Methodenartikel

Proteoom analyse van menselijke Macrophage polarisatie onder een lage zuurstof-omgeving

7.3K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/58727

⸱

7 januari 2019

 ,  , 
1Team Mechanobiology, Immunity and Cancer, Institute for Advanced Biosciences, INSERM U1209, CNRS UMR5309, 2Université Grenoble Alpes, 3Pôle Recherche, Centre Hospitalier Universitaire des Alpes

In dit artikel

Samenvatting

Presenteren we een protocol voor het verkrijgen van proteomic handtekeningen van menselijke macrofagen en dit toepassen op de bepaling van de invloed van een lage zuurstof milieu op macrophage polarisatie.

Samenvatting

Macrofagen zijn ingeboren immune cellen die betrokken zijn bij een aantal fysiologische functies variërend van reacties op infectieziekten pathogenen tot weefsel homeostase. De verschillende functies van deze cellen zijn gerelateerd aan hun activatie-Staten, die heet ook polarisatie. De exacte moleculaire beschrijving van deze verschillende polarisaties is een prioriteit op het gebied van macrofaag biologie. Momenteel wordt erkend dat een multidimensionale aanpak is noodzakelijk om te beschrijven hoe polarisatie wordt gecontroleerd door Milieusignalen. In dit verslag beschrijven we een protocol ontworpen voor de proteomic ondertekening van verschillende polarisaties in menselijke macrofagen. Dit protocol is gebaseerd op een label-vrije kwantificering van macrofaag eiwituitdrukking verkregen in-gel gespreide en Lys C/trypsine-verteerd cellulaire lysis inhoud. We bieden ook een protocol op basis van-oplossing spijsvertering en elektrisch gericht fractionering als alternatief te gebruiken. Omdat zuurstofconcentratie een relevante milieu-parameter in de weefsels is, we gebruiken dit protocol om te verkennen hoe atmosferische samenstelling of een lage zuurstof-omgeving is van invloed op de indeling van de macrofaag polarisatie.

Inleiding

Macrofagen zijn ingeboren immune cellen die betrokken zijn bij een aantal fysiologische functies variërend van reacties op infectieziekten pathogenen tot weefsel homeostase, met inbegrip van de verwijdering van apoptotic cellen en reorganisatie van de extracellulaire matrix1. Deze cellen worden gekenmerkt door een sterke fenotypische plasticiteit2 dat vertaalt zich in een veel mogelijke activering Staten, ook wel genoemd polarisaties. De exacte moleculaire beschrijving van deze verschillende polarisaties is een prioriteit op het gebied van macrofaag biologie3. Er is voorgesteld om te classificeren deze polarisaties met behulp van de zogenaamde M1/M2-tweedeling, waarin M1 staat voor pro-inflammatoire en M2 voor anti-inflammatoire macrofagen. Dit model past goed in diverse pathologische situaties zoals acute infecties, allergie en obesitas4. Echter in chronisch ontstoken weefsels en kanker, is gebleken dat deze indeling is niet in staat om te begrijpen de brede fenotypische repertoire dat macrofagen aanwezig in bepaalde cellulaire omgevingen5,6,, 7. de huidige consensus is dat de macrofaag polarisatie beter wordt beschreven met behulp van een multidimensionale model te integreren van specifieke microenvironmental signalen8. Deze conclusie werd bevestigd door transcriptomic analyse van menselijke macrofagen waaruit blijkt dat het model van de M1/M2 in het beschrijven van de verkregen polarisaties9inefficiënt.

De studie gepresenteerd is gericht op het bieden van een protocol voor proteomic handtekeningen voor verschillende polarisaties in menselijke macrofagen. We beschrijven hoe onderscheiden van menselijke macrofagen in omgevingen van verschillende zuurstofniveaus en peptiden te verkrijgen van de hele macrofaag Proteoom voor het uitvoeren van een label-vrije kwantificering. Deze kwantificering kan de vergelijking van de expressie niveaus van verschillende eiwitten. Als het onderzoek aan stamcellen blijkt het belang van zuurstof als een milieu belangrijke parameter10, proberen wij te begrijpen hoe deze parameter weefsel macrofaag polarisatie in mensen kan beïnvloeden. De gedeeltelijke druk van zuurstof is gebleken dat bereik van 3 tot 20% (van totale luchtdruk) in het menselijk lichaam, waarbij 20% overeenkomt met ongeveer wat vaak in een cel cultuur incubator gebruikt wordt (de exacte waarde is ongeveer 18,6% terwijl het nemen van de aanwezigheid van water rekening).

Vorige werk heeft aangetoond dat alveolaire verschillen van interstitiële macrofagen van functionele en morfologische punt van uitzicht11 en dat deze verschillen zijn waarschijnlijk gedeeltelijk te wijten aan de verschillende zuurstofniveaus waaraan zij blootgesteld12 zijn. Beenmerg-afgeleide macrofagen Toon bovendien een verhoogde kunnen bacteriën bij blootstelling aan een lage zuurstof milieu12phagocytize. Het tegenovergestelde effect is gebleken voor menselijke macrofagen THP1-gesplitste13, maar deze resultaten ondersteunen het idee dat zuurstof een regulator van macrofaag biologie is en dat het noodzakelijk is deze rol op moleculair niveau in menselijke macrofagen te verduidelijken. In een eerdere studie, hebben wij toegepast een proteomics benadering van deze kwesties. Door gelijktijdig bij het meten van expressie niveaus voor duizenden eiwitten, we gewezen op het effect van zuurstof op polarisatie en verstrekt een lijst van nieuwe moleculaire markers. We hebben ook kunnen betrekking hebben op deze bevindingen tot enkele functies van de macrofagen. Met name, vonden we dat het percentage fagocytose van apoptotic cellen was verhoogd in IL4/IL13-gepolariseerde macrofagen, die was gekoppeld aan de opregulatie van ALOX15 zoals geopenbaard door de Proteoom analyse14. In de huidige studie beschrijven we het uitvoeren van een dergelijke analyse.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Menselijke bloedmonsters (LRSC) van gezonde, de aangeduide donoren waren verkregen EFS (Frans nationaal bloed Service) als onderdeel van een geautoriseerde protocol (CODECOH DC-2018 – 3114). Donoren gaf ondertekende toestemming voor het gebruik van bloed.

1. Media en Buffer voorbereiding

  1. Bereiden van het medium van de macrofaag [RPMI glutamax + 10 mM HEPES + 1 x niet-essentiële aminozuren (NEAA)] en het warm tot 37 ° C.
  2. Bereiden de macrofaag medium + 10% menselijk serum van AB plasma (GAB), filteren (0,22 µm filter), dan is het warm tot 37 ° C (hierna aangeduid als de macrofaag medium + 10% SAB hierna).
  3. Voorbereiden van de sorteer buffer [1 x fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) + 0,5% bovien serumalbumine (BSA) + 2 mM ethyleendiamminetetra azijnzuuroplossing (NA2EDTA)], filteren (0,22 µm filter) en handhaven bij 4 ° C.

2. isolatie van perifere bloed mononucleaire cellen (PBMCs) uit vol systeem kamer (LRSC)

  1. 15 mL dichtheid kleurovergang cel scheiding oplossing zetten (Zie Tabel van materialen) in een 50 mL tube centrifugeren zodat het kan opwarmen tot kamertemperatuur (RT) vóór de ontvangst van de LRSC.
    Opmerking: Dichtheid is afhankelijk van temperatuur. Omdat dit product is opgeslagen bij 4 ° C, moet deze stap van tevoren worden gedaan, zodat het kan equilibreer aan RT.
  2. Leeg de LRSC in een tube van 50 mL centrifugeren, voeg maximaal 50 mL 1 x PBS en meng. Heel langzaam, voeg 25 mL van het mengsel bereid tijdens stap 2.2 op de top van 15 mL dichtheid kleurovergang oplossing tijdens stap 2.1 opgewarmd.
    Opmerking: Wees voorzichtig niet te mengen de fasen tijdens deze stap. Het bloed moet worden toegevoegd over de dichtheid van de kleurovergang oplossing zonder enige verstoring van deze fase.
  3. Centrifugeer beide centrifugeren buizen voor 25 min op 700 x g zonder pauzes.
    Opmerking: Aan het einde van de kleurovergang centrifugeren van de dichtheid, de lagen van bodem tot bovenkant zijn: de erytrocyten en granulocyten vormen de pellet, dichtheid kleurovergang oplossing fase, laag PBMCs en plasma.
  4. Met een pipet, de plasma-fase passeren zonder het aspirating en de laag PBMC verzamelen in een nieuwe centrifugeren-tube van 50 mL. Voeg maximaal 50 mL 1 x PBS aan de PBMCs als een wassen stap en Centrifugeer gedurende 10 min bij 300 x g.
  5. Gecombineerd het supernatant en resuspendeer de pellet in 40 mL van macrofaag medium.

3. magnetische Labeling en isolatie van CD14+ cellen (monocyten)

  1. Tellen de PBMCs in een Malassez kamer. Trekken van het bedrag van PBMCs nodig voor de uitvoering van het experiment (meestal 100 tot 300 x 106 cellen), plaats ze in een buis van centrifugeren, en Centrifugeer gedurende 10 min bij 300 x g.
  2. Gecombineerd het supernatant en resuspendeer de pellet in 80 µL van de sorteer buffer bereid tijdens stap 1.3 per 107 PBMCs. toevoegen 20 µL van CD14 microbeads per 107 PBMCs. Mix goed en incubeer gedurende 15 min bij 4 ° C onder voortdurende agitatie.
  3. Voeg 1 mL buffer per 107 PBMCs sorteren als een wassen stap en Centrifugeer gedurende 10 min op 300 x g. gecombineerd het supernatant en resuspendeer de pellet in 500 µL buffer per 108 PBMCs te sorteren.
  4. Plaats een kolom in het magnetisch veld van het scheidingsteken. Bereid de kolom door het spoelen met 3 mL buffer sorteren.
  5. Toepassing van de celsuspensie op de kolom. De kolom is afhankelijk van het aantal cellen worden geïsoleerd (hier, LS kolommen voor maximaal 109 PBMCs worden gebruikt). Verzamelen doorstroomtest met labelloze cellen.
    Opmerking: Vanaf deze stap, worden alle de buizen (negatieve en positieve selecties) gehouden om later te controleren van de verschillende stappen door stroom cytometry.
  6. Was de kolom met 3 x 3 mL buffer sorteren. Verzamelen labelloze cellen passeren de dezelfde buis uit stap 3.12. Wassen stappen door toe te voegen sorteren buffer, wees voorzichtig niet te drogen uw kolom. Plaats een buis van de collectie onder de kolom en verwijderen uit het scheidingsteken.
  7. Pipetteer 5 mL buffer in de kolom sorteren. Onmiddellijk spoelen de magnetisch gelabelde cellen door stevig de zuiger te duwen in de kolom. Om de zuiverheid van het CD14+ cellen, de eluted breuk is verrijkt over een tweede kolom.
  8. Herhaal stap 3.4 tot en met 3.7 met een nieuwe kolom.

4. de beplating van monocyten

  1. Tellen de monocyten in een Malassez kamer. Controleer de zuiverheid van het CD14+ cellen door stroom cytometry. Trekken van het bedrag van de monocyten noodzakelijk voor het experiment en plaats ze in een buis van centrifugeren.
  2. Centrifugeer gedurende 10 min op 300 x g. Aspirate het supernatant en resuspendeer de pellet monocyt in macrofaag medium. Plaat van de cellen en laat ze regelen voor 50 min. tot 1 h. gecombineerd van het medium en het vervangen met macrofaag medium + 10% SAB + 25 ng/mL macrofaag kolonie stimulerende factor (M-CSF) om differentiatie.

5. de polarisatie van de macrofagen op dag 6

  1. Het medium gecombineerd. Vervangen door de macrofaag medium + 10% SAB met verschillende prikkels. Bijvoorbeeld, voeg 10 ng/mL interferon gamma (INFγ) + 1 ng/mL lipopolysaccharide (LPS) te verkrijgen van M1 polarisatie, of 20 ng/mL Interleukine 4 (IL4) + 20 ng/mL Interleukine 13 (IL13) voor M2 polarisatie.
    Opmerking: De stimulatie kan tussen 24 en 48 uur voordat wij overgaan tot andere tests worden uitgevoerd.
  2. Oogsten van cellen met een ontkoppelen oplossing of een cel schraper.

6. celkweek onder lage zuurstof voorwaarden

  1. Vanaf stap 4, houden de monocyten en macrofagen in een zuurstof-gecontroleerde omgeving te hypoxische voorwaarde analyses uit te voeren. Gebruik een werkplek hypoxie teneinde cellen onder de gewenste zuurstof gedeeltelijke druk tijdens het experiment.
    Opmerking: Bij het werken onder lage zuurstof druk, het is belangrijk om te bereiden alle media en wassen buffers onder het station en wacht voldoende te verkrijgen van de juiste gedeeltelijke druk in de vloeistof. Bijvoorbeeld vereist 10 mL PBS in een 60 mm petrischaal ongeveer 2 h te bereiken 25 mmHg voor O2 gedeeltelijke druk van atmosferische druk te starten (zoals we hebben gemeten met behulp van een glasvezel zuurstofsensor). In vele hypoxische stations of starterscentra, is de druk van zuurstof ingesteld als een percentage van de atmosferische druk. Als nauwkeurige metingen nodig zijn, is het beter om te gebruiken een station machtigen rechtstreeks in te stellen de zuurstof Druk mmHg.

7. lysis en In-Gel spijsvertering (Protocol 1)

Opmerking: In deze en de volgende secties, worden twee protocollen gebruikt voor het verkrijgen van peptiden en LC-MS/MS analyses uit te voeren beschreven. Protocol 1 beschrijft lysis van de cel en de in-gel fractionering en de spijsvertering, en protocol 2 beschrijft in-oplossing cellysis gevolgd door in-oplossing spijsvertering en fractionering met behulp van een elektrisch scherpstellen methode.

  1. Lysis van de cel in Laemmli buffer [234 mM Tris-HCL (pH 6.8), 7,5% SDS 37% glycerol, 33,3% (v/v) β-mercaptoethanol, bromophenol blauwe 0,2% w/v] uitvoeren. Het laden van het eiwit equivalent van 300.000 cellen voor elk monster op 4-12% BIB-Tris acrylamide gels.
  2. Het bepalen van de duur van de elektroforetische migratie naar het toestaan van elke eiwitSteekproef worden gesplitst 6 gel bands zoals wordt geïllustreerd in Figuur 3.
  3. Herstellen van de gel met een fixing oplossing (30% ethanol + 7,5% azijnzuur voor 20 min), voeg dan de kleurstofoplossing (R-250 Coomassie blue voor 45 min). Toevoegen van de destaining oplossing (30% ethanol + 7,5% azijnzuur totdat banden worden weergegeven) voordat de eiwit bands met een schone scalpel middendoor.
  4. Dobbelstenen elke weggesneden band vóór invoering in 500 µL buizen. Een schone glazen oppervlak is gerechtvaardigd om te voorkomen dat besmetting met keratines (5%-oplossing van de SDS in gedeïoniseerd water kan worden gebruikt voor het reinigen van oppervlakken).
  5. Wassen van de gel-segmenten 3 keer in 200 µL van 25 mM Ammoniumbicarbonaat gedurende 20 minuten bij 37 ° C, gevolgd door een wassen in 25 mM Ammoniumbicarbonaat en acetonitril (50% v/v). Uitdrogen van de stukken van de gel met 200 µL van 100% acetonitril gedurende 10 minuten.
  6. Incubeer elk stuk gel met 10 mM DTT (dithiothreitol) in 25 mM Ammoniumbicarbonaat gedurende 45 minuten op 56 ° C (200 µL), gevolgd door 55 mM iodoacetamide in 25 mM Ammoniumbicarbonaat (200 µL) gedurende 35 min. in het donker op RT.
  7. Stop alkylatie, incubeer elk stuk van de gel met 200 µL van 10 mM DTT in 25 mM Ammoniumbicarbonaat voor 10 min op RT. Wash de stukken van de gel in 200 µL van 25 mM Ammoniumbicarbonaat, dan uitdrogen met 200 µL van 100% acetonitril gedurende 10 minuten.
  8. Verteren de eiwitten 's nachts bij 37 ° C met trypsine/Lys-C mix volgens de instructies van de fabrikant.
  9. Extraheren van de resulterende peptiden van gel stukken door toevoeging van 50 μl van 50% acetonitril voor 15 min, dan 50 μl van mierenzuur van 5% gedurende 15 minuten, en ten slotte 50 μl van 100% acetonitril voor 15 min. zwembad en droog van elke fractie in lage-absorptie buizen te beperken van adsorptie van peptiden en monster verlies. Het bewaren van de monsters bij-80 ° C tot verdere analyse.

8. eiwit extractie en In-oplossing spijsvertering (Protocol 2)

  1. Lysis van de cel (2 x 106 cellen) met 150 µL van het volgende lysis-buffermengsel uitvoeren:
    1. 7 M ureum, 2 M thioureum 40 mM Tris en 4% CHAPS, aangevuld met proteaseinhibitors (volledige mini, EDTA-vrije proteaseinhibitor cocktail).
  2. Meng de oplossingen voor 30 min op RT met een thermoshaker. Centrifugeer bij 13,800 x g gedurende 20 min RT en bewaar het supernatant.
  3. Verwijderen van verontreinigingen met een 2D-opschonen kit:
    1. De kit bevat precipitant oplossing, co neerslaande oplossing was buffer en wassen additief.
    2. Voeg 300 µL van precipitant oplossing en meng goed. Incubeer op ijs voor 15 min. 300 toevoegen µL van co neerslaande oplossing. Centrifugeer de buizen (ten minste) bij 12.000 x g gedurende 5 min. Een kleine pellet moet zichtbaar zijn. Ga snel naar de volgende stap om te voorkomen dat resuspensie of verdeling van de pellet. Verwijder de bovendrijvende vloeistof zonder de pellet te verstoren.
    3. Centrifugeer de buizen weer met de GLB-scharnier en de pellet tegenover naar buiten te brengen van eventuele resterende vloeistof naar de onderkant van de buis. Een korte puls is voldoende. Er mag geen zichtbaar vloeistof in de buizen blijft.
    4. Zonder de pellet te verstoren, voeg 40 µL van co neerslaande oplossing. Laat de buis zitten op ijs voor 5 min. Centrifuge voor 5 minuten, haal hem eruit en negeren het wassen. Voeg 25 µL-geïoniseerd water. Vortex elke buis voor 5-10 s. De pellet moet verspreiden maar niet los in het water.
    5. Voeg 1 mL was buffer (vooraf gekoeld gedurende ten minste 1 uur bij-20 ° C) en 5 µL van wassen toevoegingsmiddel. Vortex totdat de pellet is volledig verspreid. Incubeer de buizen bij-20 ° C gedurende ten minste 30 min. Vortex voor 20-30 s elke 10 min
      Opmerking: De buizen kunnen worden opgeslagen bij-20 ° C voor maximaal 1 week met minimale eiwit-afbraak- of wijziging.
    6. Centrifugeer de buizen (ten minste) bij 12.000 × g voor 5 min. zorgvuldig verwijderen en verwijder het supernatant. Een witte pellet moet zichtbaar zijn. Toestaan dat de pellet te airdry voor niet meer dan 5 min (indien de pellet te droog is, dat het zal moeilijk zijn om resuspendeer).
  4. Resuspendeer de pellet eiwit in 300 µL van 8 M ureum en 0,1 M Ammoniumbicarbonaat. Vortex sterk voor 1 min. bepalen de eiwitconcentratie met behulp van een colorimetrische bepaling.

9. in-oplossing spijsvertering (Protocol 2)

  1. Disulfide bruggen verminderen door toevoeging van 5.1 µL van een waterige oplossing van 700 mM DTT (eindconcentratie 12,5 mM) aan de geresuspendeerde eiwitten uit stap 8.4 en Incubeer bij 37 ° C gedurende 30 minuten met een thermoshaker. Alkylate van cysteïne residuen door toe te voegen 20.3 µL van een waterige oplossing van 700 mM iodoacetamide (eindconcentratie 40 mM) en bij 25° C gedurende 30 minuten in het donker met een thermoshaker aan het broeden.
  2. 990 µL van 0,1 M Ammoniumbicarbonaat Voeg aan het monster. Voeg een overeenkomstige hoeveelheid trypsine/Lys-C mix (enzym: substraat verhouding 1:100 w/w) toe. Incubeer bij 37° C's nachts met een thermoshaker.

10. schoonmaak cartridges (Protocol 2)

  1. Natte een patroon met 1 kolom-volume (1 mL) methanol. Reinigen van de cassette met 1 kolom-volume (1 mL) voor 80% acetonitril/HPLC-kwaliteit water en gooi de doorstroming. Equilibreer de cartridge met 4 kolom-volumes (4 mL) van 0,1% mierenzuur/HPLC-kwaliteit water en gooi de doorstroming.
  2. Breng steekproeven met 90 µL van 10% mierenzuur of water met pH 2-3 (Controleer de pH met een pH-indicator). Laad de aangezuurde monsters en verzamelen de doorstroming. Herlaad de doorstroming (met de niet-retained peptiden). De cartridge met 6 kolom-volume (6 mL) van 0,1% mierenzuur/HPLC-kwaliteit water wassen.
  3. Elueer peptides van de cartridge met 1 kolom-volumes (1 mL) van 0,1% mierenzuur acid/50% acetonitril/HPLC-kwaliteit water. Overbrengen naar een 1,5 mL microcentrifuge buis. Het concentreren van het monster met behulp van een vacuüm concentrator (150 x g, vacuüm op 160 mBar).

11. fractionering door elektrisch te focussen (Protocol 2)

Opmerking: Peptiden zijn opgedeeld volgens hun elektrisch punten met behulp van een off-gel-fractionator op een strip van 13 cm die betrekking hebben op een pH bereik van 3 tot 10. We gebruikten het volgende protocol geboden door de leverancier (samengevat hieronder):

  1. Voorbereiding van de volgende oplossingen: oplossing een (600 µL van glycerol oplossing, 60 µL van OFFGEL buffer, 4.34 mL ultrazuiver water) en B (1.776 mL van oplossing A) en 444 µL van ultrazuiver water-oplossing.
  2. Monteer de IPG parkeerstroken, frames en elektroden volgens de instructies van de fabrikant.
  3. Resuspendeer de steekproef met 1.8 mL van oplossing B. Voeg 40 µL van oplossing B in elk putje. Laden 150 µL van monster in elk putje.
  4. Selecteer de standaardmethode voor peptides: OG12PE00 (OFFGEL standaardmethode voor peptides voor gebruik met een 3100 OFFGEL Low Res Kit, pH 3-10, 12-well frames. Wacht tot deze methode is voltooid (~ 20 h). Het verzamelen van de breuken in goed geëtiketteerde buizen.

12. clean-up Harvard apparaat kolom omgekeerde C18 Post-IEF (Protocol 2)

  1. Geleidelijk een paar μL toevoegen in een tijd van 1% TFA in-geïoniseerd water naar elke breuk te Breng het monster. Controleer met behulp van pH-papier dat de pH over 3 of lager is.
  2. Voorbereiding van de volgende oplossingen: oplossing 1 (5 mL acetonitril, 10 µL van mierenzuur, 4.99 mL ultrazuiver water) en oplossing 2 (0,5 mL acetonitril, 10 µL van mierenzuur, 9.49 mL ultrazuiver water).
  3. Vooraf nat de spin-kolom met 150 µL van oplossing 1. Centrifugeer gedurende 90 s bij 750 x g en negeren de doorstroming. Was de kolom van de spin met 150 μl van oplossing 2. Centrifugeer gedurende 90 s bij 750 x g en negeren de doorstroming.
  4. De breuk door de kolom te passeren. Centrifugeer gedurende 90 s bij 750 x g en negeren de doorstroming. Wassen met 150 μl van oplossing 2. Centrifugeer gedurende 90 s bij 750 x g en negeren de doorstroming.
  5. Elueer de breuk met 50 μl van oplossing 1. Centrifugeer gedurende 90 s bij 750 x g. Herhaal deze stappen opnieuw.
  6. Droog-fractie met behulp van een vacuüm concentrator (150 x g, vacuüm 160 mBar) en opslaan bij-80 ° C

13. analyse van Proteomic gegevens en bio-informatica18

  1. Analyseren van de gegevens die zijn verkregen door een nano-LC-MS/MS massa spectrometer met behulp kwantificering software zoals MaxQuant (versie 1.5.2.8) en de Andromeda-zoekmachine.
  2. Stelt valse ontdekking tarief (FDR) tot 1% voor eiwitten en peptiden en een minimale lengte van 7 aminozuren. Instellen van enzym specificiteit als C-terminal Arg en Lys. Laat 2 gemiste breuklijnen op proline obligaties. Selecteer carbamidomethylation van cysteïne als vaste wijziging en N-terminal eiwit acetylation en methionine oxidatie als variabele wijzigingen.
  3. Verdere analyse van de gegevens met statistische analysesoftware. Een analyse van de functionele verrijking met FunRich software (www.funrich.org/) uitvoeren. Een gen ontologie verrijking analyses met behulp van DAVID software (https://david.ncifcrf.gov/) uit te voeren.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Vanaf perifere bloed mononucleaire cellen (PBMCs) verkregen door differentiële centrifugeren, het protocol toestaat het verkrijgen van een bevolking van CD14+ monocyten met een beoordeeld zuiverheid van meer dan 98% door stroom cytometry (Figuur 1). Deze monocyten zijn subsidiair gedifferentieerd naar verschillende polarisaties (Figuur 2). Wanneer een fractionering op gel wordt gekozen, de migratie op SDS-pagina gelen ...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Omdat proteomics een krachtig hulpmiddel om te bestuderen van de expressie van verschillende eiwitten uit een hele cel of subcellular compartimenten is, is optimalisatie van het protocol van de lysis van de cel en de vertering van eiwitten aangepakt door een aantal studies. Er zijn drie belangrijke klassen van methoden, waaronder in-gel spijsvertering (vertering van eiwitten in polyacrylamidegel matrix)17, spijsvertering in oplossing18 en filter-aided monster voorbereiding<...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs verklaren geen belangenconflicten.

Dankbetuigingen

AM wordt gefinancierd door de jonge groep Leader programma ATIP/Avenir Inserm-CNRS, door la Ligue Nationale contre le Cancer en la ARC van de Fondation pour la recherche sur le Cancer. Wij danken Mariette Matondo van de Spectrometrie van de massa voor biologie-platform (UTECHS MSBIO, Pasteur Instituut, Parijs). Wij danken Lauren Anderson voor haar lezing van het manuscript.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Hypoxia Working StationOxford OptronixHypoxylab
C6 Flow cytometerBDAccuri C6
UreaAgilent Technologies5188-6435
Formic acid (FA)ARISTAR450122M
R-250 Coomassie blueBiorad1.610.436
Lipopolysaccharide, E.Coli (LPS)Calbiochem437627
2D clean-up kitGE Healthcare80-6484-51
RPMI 1640 medium, glutamax supplementGibco61870044
HEPES 1 MGibco15630-080
MEM Non-Essential Amino Acids (NEAA) Solution 100XGibco11140-035
Phosphate Buffered Saline (PBS) 1XGibco14190-094
Harvard Apparatus column Reverse C18 micro spin columnHarvard Apparatus74-4601
EDTA 0.5 M, pH 8.0InvitrogenAM9260G
NuPAGE Bis-Tris 4-12%Life Technologies SASNP0321 BOX
CD14 Microbeads humanMiltenyi Biotec130-050-201
MACS separation column LSMiltenyi Biotec130-042-401
Macrophage colony-stimulating factor (M-CSF)Miltenyi Biotec130-096-485
Interleukin 4 (IL4)Miltenyi Biotec130-093-917
Interleukin 13 (IL13)Miltenyi Biotec130-112-410
Interferon gamma (INFγ)Miltenyi Biotec130-096-482
CD14-FITC (clone TÜK4)Miltenyi Biotec130-080-701
MACSmix Tube RotatorMiltenyi Biotec130-090-753
Trifluoroacetic Acid (TFA)Pierce28904
Trypsin/Lys-C MixPROMEGAV5073
Complete Mini, EDTA-free Protease Inhibitor cocktailRoche11836170001
Density Gradient Solution (Histopaque 1077)Sigma Aldrich10771-100ML
AccumaxSigma AldrichA7089-100ML
Human Serum from human male AB plasma (SAB)Sigma AldrichH4522-100ML
Bovine Serum Albumin (BSA) solution 30%Sigma AldrichA9576-50ML
Trisma-baseSigma AldrichT1503
GlycerolSigma Aldrich49767
β-MercaptoethanolSigma AldrichM3148
Bromophenol blueSigma Aldrich114405
Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) 20%Sigma Aldrich5030
Ammonium bicarbonateSigma Aldrich9830
AcetonitrileSigma Aldrich34888
DithiothreitolSigma Aldrich43819
IodoacetamideSigma Aldrich57670
ThioureaSigma AldrichT8656
CHAPSSigma AldrichC9426
Micro BCA Assay KitThermoFisher23235
5 mL sterile plastic pipetteVWR612-1685
Thermomixer C EppendorfVWR460-0223
Sep-Pak tC18 reverse phase cartridges, 100 mgWatersWAT036820

Referenties

  1. Okabe, Y., Medzhitov, R. Tissue biology perspective on macrophages. Nature Immunology. 17 (1), 9-17 (2016).
  2. Sica, A., Mantovani, A. Macrophage plasticity and polarization: in vivo veritas. The Journal of Clinical Investigation. 122 (3), 787-795 (2012).
  3. Murray, P. J. Macrophage Polarization. Annual Review of Physiology. 79, 541-566 (2017).
  4. Chinetti-Gbaguidi, G., Staels, B. Macrophage polarization in metabolic disorders: functions and regulation. Current Opinion in Lipidology. 22 (5), 365-372 (2011).
  5. Chow, A., Brown, B. D., Merad, M. Studying the mononuclear phagocyte system in the molecular age. Nature Reviews Immunology. 11 (11), 788-798 (2011).
  6. Mosser, D. M., Edwards, J. P. Exploring the full spectrum of macrophage activation. Nature Reviews Immunology. 8 (12), 958-969 (2008).
  7. Murray, P. J., Wynn, T. A. Protective and pathogenic functions of macrophage subsets. Nature Reviews Immunology. 11 (11), 723-737 (2011).
  8. Ginhoux, F., Schultze, J. L., Murray, P. J., Ochando, J., Biswas, S. K. New insights into the multidimensional concept of macrophage ontogeny, activation and function. Nature Immunology. 17 (1), 34-40 (2016).
  9. Xue, J., et al. Transcriptome-based network analysis reveals a spectrum model of human macrophage activation. Immunity. 40 (2), 274-288 (2014).
  10. Csete, M. Oxygen in the cultivation of stem cells. Annals of the New York Academy of Sciences. 1049, 1-8 (2005).
  11. Johansson, A., et al. Functional, morphological, and phenotypical differences between rat alveolar and interstitial macrophages. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 16 (5), 582-588 (1997).
  12. Pfau, J. C., Schneider, J. C., Archer, A. J., Sentissi, J., Leyva, F. J., Cramton, J. Environmental oxygen tension affects phenotype in cultured bone marrow-derived macrophages. American Journal of Physiology. Lung Cellular and Molecular Physiology. 286 (2), L354-L362 (2004).
  13. Grodzki, A. C. G., Giulivi, C., Lein, P. J. Oxygen tension modulates differentiation and primary macrophage functions in the human monocytic THP-1 cell line. PLoS One. 8 (1), e54926(2013).
  14. Court, M., Petre, G., Atifi, M. E., Millet, A. Proteomic Signature Reveals Modulation of Human Macrophage Polarization and Functions Under Differing Environmental Oxygen Conditions. Molecular & Cellular Proteomics. 16 (12), 2153-2168 (2017).
  15. Cox, J., et al. Accurate proteome-wide label-free quantification by delayed normalization and maximal peptide ratio extraction, termed MaxLFQ. Molecular & Cellular Proteomics. 13 (9), 2513-2526 (2014).
  16. Cox, J., Neuhauser, N., Michalski, A., Scheltema, R. A., Olsen, J. V., Mann, M. Andromeda: a peptide search engine integrated into the MaxQuant environment. Journal of Proteome Research. 10 (4), 1794-1805 (2011).
  17. Shevchenko, A., Tomas, H., Havlis, J., Olsen, J. V., Mann, M. In-gel digestion for mass spectrometric characterization of proteins and proteomes. Nature Protocols. 1 (6), 2856-2860 (2006).
  18. Court, M., et al. Toward a standardized urine proteome analysis methodology. Proteomics. 11 (6), 1160-1171 (2011).
  19. Wiśniewski, J. R., Zougman, A., Nagaraj, N., Mann, M. Universal sample preparation method for proteome analysis. Nature Methods. 6 (5), 359-362 (2009).
  20. Liebler, D. C., Ham, A. -J. L. Spin filter-based sample preparation for shotgun proteomics. Nature Methods. 6 (11), 785-786 (2009).
  21. Hubner, N. C., Ren, S., Mann, M. Peptide separation with immobilized pI strips is an attractive alternative to in-gel protein digestion for proteome analysis. Proteomics. 8 (23-24), 4862-4872 (2008).
  22. Park, J., et al. Informed-Proteomics: open-source software package for top-down proteomics. Nature Methods. 14 (9), 909-914 (2017).
  23. Richter, A., Sanford, K. K., Evans, V. J. Influence of oxygen and culture media on plating efficiency of some mammalian tissue cells. Journal of the National Cancer Institute. 49 (6), 1705-1712 (1972).
  24. Packer, L., Fuehr, K. Low oxygen concentration extends the lifespan of cultured human diploid cells. Nature. 267 (5610), 423-425 (1977).
  25. Lengner, C. J., et al. Derivation of pre-X inactivation human embryonic stem cells under physiological oxygen concentrations. Cell. 141 (5), 872-883 (2010).
  26. Sidoli, S., Kulej, K., Garcia, B. A. Why proteomics is not the new genomics and the future of mass spectrometry in cell biology. Journal of Cell Biology. 216 (1), 21-24 (2017).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Labelvrije kwantificeringIn gel fractioneringLys C trypsine verteringIn solution verteringIsoelektrische focuseringHypoxische conditieCD14 monocytenisolatieFlowcytometrie

Gerelateerde artikelen