Hier presenteren we een methode voor het leveren van Virale expressievectoren in de hersenen met behulp van zijde fibroin films. Met deze methode kunt gerichte levering van expressievectoren met zijde/AAV gecoate optische vezels, taps toelopende optische vezels en craniale windows.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
In Vivo Gerichte expressie van Optogenetic eiwitten met behulp van Silk/AAV Films
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
De zoektocht om te begrijpen hoe neurale circuits Procesinformatie in volgorde naar station gedrags-uitvoer sterk door de onlangs ontwikkelde optische methoden geholpen heeft voor het manipuleren van en toezicht op de activiteit van neuronen in vivo. Dit soort experimenten is afhankelijk van twee hoofdcomponenten: 1) de implanteerbare hulpmiddelen die optische toegang bieden tot de hersenen, en 2) lichtgevoelige eiwitten die wijzigen van neuronale prikkelbaarheid of leveren een uitlezing van neuronale activiteit. Er zijn een aantal manieren uitspreken lichtgevoelige eiwitten, maar stereotaxic injectie van virale vectoren is momenteel de meest flexibele benadering omdat expressie kan worden gecontroleerd met genetische, anatomische en temporele precisie. Ondanks het grote nut van virale vectoren, het leveren van het virus naar de site van optische implantaten poses tal van uitdagingen. Stereotaxic virus injecties eisen chirurgie, die chirurgische tijd verhogen, verhogen de kosten van studies, en een risico voor de gezondheid van het dier. Het omliggende weefsel kan fysiek worden beschadigd door de injectiespuit en immunogene ontsteking veroorzaakt door de abrupte levering van een bolus van hoge-titer virus. Uitlijnen van injecties met optische implantaten is vooral moeilijk wanneer de doelcomputer kleine regio's diep in de hersenen. Om deze uitdagingen te overwinnen, beschrijven we een methode voor het aanbrengen van meerdere soorten optische implantaten met films samengesteld van zijde fibroin en Adeno-geassocieerde virale (AAV) vectoren. Fibroin, een polymeer dat is afgeleid van de cocon van Bombyx mori, kunt samenvatten en beschermen van biomoleculen en in vormen variërend van oplosbare films tot keramiek kan worden verwerkt. Wanneer de hersenen ingeplant, laat zijde/AAV coatings virus op het raakvlak tussen optische elementen en de omringende hersenen, rijden expressie precies waar dat nodig is. Deze methode is eenvoudig toe te passen en belooft te sterk vergemakkelijken in vivo onderzoeken van neurale functie.
Inleiding
De afgelopen tien jaar heeft geproduceerd een explosie van gemanipuleerde lichtgevoelige eiwitten voor monitoring en manipuleren van neurale activiteit1. Virussen bieden ongeëvenaarde flexibiliteit voor het uitdrukken van deze hulpmiddelen van de optogenetic in de hersenen. Ten opzichte van transgene dieren, zijn virussen veel gemakkelijker te produceren, transporteren en opslaan, waardoor snelle implementatie van de nieuwste optogenetic hulpmiddelen. Expressie kan op verschillende neuronale populaties genetisch worden gericht, en virussen ontworpen voor de retrograde vervoer kunnen zelfs gebruikt worden om expressie gebaseerd op neuronal conne....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Alle experimenten met dieren werden verricht overeenkomstig de protocollen die zijn goedgekeurd door de Harvard Permanent Comité voor Animal Care volgende richtlijnen in de ons NIH- gids voor de verzorging en het gebruik van proefdieren beschreven. Volwassen C57BL/6 muizen van beide geslachten (6-15 weken oud) werden gebruikt voor alle experimenten.
1. Verkrijg waterige zijde Fibroin
- Bereiden of koop waterige zijde fibroin (5-7,5% w/v).
2. Meng waterige zijde met AAV expressievectoren
- Kies een AAV expressie vector om te rijden het optogenetic eiwit of fluorescerende indicator va....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Om te beoordelen van het succes van zijde/AAV films in expressie rijden, we geperfundeerd dieren 2-3 weken na implantatie en bereid hersenen segmenten uit de regio van belang. Fluorescentie beelden van optogenetic fluorophore-gelabelde proteïnen (ChR2-YFP) verstrekt een maatregel van de mate van expressie (Figuur 1 d). Typische optische vezels (230 µm diameter) kunnen gemakkelijk 200 nL van zijde/AAV. Met praktijk kunnen onderzoekers zeer betrouwbare expressi.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Het gebruik van zijde/AAV te richten op de expressie van optogentic eiwitten overwint beperkingen van benaderingen die momenteel in gebruik. Hoewel vele studies succesvol AAV injecties gebruiken uitspreken optogenetic eiwitten, is het uitdagend expressie naar het uiteinde van de optische vezels, regio's rond de lengte van taps toelopende vezels, en de regio bekijken van een grijns lens worden uitgelijnd. Vanwege de afwijking tussen optische componenten en optogenetic expressie, stereotaxic injecties kunnen onbetrouwbaar .......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben niets te onthullen.
Dankbetuigingen
De auteurs bedank J. Vazquez voor illustraties, D. Kaplan en C. Preda voor reagentia en behulpzame begeleiding, en de laboratoria van B. Sabatini en C. Harvey voor in vivo imaging. Microscopie werd mogelijk gemaakt door M. Ocana en de neurobiologie Imaging Center, gedeeltelijk ondersteund door de neurale Imaging Center als onderdeel van een National Institute of Neurological Disorders en Stroke (NINDS) P30 Core Center verlenen (NS072030). Dit werk werd gesteund door de GVR Khodadad Family foundation, de Nancy Lurie merken foundation, en NIH grants, NINDS R21NS093498, U01NS108177 en NINDS R35NS097284 te W.G.R, en door een NIH postdoctoral fellowship F32NS10188....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Aqueous silk fibroin | Sigma | 5154-20ML | Aqueous Silk Fibroin (5% w/v) voor het maken van films |
| Microinjector om silk/AAV af te zetten | Drummond | 3-000-207 | Nanoject III nanoliter injector |
| Manipulator om implantaten vast te houden | Narashige | MM-33 | Micromanipulator |
| Stereoscoop om silk afzettingen te visualiseren | AmScope | SM-6TX-FRL | 3.5X-45X Trinoculair articulerend zoommicroscoop met ringlicht |
| Vacuumkamer om implantaten op te slaan | Ablaze | N/A | 3.5 Quart Vacuum Vac Degassing Chamber |
| Optioneel, implantaathouder voor opslag | N/A | N/A | Om voorgemaakte optische vezels op te slaan, boor een raster van ~4 mm diepe gaten met een diameter net iets groter dan de ferrule diameter in een plastic blok. |
| Optische vezels | Thorlabs | FT200EMT | Ø200 µm Core Multimode Optische Vezel voor vezelimplantaten |
| Ferrules | Kientec | FZI-LC-230 | LC Zirconia Ferrule voor vezelimplantaten |
| Diverse materialen voor het vervaardigen van chronische vezelimplantaten | Diverse | N/A | Voor gedetailleerde procedure, zie Ung K, Arenkiel BR. Fiber-optic implantatie voor chronische optogenetische stimulatie van hersenweefsel. Journal of visualized experiments: JoVE. 2012(68). |
| Taperende vezelimplantaten | Optogenix | Lambda-B | Taperende vezelimplantaten |
| GRIN lenzen | GoFoton | CLH-100-WD002-002-SSI-GF3 | GRIN lenzen |
| Kleine glazen craniale vensters | Warner | 64-0726 (CS-3R-0) | Klein rond dekglas, #0 dikte |
| Grote glazen craniale vensters | Warner | 64-0731 (CS-5R-0) | Klein rond dekglas, #0 dikte |
| Diverse materialen voor het vervaardigen van craniale vensters | Diverse | N/A | Voor gedetailleerde procedure, zie Goldey GJ et al. Removable cranial windows for long-term imaging in awake mice. Nature protocols. 2014 Nov;9(11):2515. |
Referenties
- Klapoetke, N. C., et al. Independent optical excitation of distinct neural populations. Nature Methods. 11 (3), 338-346 (2014).
- Tervo, D. G., et al. A Designer AAV Variant Permits Efficient Retrograde Access to Projection Neurons. Neuron. 92....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
