Nieuwe proces voor afdrukken in 3D Decellularized Matrices

Summary

Dit protocol beschrijft de productie van polycaprolactone (PCL) gloeidraad met ingesloten polylactic acid (PLA) microsferen waarin decellularized matrices (DM) voor afdrukken in 3D van structurele weefsel engineering constructies.

Abstract

3D bioprinting beoogt te creëren van aangepaste steigers die biologisch actief zijn en geschikt voor de gewenste grootte en geometrie. Een kunststof ruggengraat kan zorgen voor mechanische stabiliteit vergelijkbaar met eigen weefsel terwijl biologische agenten compositorische signalen naar voorlopercellen bieden, leidt tot hun migratie, proliferatie en differentiatie te reconstrueren van het oorspronkelijke weefsel / organen^1,2. Helaas, veel 3D compatibel is met afdrukken, bioresorbable polymeren (zoals polylactic acid, PLA) worden afgedrukt bij een temperatuur van 210 ° C of hoger - temperaturen die schadelijk zijn voor biologics. Aan de andere kant, is polycaprolactone (PCL), een ander type van polyester, een bioresorbable, een 3D-printbaar materiaal dat een zachter afdrukken temperatuur van 65 ° C. heeft Daarom was het veronderstelde dat decellularized extracellulaire matrix (DM) deel uitmaakt van een thermisch barrièrebescherming PLA binnen PCL gloeidraad kan worden afgedrukt en blijven in haar functionele bevleesdheid. In dit werk was osteochondrale reparatie de toepassing waarvoor de hypothese werd getest. Als zodanig was varkens kraakbeen decellularized en ingekapseld in polylactic acid (PLA) microsferen, die vervolgens werden geëxtrudeerd met polycaprolactone (PCL) in gloeidraad voor de productie van 3D constructies via fused deposition modeling. De constructies met of zonder de microsferen (PLA-DM/PCL- en PCL(-), respectievelijk) werden geëvalueerd voor verschillen in oppervlaktekenmerken.

Introduction

Huidige weefsel engineering technieken voor klinische toepassingen zoals bot, kraakbeen, pezen en gewrichtsbanden wederopbouw auto- en allografts gebruiken voor het herstellen van beschadigd weefsel. Elk van deze technieken wordt uitgevoerd routinematig als een "gouden standaard" in de klinische praktijk door eerst het oogsten van de donorweefsel van de patiënt of een dode foetussen match, en dan het plaatsen van de donorweefsel in het defect site². Deze strategieën zijn echter beperkt door de donor site morbiditeit, donor site schaarste voor grote gebreken, risico van infectie, en moeite met het vinden van protheses die overeenkomen met de gewenste geometrie. Bovendien, hebben studies aangetoond dat allografts gebruikt voor wederopbouw mechanische en biologische eigenschappen wanneer vergeleken met inheemse weefsel³hebben verminderd. Met deze overwegingen in het achterhoofd, hebben onlangs weefsel ingenieurs aan drie dimensionale (3D) bioprinting voor de productie van aangepaste, complexe geometrieën die biologisch actief zijn en ontworpen voor defect grootte en vorm terwijl het verstrekken van voldoende gedraaid mechanische eigenschappen tot biologische remodelleren voltooid is.

Ideaal, een 3D-gedrukte schavot zou bestaan uit een polymere backbone die de vereiste mechanische stabiliteit van inheemse weefsel behouden kan terwijl de opgenomen biologics biochemische signalen bieden naar de omringende cellen, wat leidt tot hun migratie, proliferatie, differentiatie en weefsel productie^2,5. Helaas, meeste constructies die de biologische bestanddelen zijn gemaakt met gels of polymeren die te zwak zijn om te weerstaan in vivo krachten ervaren door de gerichte weefsels voor auto/allograft wederopbouw. Andere polymeren zoals polylactic acid (PLA) zijn bioresorbable, 3D afdrukbare en structureel klinken, maar bij temperaturen op of boven 210 ° C - maken het onmogelijk voor biologics mede gedrukte worden tijdens fabricage worden afgedrukt. Polycaprolactone (PCL) is een ander FDA-uitgeschakeld, bioresorbable polymeer dat afgedrukt op een lagere temperatuur (65 ° C), die wordt steeds populairder worden kan in het fabriceren van patiënt-specifieke implantaten met complexe morphologies^{5,6 3D ,7,8,9}. Echter maken de meeste bioprinters met behulp van pneumatische technologie onmogelijk afdrukken PCL bij lagere temperaturen waar biologische activiteit ongedeerd blijven kunnen. Tot op heden heeft nog niet de integratie van deze polymeren met een auto/allografts in een roman afdrukbare biomaterial worden bereikt. Bij gebrek aan dergelijk materiaal is een benadering waar weefsel ontworpen weefsel wederopbouw onwaarschijnlijk. Wij hebben daarom wilde combineren van PLA, PCL, en decellularized allograft matrices (DM) gebruik maken van de voordelen van elk materiaal voor de vervaardiging van een levensvatbare construct staat op de wederopbouw van complexe weefsels. Dit proces zou zorgen voor de eerste mechanische stevigheid nodig zijn om in vivo krachten en de thermische stabiliteit voor additive manufacturing in een constructie die induceert de vorming van het gewenste weefsel te verzetten.

In een recente poging om het adres van de bovengenoemde horden, bleek we dat het haalbaar is om in te kapselen de extracellulaire matrix decellularized kraakbeen binnen een thermisch beschermende barrière van PLA, die kan worden geëxtrudeerd binnen PCL-filamenten, behoud van het vermogen van DM te beïnvloeden van omliggende host cellen². Dit heeft inspireerde ons om klinisch effectieve benaderingen voor de wederopbouw van het weefsel. In de huidige studie, wij gebruiken het platformtechnologie om te bouwen van steigers van de all-in-one die PLA, DM en PCL (PLA-DM/PCL) bevatten.

Ons doel is het verbeteren van de doeltreffendheid en het nut van allografts nauwkeuriger recapituleren inheemse weefsel, uiteindelijk om ze te gebruiken in diverse toepassingen met de voorgestelde nieuwe biofabrication techniek.

Protocol

1. verkrijgen en voorbewerken microsferen

1. Microbolletjes van de producten met de gewenste matrix ingekapseld (PLA-DM)².
   Opmerking: Het is noodzakelijk dat de microsferen van uniforme grootte zijn. Om deze reden is het van essentieel belang de microsferen vóór gebruik zeven. Hoewel matrix decellularization en inkapseling hebben al gedetailleerd in eerdere publicaties², volgt een korte samenvatting van het proces.
   1. Ten eerste oogst kraakbeen stekkers van varkens hind ledematen. Decellularize van het kraakbeen in een reeks wasbeurten met 0,05% trypsine/0,5 mm tetrasodium ethyleendiamminetetra azijnzuuroplossing (NA2EDTA), Dulbecco gewijzigd van Eagle's medium (DMEM), en 1,5% Perazijnzuur zuur en 2,0% Triton X-100 voor 4 uur met gedestilleerd water wast vóór en na elke stap².
   2. Afvoer van de decellularized matrix, bevriezen, lyophilize, slijpen en ontbinden in pepsine-oplossing. Meng de pepsine-oplossing met PLA die is ontbonden in dichloormethaan na ontbinding.
   3. Voeg het mengsel ontkleuring in een 3% polyvinyl alcohol in water oplossing. Centrifugeer het resulterende microsferen, spoelen, afvoer en lyophilize weer.
      Opmerking: Zie de eerder gepubliceerde protocol²voor alle bijzonderheden op het proces.
2. Zeef de microsferen.
   1. Zorgen dat alle zeef platen grondig gereinigde en droge voorafgaand aan gebruik. Indien nodig, schone zeef met behulp van ultrasone reiniger om ervoor te zorgen dat alle gebieden worden verwijderd uit de zeef.
   2. Monteer de zeef shaker met de 106 µm zeef lade aan de bovenkant, de 53 µm lade na dat, en de zeef onderaan de pan.
   3. Droge microsferen plaats in het Dienblad van de bovenste zeef en plaats de deksel op de bovenste lade. Inschakelen grof conventioneel-het zeven voor 8 tot 10 min. herhalen op boete voor 8 à 10 min.
      Opmerking: De zeef tijden wellicht worden verhoogd of verlaagd afhankelijk van de partij.
   4. Verwijder de zeef platen één voor één voorzichtig en leg ze ondersteboven op een papier van de grote wegen. Tik op de zijkanten voorzichtig om ervoor te zorgen dat de meeste van de bollen zijn gedaald uit de zeef en op het papier.
   5. Negeren van de extra grote bollen (> 106 µm) en ondermaatse bollen (< 53 µm). Voeg bollen die zich in de groottewaaier van 53 tot en met 106 µm aan een gelabelde centrifugebuis met het type en de batch nummer dan plaats in een vriezer van-20 ° C tot verder gebruik.

2. microsfeer kwaliteitscontrole evaluaties

Opmerking: Zie Figuur 1.

1. Uitvoeren van macroscopische/visuele beoordeling om te controleren of de microsferen uniforme en sferisch, met geen aggregaten aanwezig.
2. Beoordelen de microsferen met behulp van een scanning electron opname (SEM).
   1. Hiervoor plaats microsferen op een SEM chuck en sputter jas met goud-palladium in argon sfeer met behulp van een sputter coater met een dikte van 4 nm.
   2. Observeren van oppervlaktekenmerken, morfologie en diameters van de microsferen met behulp van een 10 kV om spanning en een 10 mm afstand te versnellen om ervoor te zorgen dat de productie en zeven van de microsferen was succesvol.

3. de gloeidraad creatie voor afdrukken in 3D

1. Meten en registreren van de massa van de microsferen verkregen uit stap 2 en 3; ten minste 25 g nodig is.
2. Polycaprolactone (PCL) poeder toevoegen aan de microsferen voor een 1:4-gewichtsverhouding van microsferen aan PCL.
3. Meng het mengsel van de poeder op een miniatuur rollende mixer bij 20 omwentelingen per minuut gedurende 5 min. dan flip de container en meng bij 20 omwentelingen per minuut gedurende een extra 5 minuten (Zie Figuur 2).
4. Vele verkrijgbare extruders (Zie de Tabel van materialen) hebben isolerende jassen omdat hun beoogde werking temperaturen voor traditionele fused deposition modeling (FDM) filamenten zijn. Wijzigen van de extruder (indien nodig) door het verwijderen van het isolatiemateriaal en gebruik het in combinatie met bureauventilatoren (die blazen de lucht op de extruder en geëxtrudeerde gloeidraad) tot het gebruik van de extruder bij lagere temperaturen.
   Opmerking: Bureauventilatoren die de lucht blazen voor het koelen van de extruder en de gloeidraad zijn handig voor deze procedure.
5. Setup de installatie van de apparatuur voor extrusie. Zie Figuur 3.
   1. Setup de extruder zodat de uitlaat ~ 60 cm vanaf de inlaat naar de spooler, met een directe pad van de extrusie uitlaat naar de inlaat van de spooler is.
      Opmerking: De spooler kan eventueel worden verhoogd 3-4 duim van de Bank als wordt geconstateerd dat de gloeidraad is hangend aan het punt van het aanraken van de benchtop.
   2. Plaats een bureaublad fan ~ 15 cm vanaf de verwarming jas en het richten van de jas van de verwarming te bieden koeling met de buitenlucht in de gehele productie van de gloeidraad. Plaats een tweede koelventilator ongeveer halverwege tussen de extruder en de spooler en het richten van de extrudate om te helpen in de koeling van de gloeidraad met de buitenlucht.
   3. Pas de positionering zo nodig gedurende het hele proces.
6. Instellen van de gemodificeerde extruder verwarmingselement tot 52 ° C, zet op het bureaublad koelventilatoren, en laat het instrument om te komen tot evenwicht voor 20 tot 30 min., zorg ervoor dat de juiste mondstuk aan de extruder is gekoppeld.
7. Net voordat u begint, door de extruder hopper te vullen met het mengsel van de microsfeer/PCL uit stap 3.3. Inschakelen van de spooler en de extruder auger, tot inleiding van de extrusie van de gloeidraad.
8. Wanneer de eerste gloeidraad warm geperst is, handmatig Trek de extrudate uit het stopcontact extrusie met een tang en voeden het naar de spooler van de gloeidraad.
9. De gewenste gloeidraad duurt enige tijd te komen uit de spooler. Met behulp van afzonderlijke spoelen of tape, duidelijk markeren wanneer de samenstelling van de gloeidraad wordt visueel weergegeven uniform.
10. Het proces volgen en parameters te wijzigen als dit nodig is. Aanpassen van de extruder temperatuur, de extrusie auger snelheid, en de snelheid van de spooler te verkrijgen van een gloeidraad van 1,75 mm diameter, zoals gemeten door de remklauwen. Pas de fans zo nodig om af te koelen van de gloeidraad correct om te voorkomen dat niet-cirkelvormige gloeidraad dwarsdoorsneden. Meng en vullen van de trechter als dit nodig is.
    Opmerking: Aandacht vereist is tijdens dit proces te verkrijgen van voldoende gloeidraad voor latere 3D printen. De bovenstaande parameters verandert afhankelijk van de omgevingsomstandigheden, de vulhoogte en de uniformiteit van het mengsel in de hopper en de thermodynamica en stroom dynamiek van de specifieke batches van PCL en microsferen.
11. Blijven diepte tot al het poeder is gebruikt en de hopper bijna leeg is. PCL-poeder (zonder microbolletjes) toevoegen aan de bak te spoelen van de microsfeer mengsel dat momenteel in de extruder. Blijven PCL-poeder toe te voegen aan de hopper, zolang geen meer microsferen niet zichtbaar in de extrudate zijn.
12. Zorg om te etiketteren en aparte de gloeidraad waarin de microsferen in de gewenste concentratie, als nadat de gloeidraad wordt gekoeld het is moeilijker om te onderscheiden van de uniforme gloeidraad van niet-uniforme gloeidraad.
13. Blijven diepte totdat er minimale poeder links in de hopper is en uitschakelen van de spooler, extruder auger extruder verwarmingselement en fans.

4. printen met de gloeidraad

1. Ontwerp een geometrie van de gewenste vorm en vorm met behulp van een computer aided ontwerpsoftware. Vervolgens snijd van het model en dicteren de toolpath met behulp van segmenteringshulplijnen software die compatibel is met de 3D drukmachine wordt gebruikt.
2. Laden van de gloeidraad vanaf stap 3 op elke standaard FDM printer, uitgerust met standaard sproeiers van de gewenste diameter (doorgaans 0,4 mm). Beginnen de lettertjes (doorgaans op 65-70 ° C en 300 mm/min lineaire snelheid) zoals de aangepaste gloeidraad gedeponeerd laag-voor-laag door de machine is.
3. Zorg ervoor dat bijzondere aandacht besteden aan de eerste laag en pas instellingen zoals die nodig zijn om een goede kwaliteit print.
   Opmerking: Aanpassingen kunnen worden aangebracht in de afdruksnelheid, print temperatuur platform temperatuur, extrusie vermenigvuldiger en andere parameters. Verwijzen naar de printer en de probleemoplossing van het snijden van de fabrikant voor verdere ondersteuning.

5. kwaliteitscontrole beoordeling

1. Plaats de afgedrukte constructies op SEM Opspansystemen en sputter jas met goud-palladium in argon sfeer met behulp van een sputter coater met een dikte van 4 nm.
2. Observeren onder de microscoop met behulp van een 10 kV versnellen van spanning en een 10 mm afstand te controleren van oppervlaktekenmerken en voor de aanwezigheid of afwezigheid van microsferen indien van toepassing.

6. functionele testen van de afgedrukte constructies

Opmerking: Alkalisch fosfatase (ALP) kan worden gebruikt als een surrogaat voor decellularized matrix om te bepalen als encapsulated eiwitten biologisch actieve na het productieproces van de gloeidraad zijn. ALP wordt gebruikt omdat het een reactie van een substraat, p-nitrofenyl fosfaat, veranderen van kleurloos naar gele bijproducten, p-nitrofenol en anorganisch fosfaat, katalyseert, maar alleen als ALP in de functionele bevleesdheid.

1. Afdrukken van een geometrie (n = 3) die heeft een einde massa van ten minste 400 mg met de ALP microsfeer gloeidraad (PLA-ALP/PCL) met behulp van identieke print parameters als de PLA-DM/PCL-steigers. Ook afdrukken PCL-enige (PCL(-)) steigers van de dezelfde geometrie als de PLA-ALP/PCL-steigers. Dompelen hen in 1 mL Tris-HCl buffer en incubeer gedurende 24 uur bij 37 ° C en 110 rpm rotatie toe enzym diffusie.
2. Voeg 1 mL 1 mg/mL p-nitrofenyl fosfaat, Dinatrium-hexahydraat in Tris-HCl. Incubate bij 37 ° C, 110 rpm voor een extra 10 h. Lees het supernatant absorptie bij 415 nm.

Results

Na zeven, moet de microsferen worden weergegeven uniform en vrij zijn van aggregaten. Onder SEM, de gezeefde microsferen wellicht kleine poriën op hun oppervlak, maar anders zal zijn bolvormig en glad, zoals afgebeeld in Figuur 1. Alle geëxtrudeerde filamenten moet uniform diameter en een cirkelvormige dwarsdoorsnede. Een gloeidraad waarin microbolletjes (PLA-DM/PCL) zal hebben een iets meer matte afwerking terwijl een PCL-alleen (PCL(-)) gloeidraad zou kijke...

Discussion

Beide matrices decellularized en 3D gedrukte PCL-steigers, onafhankelijk is gebleken dat hechting en proliferatie van cellen, het valideren van hun gebruik voor osteochondrale herstellen^10,11,12. Het gebruik van decellularized matrix in engineering benaderingen voor weefselherstel een onderwerp geweest van veel belang en het succes in het recente verleden^2,3,<...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Zefmachine	Haver & Boecker Tyler	Ro-Tap RX 29-E Pure
Zeef 90 um	Fisherbrand	170328156	Nr. 170
Zeef 53 um	Fisherbrand	162513588	Nr. 270
Zeef 106 um	Fisherbrand	162018121	Nr. 140
Sputter coater	Leica	n/a
Scanning Electron Microscope	Hitachi, USA	n/a
Filabot EX2	Filabot.com	FB00061
Filabot Spooler	Filabot.com	FB00073
CAPA 6506	Perstorp	24980-41-4
Fosfaat gebufferde zoutoplossing, PBS	Gibco	10010023
6" Ventilator	Comfort Zone, Amazon	n/a
Ultrasoon waterbad	Cole Parmer	SK-08895-13
Dreamer	FlashForge	n/a
Trommelmixer	Op maat gemaakt	n/a	Vergelijkbaar stuk apparatuur: https://www.coleparmer.com/i/argos-technologies-flexiroll-digital-tube-roller-shaker-120-vac/0439744?PubID=UX&persist=true&ip= no&gclid=CjwKCAjw- dXaBRAEEiwAbwCi5khGDMz0 dTjsraEsBGfhMEH7ytx LQWGUPNgUJYQ1p3vj_yxkYoI_ ixoC9GwQAvD_BwE
Microschaal	Mettler Toledo, Fisher Scientific	01-913-851
Simplify3D	Simplify3D	n/a
SolidWorks	SolidWorks	n/a
Microsferen	Geproduceerd in eigen beheer, zie tegelijkertijd ingediende JoVE-aanvraag
p-nitrofenylfosfaat, dinatriumzout, hexahydraat	Millipore	4876-5GM
Fosfatase, alkalisch	Roche Diagnostics GmbH	10 713 023 001
Absorptiemeter	Tecan	Sunrise
Tris-HCl-buffer	Sigma-Aldrich	T6455-100ML
Verwarmde schudder	New Brunswick Scientific	Excella E24