2. Controleer of de beelden vóór de analyse om ervoor te zorgen dat ze in-focus en zonder kleuring van artefacten.
   3. Gebruik een tumormarker (bijvoorbeeldCD20 in dit voorbeeld) cellen van belang worden geïdentificeerd en om verder te gaan met de segmentering van de cel, scoren en batchanalyse benadert. Selecteer CD20-positieve cellen voor de analyse.
      Opmerking: bijvoorbeeld in de DLBCL monsters geanalyseerd hier, de instelling en de parameters die zijn gedefinieerd voor de segmentering van de cel zijn gebaseerd op de grootte van de nucleaire en intensiteit, maar zijn specifiek voor de afbeelding analysesoftware gebruikt (bijvoorbeeldeen DAPI bedoel pixel intensiteit van op minste 0.05; omvang tussen 80-320 pixels, met een splitsing gevoeligheid op 2 [dit is een software-specifieke parameter die op de morfologie van de tumor leunt: voor kleine tumorcellen, splitsing van 0,7 - 1 past; voor grote tumorcellen splitsen kan worden aangepast op tot en met 4]).
   4. Verzoek om gekwalificeerde patholoog afzonderlijke beelden bekijken en beslissen of weefsel segmentatie is vereist om te selecteren tumor cel verrijkt regio's en regio's met necrose arearegion orand overvloedige reactieve cellen uitsluiten. Als extra weefsel segmentatie vereist is, dan selecteert u passende controlemaatregelen regio's (zoals tumor cellen/stroma/necrose) en controleer dat de software van de analyse van de afbeelding correct dergelijke regio's herkent
   5. Doorgaan met de segmentering van de cel na weefsel segmentatie (indien aanwezig), een gekwalificeerde patholoog te herzien van de cel segmentatie kaart om ervoor te zorgen de getrouwheid van de segmentering van de beoogde aanpak⁵verzoek.
   6. Het bepalen van de meest biologisch/klinisch passende analysemethode voor een bepaalde biomarker van belang (b.v., percentage positiviteit of gemiddelde intensiteit per cel).
   7. Selecteer een cut-off waarde voor iedere markeerdraad (voor percentage positiviteit).
   8. Bepaal de optische intensiteit positief cut-off waarde voor iedere markeerdraad in combinatie met een patholoog. Histogrammen te genereren door het analyseren van de frequentieverdeling van de marker intensiteit/cel in relevante statistische gegevens software (Zie Tabel van materialen).
      Opmerking: Een histogram van de waarde intensiteit kan bieden een overzicht van de verdeling van de intensiteit van het signaal.
   9. Bepalen van een geschatte licht-donkerscheiding van het histogram en controleer of dit door een patholoog te correleren met handmatig bepaald cut-offs op geselecteerde afbeeldingen. In sommige situaties een uniforme interne cut-off zal niet mogelijk zijn als gevolg van de variabiliteit in de kleuring en een handmatige cut-off waarde voor elk monster zal worden vereist.
      Opmerking: Sectie 8.1 moet gebeuren in de software van de analyse van de afbeelding (Zie Tabel van materialen) tenzij anders aangegeven.
2. Positieve en negatieve cellen markeren
   1. Voor iedere markeerdraad van belang, volgens het nummer van de licht-donkerscheiding bepaald (door histogrammen of handmatig), gebruiken een "IF" of soortgelijke logica formule naar aanleiding van de positieve en negatieve cellen met waarde aangegeven: nummer 1 voor positieve cellen, nummer 0 voor negatieve cellen.
   2. Voor de positiviteit van alle markeringen, vermenigvuldigt u de gemarkeerde waarde van iedere markeerdraad (1 of 0) met de producten in afzonderlijke kolommen. Als het product gelijk is aan 1, betekent het dat de cel is positief voor alle markeerders. Gebruik een algoritme van de logica als voor de positiviteit en negativiteit van een specifieke marker.
      Opmerking: Punt 8.2 vallen dient te gebeuren in statistieken software (Zie Tabel van materialen).
3. Genereren van percentage en numerieke gegevens met behulp van een draaitabel
   1. Genereren van gegevens van het percentage voor specifieke markers van belang, binnen de gedefinieerde cellen (bijvoorbeeld, CD20-positieve cellen of CD20-negatieve cellen) (Figuur 6).
   2. Een draaitabel in het gegevensblad invoegen.
   3. Voor de berekening van het percentage van de positiviteit van een enkele gegevensmarkering, zoals CD20, selecteert u de functie som onder het deel van de waarde van de draaitabel te tellen het totale aantal CD20-positieve cellen met behulp van de som van de CD20⁺ cellen gedeeld door de het nummer van de cel totaal. Het resultaat is de CD20⁺ cel percentage binnen één core of een studie nummer (afhankelijk van de selectie van de pivot tabelrij).
   4. Bereken het percentage van de positiviteit van meerdere markeringen gebruikend de zelfde methode (Figuur 3).
   5. Numerieke gegevens te genereren. Pak de gemiddelde genormaliseerde tellen voor iedere markeerdraad van elke core of elk studie-nummer door het verkrijgen van de gemiddelde intensiteit van iedere markeerdraad van belang in alle cellen binnen een steekproef (Figuur 4) studeerde.
      Opmerking: De mediane waarde kan niet worden afgeleid in de draaitabel direct. Kan worden afgeleid met behulp van deze formule: mediaan (IF (kolom van studie getal = specifieke studie nummer, kolom van genormaliseerde waarde)).
4. De gegevens in een geschikt grafiek plotten
   1. Uitzetten van de resultaten van het percentage positiviteit of gemiddelde intensiteit per markering in een celtype van belang op passende wijze voor verdere statistische testen en presentatie.
   2. Maak dot plots te verstrekken een visualisatie van aantallen en distributie.
      Opmerking: Vertegenwoordigen van gegevens met staafdiagrammen doet niet overbrengen informatie over de distributie. Schatting percelen worden ook aanbevolen als een goede methode voor gegevens representatie, met nadruk op de omvang van het verschil tussen monsters¹⁶.

Resultaten

MF-IHC beelden voor een DLBCL monster met C-MYC en BCL2 gen omlegging (dubbel-hit lymfoom) worden weergegeven in Figuur 1. Figuur 2 illustreert de gesimuleerde helder-veld immunohistochemische beelden. Figuur 3 geeft de generatie van percentage gegevens. Figuur 4 geeft de details van een mediane formule voor de generatie van numerieke gegevens. Figuu...

Discussie

MF-IHC heeft het potentieel om pathologen verfijnen diagnosticcriteria lymfoïde pathologie en analyseren van de rol van biomarkers in specifieke celtypen richting een voorspelling van klinische resultaten. Als een nieuwe onderzoeksmethode, wordt mf-IHC steeds meer toegepast op de kwantitatieve en ruimtelijke identificatie van meerdere immuun parameters van tumor cellen¹⁷. De detectie van mf-IHC voor de co expressie van tumor biomarkers gebleken reproduceerbaar zijn en betrouwbare^...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Antibody diluent	DAKO	REF S3022	Blocking
Peroxidase Blocking Solution	DAKO	S2023	Voor peroxide blokkering
Vectra multispectral automated microscope	Perkin Elmer	Vectra2.0.8	Spectral imaging
absolute Ethanol	EMSURE	1.00983.2500	Ethyl alcohol voor rehydratie
Amplification Diluent	PERKIN ELMER	FP1135	Fluorofoor verdunningsbuffer
Anti-Mouse IgG [Goat] HRP-Labeled	PERKIN ELMER	NEF822001EA	Secundaire antilichaam
Anti-Rabbit IgG [Goat] HRP-Labeled	PERKIN ELMER	NEF812001EA	Secundaire antilichaam
BCL2	DAKO	clone 124 ( Lot No. 20031561)(RRID-AB578693)	primair antilichaam
BCL6	LEICA	NCL-L-Bcl6-564(Lot No.6050438)(RRID-AB563429)	primair antilichaam
CD20	DAKO	Clone L26 (Lot No.20028627) (RRID-AB442055)	primair antilichaam
c-MYC	ABCAM	Y 69 clone ab32072 (Lot NO.GR29511133)(RRID-AB731658)	primair antilichaam
Cy 5	PERKIN ELMER	FP1171	Geschikt tyramide gebaseerd fluorescerend reagens
Graphpad Prism 7	Graph pad		Statistiek software
HistoClear Clearing Agent	SIGMA	H2779-1L	Histoclear voor ontwassing en clearing
inForm Advanced Image Analysis Software	Perkin Elmer	Inform Software 2.2.1	Data Analyse software
KI67	DAKO	Clone MIB-1 (Lot No.20040401) (RRID-AB2314699)	primair antilichaam
KOS MILESTONE multifunctional tissue processor	Milestone		Microgolfoven voor hitte geïnduceerde epitope retrievals
Microwave	PANASONIC	NN-ST651M	Microgolfovenstripping
Mowiol	SIGMA ALDRICH	81381 Aldrich Mowiol® 4-88	montage media
Opal 570	PERKIN ELMER	FP1488	Geschikt tyramide gebaseerd fluorescerend reagens
Opal520	PERKIN ELMER	FP1487B21	Geschikt tyramide gebaseerd fluorescerend reagens
Opal540	PERKIN ELMER	FP1494	Geschikt tyramide gebaseerd fluorescerend reagens
Opal620	PERKIN ELMER	FP1495	Geschikt tyramide gebaseerd fluorescerend reagens
Poly-L-lysine coated slide	FISHER SCIENTIFIC	120-550-15	Glijmiddel voor weefselsectie-adhesie in routinematig histologisch gebruik
Spectral DAPI	PERKIN ELMER	FP1490	nucleïnezuurvlek
Target Retrieval Solution, pH9.0(10x)	DAKO	S2367	Voor HIER
Tris Buffer saline (TBS)	1st BASE	BUF3030 20X4L	voor buffer wassen
Tween 20	SIGMA ALDRICH	P1379-1L	Tween