Methodenartikel

Met behulp van verbeterde eiwit-uiting van groene fluorescentie Escherichia Coli te beoordelen muis peritoneale Macrophage fagocytose

7K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/58751

⸱

4 januari 2019

 ,  ,  ,  , 
1Anesthesiology Department, The Second Hospital of Dalian Medical University, 2Scientific Research Center, The Second Hospital of Dalian Medical University

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

Hier presenteren we een protocol om te beoordelen van muis peritoneale macrofaag fagocytose met behulp van verbeterde groene fluorescentie eiwit-uiting van Escherichia coli.

Samenvatting

Dit manuscript beschrijft een eenvoudige en reproduceerbare methode voor het uitvoeren van een fagocytose assay. Het eerste deel van deze methode gaat om het bouwen van een huisdier-SUMO-EGFP vector (SUMO = kleine ubiquitin-achtige modifier) en uiting geven aan verbeterde groene fluorescentie eiwit (EGFP) in Escherichia coli (BL21DE). Uitdrukken van EGFP E. coli is coincubated met macrofagen gedurende 1 uur bij 37 ° C; de negatieve controlegroep is ge¨ uncubeerd op ijs de dezelfde hoeveelheid tijd. De macrofagen zijn klaar voor beoordeling. De voordelen van deze techniek bevatten zijn eenvoudig en duidelijk stappen en fagocytose kan worden gemeten door beide stroom cytometer en fluorescentie Microscoop. De uiting van EGFP E. coli zijn stabiel en een sterke fluorescentie signaal weergeven, zelfs nadat de macrofagen worden bevestigd met paraformaldehyde. Deze methode is niet alleen geschikt voor de beoordeling van macrofaag cellijnen of primaire macrofagen in vitro maar ook geschikt voor de evaluatie van granulocyt en monocyt fagocytose in perifere bloed mononucleaire cellen. Uit de resultaten blijkt dat het fagocytische vermogen van peritoneale macrofagen van jonge (acht weken oude) muizen hoger dan die van macrofagen van leeftijd (16-maand-oude) muizen is. Kortom, deze methode meet macrofaag fagocytose en is geschikt voor de bestudering van het aangeboren immuunsysteem.

Inleiding

Macrophage fagocytose tests worden vaak gebruikt voor het bestuderen van het aangeboren immuunsysteem. De aangeboren immuunrespons kan duiden op gevoeligheid voor infectie. Macrophage cellijnen worden veel gebruikt in studies van de immunologie. Echter, de uitgebreide passage kan gene verlies en immuun functies in deze cellijnen in gevaar gebracht. De primaire peritoneale macrofagen zijn dus het ideale object in waarnaar u de cel functie1studie.

Hoewel de aangeboren immuunrespons gedacht intact in het jaar oud lichaam dat werd, kan de fagocytische vermogen afnemen in vergelijking met dat in de jongere lichaam2,3. Hier zullen we laten zien dat een methode voor de beoordeling van de fagocytose van peritoneale macrofagen van jonge (acht weken oude) en ouderen (16-maand-oude) muis met behulp van EGFP-uiten E. coli, die handig, snel en economisch haalbaar is is.

Het gebruik van een uiting van EGFP E. coli stam is een van de voordelen van deze test omdat deze bacteriën stabiel zijn en een sterke fluorescentie-signaal, zelfs nadat macrofagen worden opgelost door 4% (m/v) paraformaldehyde weergegeven. Bovendien, met behulp van de uiting van EGFP E. coli, onderzoekers hoeft niet verder kleuring na fagocytose, wat tijd bespaart. Bovendien zijn de macrofagen immunoresponsive voor E. coli oppervlakte-antigeen, meer geschikt voor de fagocytose assay dan het gebruik van het uiten van EGFP schimmels of fluoresceïne-geëtiketteerden kralen maken van E. coli .

Met uiten van EGFP E. coli, kan een fagocytose assay gemakkelijk worden bereikt in 2 h en gemeten door beide stroom cytometry en fluorescentie microscopie, afhankelijk van het doel van de onderzoeker. Aangezien deze methode direct de fagocytische mogelijkheid meet, zijn de resultaten meer reproduceerbare dan andere indirecte methoden.

Deze methode is ook gevalideerd in een cellijn van RAW264.7 en perifere bloed mononucleaire cellen4. Onderstaande tekst de gedetailleerde stapsgewijze instructies voor het uitvoeren van deze test en benadrukt de essentiële stappen die de onderzoekers wijzigen kunnen om te voldoen aan de behoeften van hun experimenten.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Alle procedures werden uitgevoerd onder de nationale instituten van gezondheid richtlijnen voor de zorg en het gebruik van proefdieren, en de protocollen werden goedgekeurd door de Animal Care en gebruik Comité van Dalian medische universiteit. Zestien-maand-oude (met een lichaamsgewicht van 30-35 g) en acht weken oude (20-25 g) SPF (specific pathogen-vrij) mannelijke C57BL/6 muizen werden verkregen van de SPF dierlijke centrum van Dalian Medizinische Universität. Alle muizen werden bewaard in de huisvesting van de dieren met toegang tot voedsel en water ad libitum. De temperatuur werd gehouden op 20-24 ° C, luchtvochtigheid was 40% - 70%, en verlichting was 12 licht/12 uur donker. Dieren mochten acclimatiseren aan het milieu voor ten minste 7 dagen voor het experiment.

1. bouw van het huisdier-SUMO-EGFP plasmide en inductie van de expressie van EGFP

  1. Synthetiseren van het fragment van de gene EGFP (een 717 bp reeks gesynthetiseerd door een aangepaste gene synthese dienst, Zie Tabel van materialen en aanvullende bestand 1 voor de reeks) en versterken van het fragment met de voorwaartse primer ( 5'-ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGC-3') en reverse primer (5'-CTTGTACAGCTCGTCCATGCCG-3 "), met behulp van HiFi-polymerase van DNA Taq.
  2. Om ervoor te zorgen dat de polymerase-kettingreactie (PCR) producten enkele 3' adenine overhangen hebben voor het klonen van TA in de volgende stap, gebruikt u de extensie van een 30 min bij 72 ° C na de laatste cyclus (Zie aanvullende bestand 1 voor PCR voorwaarden). Controleer het PCR-product door agarose gelelektroforese.
  3. Klonen van de PCR-product in de vector van het huisdier-SUMO (Zie Tabel van materialen) met behulp van de methode5 met T4 DNA ligase klonen TA. Incubeer de reactie bij kamertemperatuur (20-25 ° C) gedurende 30 minuten. De vector is gelineariseerde tussen nucleotiden 653 en 654 met een 1 bp 5 ' T-overstek op elk onderdeel.
  4. De afbinding product transformeren in de chemisch bevoegde BL21(DE) E. coli -stam als volgt: Voeg 5 µL (100 ng) van PCR product naar 100 µL BL21(DE) bevoegde cellen via warmte schok bij 42 ° C gedurende 90 s; Houd het mengsel op het ijs gedurende 3 minuten en voeg vervolgens 400 µL van lysogenie Bouillon (LB) medium voorverwarmd bij 37 ° C, gedurende 1 uur bij 37 ° C en 120 omw / schudden.
  5. Inoculeer 100 µL van de bacteriën op het oppervlak van een LB-kanamycine (100 µg/mL) plaat met de inductor lactose (0.5 mmol/L), opbrengst van de stam van de expressie EGFP. Incubeer de plaat bij 37 ° C's nachts.
    Opmerking: Indien de EGFP met succes wordt uitgedrukt, sommige kolonies kunnen worden waargenomen als gloeiende groen licht in het donker.
    1. Selecteer eventueel kolonies om te controleren of het ingevoegde fragment van EGFP door DNA sequentiebepaling. De inleidingen voor DNA rangschikkend zijn: forward, 5'-AGATTCTTGTACGACGGTATTAG-3'; omgekeerde, 5'-TAGTTATTGCTCAGCGGTGG-3'.
  6. Inoculeer een positieve kolonie in 5 mL LB medium met 100 µg/mL kanamycine. Incubeer in een 37 ° C incubator schudden bij 120 omw / m voor 2 h, en vervolgens de inductor lactose toevoegen om een eindconcentratie van 0.5 mmol/L en blijven schudden voor 6 h, inducerende expressie van EGFP. Empirisch, wanneer schudden voor 6 h, de optische dichtheid bij 600 nm (OD600) oplopen tot 0,7 of hoger.
  7. 10 µL van het bacteriële kweekmedium aan een dia toevoegen en bedek het met een dekglaasje aan de expressie van EGFP onder een omgekeerde fluorescentie Microscoop onderzoeken. De uiting van EGFP bacteriën kunnen worden opgeslagen in het medium bij 2-8 ° C voor enkele weken.

2. muis peritoneale macrofaag isolatie en primaire cultuur

  1. Voeg 3,5 g thioglycolaat aan 100 mL gedestilleerd water en autoclaaf dit mengsel aan de steriliteit vóór gebruik. Pomp het thioglycolaat medium in de 1 mL steriele injectiespuit in de kap voor de muis peritoneale injectie. Gebruik één muis per spuit te voorkomen infectie. Het gebruik van thioglycolaat kan het verhogen van het aantal macrofagen. De resident peritoneale macrofagen kunnen worden geïsoleerd zonder thioglycolaat, maar met een lagere macrofaag oplevert.
  2. Anesthetize de muis met een methode goedgekeurd door de lokale dierenverzorgers en gebruik Comité. 1 mL van 3,5% thioglycolaat medium injecteren met peritoneale holte van de muis met de spuit van 1 mL, met behulp van een naald 23 G.
    Opmerking: Door inducerende anesthesie, de peritoneale injectie kan gemakkelijk worden uitgevoerd en vermindert het risico van verwondingen aan de inwendige organen veroorzaakt door injectie.
  3. De muis met water en voedsel ad libitum gedurende 3 dagen. Toezicht op het lichaam gewicht en voedsel inname van het dier elke dag. Als het gewichtsverlies van het lichaam groter dan 10% binnen 3 dagen is, sluit u het dier uit het experiment.
  4. Na 3 dagen, door de muis te euthanaseren door cervicale dislocatie na snel inducerende verdoving door Sevofluraan in een gesloten doos. U kunt ook een methode gebruiken die is goedgekeurd door het lokale dierlijke zorg en gebruik Comité om de muis euthanaseren.
  5. Zet de muis in een schotel (met een diameter van 10 cm) met 75% ethanol te steriliseren, en het snel overbrengen in de kap. Plaats de muis op een plaat en pin van de voorste poot aan het bestuur van de muis positie vast te stellen.
  6. Met een 5 mL injectiespuit gekoppeld aan een 20 G injecteren naald, de naald schuine kant omhoog te plaatsen in een hoek van 30° - 40°, 5 mL koud (4-10 ° C)-fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) voor de onderbuik van de muis peritoneale Holte, het vermijden van de darm te prikken. Als de darm (of elk ander orgaan) is doorboord, kunnen de muis en de bijbehorende cellen niet langer worden gebruikt voor experimenten, zoals dit cellen die niet geschikt voor primaire celculturen zijn kan activeren.
  7. Het uitvoeren van een zachte massage aan beide zijden van de buik van de muis. Vervolgens gecombineerd de vloeistof voorzichtig en langzaam. Breng de peritoneale vloeistof in een centrifugebuis 50 mL. Herhaal deze stappen 2 x of 3 x.
  8. Centrifugeer de zwevende cellen gedurende 10 minuten bij 400 x g in een gekoelde centrifuge (4-8 ° C). Verwijder het supernatant en resuspendeer de pellet cel in RPMI 1640 medium met 10% foetale runderserum (FBS). Cellen tellen. De celdichtheid is empirisch, ongeveer gelijk aan 5 x 106 cellen/mL wanneer de cellen zijn geresuspendeerde 10 ml van medium.
  9. 5 x 106 cellen toevoegen in elk putje van de plaat van een 6-goed voor de stroom cytometry assay en 5 x 10,5 cellen per putje in een 24-well plaat voor een fluorescentie Microscoop. Cultuur de cellen bij 37 ° C in een broedstoof 5% CO2 's nachts. Het kweekmedium kan worden vernieuwd na 3 h nonadherent cellen verwijderen, omdat de meeste van deze zijn lymfocyten. De Adherente cellen zijn voornamelijk de macrofagen, en ze kunnen houden goed aan weefsel-cultuur-testgroep kunststof.

3. macrophage fagocytose assay met behulp van de fluorescentie Microscoop

  1. Observeer de cellen onder een heldere-veld Microscoop te beoordelen van de levensvatbaarheid van de cellen en de celdichtheid.
  2. Verwijder het kweekmedium uit de plaat 24-well. Voeg 100 µL cultuurmedium verse en 10 µL van bacteriële suspensie (ongeveer 2 x 107 cellen) in elk putje zoals beschreven in tabel 1. Incubeer gedurende 1 uur in een 37 ° C, 5% CO2 incubator.
  3. Voorzichtig wassen 3 x-5 x met koude PBS 500 µL per putje te wassen noninternalized bacteriën.
  4. Incubeer de cellen met 4% formaldehyde in PBS bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten.
  5. Wassen van de vaste cellen 3 x met PBS (500 µL per putje).
  6. Voeg toe 200 µL van phalloidin 633 fluorescentie kleurstof geconjugeerd werkoplossing (Zie Tabel van materialen) om de F-actine vlek. Winkel in een donkere, vochtige plaats (60% - 80%) bij kamertemperatuur gedurende 60 minuten spoel de cellen 3 x met PBS (500 µL per putje) te verwijderen van de overtollige phalloidin. Door kleuring van de F-actine, het cytoplasma kan worden beschreven en kunnen onderscheiden van de verinnerlijkte bacteriën.
  7. Voeg 200 µL van de DAPI (4', 6-diamidino-2-phenylindole) werkoplossing (1 µg/mL), de celkern vlek en incubeer gedurende 5 minuten in een donkere, vochtige plaats bij kamertemperatuur. Spoel 1 x met PBS (500 µL per putje) en 1 x met dezelfde hoeveelheid gedestilleerd water. Vervolgens zal de cellen klaar zijn voor observatie onder een omgekeerde fluorescentie Microscoop.

4. macrophage fagocytose assay met behulp van stroom cytometry

  1. De experimentele fouten te minimaliseren en maken van een juiste interpretatie van de resultaten, de groepen instellen en beheren van buizen voor het experiment, zoals vermeld in tabel 2.
    1. Voor de controlegroep, die zal worden gelegd op ijs (groep 4 in tabel 2), verwijder het medium van de 6-well-plaat en wassen het 1 x met PBS. Dan, voeg 1 mL koude EDTA 70 mM in het putje loskoppelen van de cellen en hen overbrengen naar de stroom cytometry buis. Voeg 50 µL van bacteriële suspensie in de buis en plaats deze op het ijs gedurende 1 uur.
    2. Voor de andere fracties, verwijdert u het kweekmedium. Voeg 1 mL verse voedingsbodem in elk putje. Voeg 50 µL van bacteriële suspensie in de putjes volgens de instelling van de groep, zoals beschreven in tabel 2. Dan de 6-well-plaat in de 37 ° C, 5% CO2 incubator voor 1 h te plaatsen.
  2. Om het doven van de fluorescentie van noninternalized E. coli, voeg 200 µL van 0,8% (CV) water Kristalvioletoplossing in de put en zwaaien kort, dus het vermijden van een vals-positieve resultaat door de uiting van EGFP E. coli binding aan het oppervlak van de macrofagen maar niet geïnternaliseerd. Wassen van de cellen 3 x met PBS te verwijderen van alle resterende CV.
  3. Dan, voeg 1 mL koude EDTA 70 mM in het putje loskoppelen van de cellen en hen overbrengen naar de stroom cytometry buis.
  4. Centrifugeer de buizen bij 400 x g gedurende 5 minuten en verwijder het supernatant.
  5. Voeg 100 µL van PBS te resuspendeer de cellen. Voeg 5 µL van F4/80-PE-geconjugeerd antilichaam (een oppervlakte-antigeen uitgedrukt op muis macrofagen) in de buizen, of gebruik IgG2a-PE isotype, volgens de instelling van de groep. Vortex kort en de monsters op ijs gedurende 5-10 min. in het donker uit te broeden.
  6. Voeg 1 mL PBS in elke buis en centrifugeer bij 400 x g gedurende 5 min. Verwijder het supernatant. Resuspendeer de cel pellets met 200-300 µL van PBS voor stroom cytometry analyse. Elke buis uitgevoerd en het verwerven van gegevens voor ten minste 10.000 gebeurtenissen van F4/80+ cellen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

De vector van het huisdier-SUMO maakt gebruik van een kleine ubiquitin-achtige modifier zodat de uitdrukking van inheemse proteïnen in de E. coli. SUMO fusion kan aanzienlijk vergroten de EGFP oplosbaarheid, waardoor ze gemakkelijk worden gedetecteerd. Als de expressie van EGFP met succes door lactose veroorzaakt wordt, kunnen groene kolonies worden waargenomen in het donker (figuur 1A). Groene stippen, die de uiting van EGFP E. coli vertegenwoor...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

De stappen in dit protocol zijn vrij eenvoudig en duidelijk. Een van de kritische stappen is voor het opwekken van de expressie van EGFP op E. coli. Meestal, wanneer een gen van eukaryoten, zoals EGFP, is gepland om uit te drukken in prokaryoten zoals E. coli, is er een risico dat het eiwit zal vormen inactief aggregaten (opneming lichamen), waardoor de oorspronkelijke structuur en de activiteit van het eiwit is gewijzigd. Met behulp van het huisdier-SUMO vector en bouw van het huisdier-SUMO-EGFP plasmi...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

Dit werk wordt ondersteund door de National Natural Science Foundation of China (nr. 31800046) en de Natural Science Foundation van Liaoning Province (nr. 20170540262). Dit werk werd gerealiseerd in de laboratoria van het Scientific Research Center aan de tweede ziekenhuis van Dalian medische universiteit. De auteurs bedank Xiao-Lin Sang voor haar hulp bij de stroom cytometry, en Bo Qu en Dong-Chuan Yang voor hun hulp bij het opstellen van de video.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
BD FACSCanto II Flow cytometerBD Biosciences-
Biotin anti-mouse CD16/32 AntibodyBiolegendCat101303
Champion pET SUMO Protein Expression systemInvitrogenK300-01
Custom Gene Synthesis ServiceTakara Biotech.-
DAPI(4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride)ThermoFisherD1306
F4/80-PE anti-mouse antibody for FACSBiolegendCat123110
Leica DMI3000 B  Inverted MicroscopeLeica Microsystems-
PE Rat IgG2a, κ-isotype controlBiolegendCat400507
Phalloidin 633 fluorescence dye conjugated working solutionAAT BioquestCat23125
Thioglycollate mediumSigma-AldrichT9032

Referenties

  1. Layoun, A., Samba, M., Santos, M. M. Isolation of murine peritoneal macrophages to carry out gene expression analysis upon Toll-like receptors stimulation. Journal of Visualized Experiments. 98, e52749(2015).
  2. Iskander, K. N., et al. Sepsis: multiple abnormalities, heterogeneous responses, and evolving understanding. Physiological Reviews. 93 (3), 1247-1288 (2013).
  3. Girard, T. D., Opal, S. M., Ely, E. W. Insights into severe sepsis in older patients: from epidemiology to evidence-based management. Clinical Infectious Diseases. 40 (5), 719-727 (2005).
  4. Bicker, H., et al. A simple assay to measure phagocytosis of live bacteria. Clinical Chemistry. 54 (5), 911-915 (2008).
  5. Zhou, M. Y., Gomez-Sanchez, C. E. Universal TA cloning. Current Issues in Molecular Biology. 2 (1), 1-7 (2000).
  6. Chen, Q., et al. Triggering receptor expressed on myeloid cells-2 protects against polymicrobial sepsis by enhancing bacterial clearance. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 188 (2), 201-212 (2013).
  7. Lamberti, G., de Araujo, M. E., Huber, L. A. Isolation of Macrophage Early and Late Endosomes by Latex Bead Internalization and Density Gradient Centrifugation. Cold Spring Harbor Protocols. (12), (2015).
  8. Miksa, M., Komura, H., Wu, R., Shah, K. G., Wang, P. A novel method to determine the engulfment of apoptotic cells by macrophages using pHrodo succinimidyl ester. Journal of Immunological Methods. 342 (1-2), 71-77 (2009).
  9. Weingart, C. L., et al. Fluorescent labels influence phagocytosis of Bordetella pertussis by human neutrophils. Infection and Immunity. 67 (8), 4264-4267 (1999).
  10. Neaga, A., Lefor, J., Lich, K. E., Liparoto, S. F., Xiao, Y. Q. Development and validation of a flow cytometric method to evaluate phagocytosis of pHrodo BioParticles(R) by granulocytes in multiple species. Journal of Immunological Methods. 390 (1-2), 9-17 (2013).
  11. Ninkovic, J., Roy, S. High throughput fluorometric technique for assessment of macrophage phagocytosis and actin polymerization. Journal of Visualized Experiments. (93), e52195(2014).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

EGFP expresserende Escherichia coliflowcytometrie analysefluorescentiemicroscopieisolatie van peritoneale macrofagenthioglycollaatinductieco incubatie van EGFP bacteri nkristalviolet quenchingF4 80 antilichaamkleuringaangeboren immuunfunctie

Gerelateerde artikelen